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1、甘肃不同产地当归ITS序列分析论文.freelolecularsystematicsofAngelicafromdifferentareasofGansuprovincesoastooffermolecularbasisofidentificationGansu-producedAngelica.MethodsTheITSgeneofAngelicaongdifferentspecimens.ResultsTheITSsequenceofAngelicabetenshavesamebasesat586siteen,ensare“T”an
2、d“G”respectively.ConclusionTheITSsequencecharacteristicscanberecognizedaseffectivemolecularmarkerofAngelica,andboth586sitebaseand589sitebaseoftheITSsequenceofAngelicacanberecognizedasidentificationbasesofMinCounty-producedAngelica.Key；Gansu当归为伞形科多年生草本植物当归Angelicasinensi(
3、Oliv.)Diels的干燥根。我国当归主产于甘肃东南部,以岷县产量多、质量好,其次为云南、四川、陕西、湖北等省,均为栽培。甘肃产的当归,个大质优,称“秦归”或“西归”,销往全国并大量出口。药材道地性研究已经成为中医药科研的重要课题,但由于道地药材与非道地药材在形态和生药上基本一致,所以传统方法亦不能满足道地药材的现代研究。道地药材是一个地域性现象,其产生除了与栽培方法、生态环境、加工方法有关外,还与物种居群的遗传特异性有关。在植物系统与进化研究中,核酸分子量是最基本的进化单位,能反映进化本质；核酸的基本序列是一元变化的,通常为点突破,
4、趋同效应极小,以核酸分子为指标确定的系统化关系不受主观因素影响。所以,近些年分子鉴定技术在中药研究中不断应用,此方法也已成为中药材道地性研究的重要手段。ITS序列作为种以下分子鉴定的重要序列,其在中药道地性研究中也得到了广泛研究。1材料与方法1.1药材来源本试验所用药材均为2005年采自甘肃省岷县及漳县地区农民种植的当归种子,自然干燥后备用,经甘肃中医学院张西玲教授鉴定。见表1。表1甘肃不同产地当归药材（略）1.2ITS序列扩增以已经发表于genebank中的当归ITS序列为标准,设计一对引物,引物序列为：ITS正,5’-TTGTCGA
5、ATCCTGCAATAGC；ITS反,5’-TCGAAGCGCACAGAGTATG(引物由上海生物工程技术服务有限公司合成)。PCR反应采用上海生物工程技术服务有限公司提供的即用型PCR扩增试剂盒,反应体系为50μL,其中2×Master25μL,上下游引物各5μL,模板1L,ddH2O,14μL。PCR扩增条件：94℃预变性1min,94℃变性1min；53℃复性1min；72℃延伸1min；共35循环,72℃延伸10min,4℃保存。1.3基因组DNA提取称取种子100mg用医用纱布包好,置于液氮中10min,取出后用研钵研细,用筛
6、网过滤后称取细粉50mg,然后按照上海生物工程技术服务有限公司生产的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取,提取的基因组DNA于-20℃保存,备用。1.4序列测定和分析PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物工程技术服务有限公司测序,每个样品均采用双向测序。测序结果以已经发表于genebank中的当归ITS序列确定ITS序列的边界,并进行两端碱基手工修订。各序列特征采用DNAStar软件进行统计分析；DNA序列的用DNAMAN软件排序,排序后的序列采用MEGA41(molecularevolutionarygeicsanal
7、ysis4)分子进化遗传分析软件,根据Kimura-2参数遗传距离(kimura-2parametergeicdistance)法计算各样品间的遗传距离值。2结果与分析2.1ITS长度与GC质量分数比较本实验测得的9样品ITS(包括5.8s)序列中7样品为600bp,2样品为601bp。所有样品5.8srDNA高度一致,无碱基差异。ITS一区有3个变异位点,ITS二区有3个变异位点。各样品ITS序列(包括5.8s)G＋C含量范围在54.1%～54.6%之间。2.2基于ITS分析各样品间的遗传距离(见表2)表2各样品间的遗传距离（略）3讨
8、论道地药材的形成是特定的基因型,在特定的生境下受到复杂的调控,导致次生代谢过程的关键酶基因的表达产生了时空差异的结果,其形态及次生代谢产物的多样性是由基因的遗传变异引起的2。不少学者在研究道地药材分子机理时
