不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的rdna its序列解析

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1、不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的rDNAITS序列解析当归为常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品。为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效。目前主要分布在甘肃、云南、四川、湖北、陕西等地。当归的野生资源由于过度采挖已经濒临枯竭。笔者通过当归的种质资源调查，发现当归有紫茎和绿茎之分。另外，四川等地栽种有东当归Angelicaacutiloba(Sieb.etZucc.)Kitagae;-GTCGAATTCGTAGGTGAACCTGCG-GAAGGATCA-

2、3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反应液(以20μL/L反应体积为例)：10PCRbuffer2μL，10mmolL-1dNTP0.5μL，Mg2+(25mmolL-1)2.4μL，引物LH2和ITS4(10μmolL-1)各1μL，Taq酶(5UμL-1)0.1μL，DNA模板(适宜浓度)2μL，灭菌三蒸水(3dH2O)10μL。PCR扩增条件为94℃变性4min，94℃1min，50℃2min，72℃1min，循环

3、30次;72℃延伸10min，以灭菌三蒸水代替模板DNA作空白对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。用QIAGENPCR产物纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。　　1.4PCR产物ITS序列的测定　　纯化后的PCR产物作为测序反应的模板，PCR反应的引物直接作为测序引物，采用双脱氧终止法终端荧光标记，进行DNA序列的正向和反向测定。测序反应在ABI377测序仪上进行。所得序列用CLUSTALX(Version1.8)进行多重比对，编辑和校正多重比对结果用BioEdit;ITS1和ITS2的位置参照其二级结构和EMBL和Gen-Bank上的参考序列

4、。　　2结果　　根据GenBank中的当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的ITS序列(Genebank：GU289663.1)确定当归和东当归、牡丹叶当归的rDNA内转录间隔区ITS1和ITS2与3个编码区18S、5.8S、26S的界限。测得当归14个个体的ITS-1，5.8SrDNA和ITS-2全序列及18SrRNA基因3′端和26SrRNA基因5′端部分碱基序列，共约664bp。其中ITS1序列长度215bp，5.8S长162bp，ITS2序列长度为223bp。习用品东当归长663bp，其中IT

5、S1序列长度216bp，5.8S长162bp，ITS2序列长度为221bp。习用品牡丹叶当归长664bp，其中ITS1序列长度215bp，5.8S长162bp，ITS2序列长度为223bp。当归ITS1的G+C%含量在54.42%，ITS2的G+C%含量在55.16%。ITS序列测序结果表明，14个不同种质的当归其ITS序列都全部一致，包括两种表型即紫茎当归和绿茎当归、野生当归和栽培当归。　　将当归、东当归和牡丹叶当归ITS序列比对，计算其遗传距离。当归与东当归的遗传距离为8.6，与牡丹叶当归的遗传距离为9.6，而东当归与牡丹叶当归的遗传距离为10

6、.7。　　3讨论　　当归的植物表型可以分为紫茎当归和绿茎当归，其中绿茎当归其茎秆、叶、叶鞘等均为绿色，明显区别于紫茎当归，但是从ITS序列结果来看，绿茎当归和紫茎当归ITS序列并无区别，栽培和野生的ITS序列也完全相同。尽管有很多报道发现ITS序列存在种内多态性，即不同亚种、居群的同一位点有2或2个以上的核苷酸类型[5-6]。但还是有国外很多报道指出有些物种ITS位点内(intralocus)、位点间(interlocus)的同步进化，导致没有位点多态性[7-8]。国内有人研究发现胀果甘草和黄甘草、光果甘草和蜜腺甘草的ITS序列完全相同。不同种质和

7、表型的当归其ITS序列没有变异，可能与其ITS位点内和位点间的同步进化有关。不同种质和表型的当归有非常相近的遗传背景，它们之间的形态学差异可能是长期栽培过程中自然进化和人工选择的双重因素造成的结果。　　当归与习用品东当归和牡丹叶当归的遗传距离表明，当归与东当归有更相近的遗传基础，而这两者在化学成分上也有很多相同或相近的成分，如均含挥发油、藁本内酯、多糖等成分。目前对牡丹叶当归的化学成分研究较少，建议对其进一步研究，明确其药用成分和药效，为其开发利用奠定基础。ITS序列作为分子标记构建系统树和分析亲缘关系不具普遍适用性。用ITS序列来对不同种质和表型

8、的当归进行遗传多样性分析并不适宜。但高度保守的ITS用来鉴定当归的真伪是非常合适的，当归与习用品东当归和牡丹叶当归可以用I