纳他霉素产生菌基因组重排育种

《纳他霉素产生菌基因组重排育种》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、纳他霉素产生菌基因组重排育种【摘要】StreptomycesgilvosporeusSG1原生质体经紫外线诱变并筛选链霉素抗性菌株，获得纳他霉素高产菌株。在上述高产突变株中选择4株作为亲本进行基因组重排育种，筛选得到了高产重排菌株，其中一株重排菌株S.gilvosporeusGS74的纳他霉素产量为3574mg/L，为产量最高的亲本菌株的153%，比原始出发菌株SG1提高1.17倍。【关键词】纳他霉素褐黄孢链霉菌基因组重排NatamycinproducingstrainbreedingbygenomeshufflingABSTRACTAfterisolatingtheprotopla

2、stsofStreptomycesgilvosporeusSG1,theyutatedycinresistancemutantsycinproducingstrainsongthem,4strainsycinproductioneshuffling.ConsequentlyahighnatamycinyEildingstrain,S.gilvosporeusGS74,ycinproductiionreached3574mg/Lthatesthanthatofthestartingstrain.KEYIC确定S.gilvosporeusSG1原生质体悬浮液经稀释后分别涂布于含有不同浓度链

3、霉素的再生培养基平板上，28℃培养8～10d。观察不同平板上的菌落生长情况，记录未长菌落的链霉素最低作用浓度，即确定为链霉素对该菌的最小抑制浓度(MIC)。1.7原生质体融合将链霉素抗性菌株制备成原生质体悬液，各取1ml置离心管中，2000r/min离心5min，去上清，加入40%的PEG60005ml，振荡以悬浮原生质体，25℃保温5min后除去PEG，再用P液稀释涂布于再生培养基上，28℃培养8～10d［9］。1.8分析方法1.8.1菌体干重(DCl发酵液，6000r/min离心10min，收集沉淀，用无菌水清洗两次后，在100℃烘箱中干燥至恒重，称量并计算菌体干重。1.8.2还原糖的测

4、定采用3，5二硝基水杨酸法(DNS法)［10］。1.8.3氨基氮的测定氨基氮测定采用甲醛法［11］。1.8.4纳他霉素产量的测定采用HPLC外标法检测［12］。色谱工作条件为色谱柱：HypersilBDSC18(416mm×200mm，5μm)；流动相：甲醇∶水∶冰乙酸(60∶40∶5，体积比)；流速1.0ml/min；波长302nm；进样量20μl；灵敏度0102AUFs；柱温为室温。2结果2.1紫外线诱变时间的确定紫外线致死曲线见Fig.1。由于现在紫外诱变育种一般都采用较低剂量，以获得较高的正突变率。根据紫外线致死曲线，采用80%的致死率所对应的诱变剂量，即用功率为15的条件下，用紫外

5、线照射40s。2.2链霉素抗性菌株的选育链霉素对出发菌株S.gilvosporeusSG1的最小原生质体抑制浓度为0.4μg/ml。将经过紫外线诱变的S.gilvosporeusSG1原生质体溶液分别涂布于含有0.4μg/ml链霉素的再生平板上筛选链霉素抗性菌株，共分离了132株链霉素抗性菌株，通过摇瓶发酵分别测定纳他霉素的产量。其中有15株纳他霉素产量高于出发菌株，结果见Tab.1。从Tab.1可以看出，经紫外线诱变后筛选链霉素抗性菌株正突变率达到11%左右，其中Strr89达到了2468mg/L，为出发菌株SG1的142%。对这15株抗性菌株进行两次复筛，选出4株纳他霉素产量较为

6、稳定的突变菌株Strr69(2364mg/L)、Strr89(2468mg/L)、Strr111(2433mg/L)、Strr129(2398mg/L)。2.3基因组重排选育高产菌株将4株链霉素抗性菌株(Strr69、Strr89、Strr111、Strr129)作为亲本，制备原生质体，进行多亲本原生质体融合，并在再生平板上培养，培养后在再生平板上长出再生菌落(该再生菌落包括融合体和亲本)。将这些再生菌落混合制备原生质体，并进行原生质体融合后培养到再生平板上，从再生平板上共分离了87株再生菌株，通过摇瓶发酵，筛选出14株正突变菌株，结果见Tab.2。从Tab.2中可以看出，通

7、过基因组重排育种有16%的重排菌株为产量提高的菌株，其中菌株GS74纳他霉素产量达到3774mg/L，比产量最高的亲本菌株Strr89提高了52.9%，较原始菌株SG1提高了1.17倍。用群体传代的方法考察高产重排菌株GS74的斜面传代稳定性，反复传代5代，纳他霉素产量依次为3774、3743、3702、3814和3753mg/L，稳定在3700～3800mg/L之间，表明该重排菌株的高产性状遗传特性