纳他霉素高产菌株空间育种、工艺优化及工业放大研究

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1、浙江大学博士学位论文摘要本文对发酵法生产纳他霉素的全过程进行了系统深入的研究和开发。以褐黄孢链霉菌(&即fD朋yc酷gf～D印D删s)ATccl3326为出发菌株，对该菌株进行航天搭载等诱变育种获得了高产菌株，通过对培养基组成和发酵工艺的优化，进一步人幅度提高了纳他霉素的产量，在控制溶氧水平的原则指导下，成功地将发酵罐规模从实验室放大剑18m3，根据对纳他霉素的稳定性及溶解性的研究结果，提出了绿色环保、收率高的非溶媒提取工艺。本文的主要研究成果包括：(1)建立了发酵液中纳他霉素含量快速测定的双波长紫外分光度法。该方法具有操作简便、准确快

2、捷的特点，可以用于人批量样品的快速分析，为菌种高通量筛选与发酵工艺的研究提供了可靠的快速分析方法。(2)以褐黄孢链霉菌(&印幻彬yc酷∥，vD妒D陀“s)ATccl3326为出发菌株，经过紫外线、紫外线复合氯化锂、空间搭载育种及2一脱氧葡萄糖耐受菌株推理选育等步骤，得到了一株解除了葡萄糖代谢产物阻遏的菌株LK04—119。该菌株在以葡萄糖为唯一碳源的情况下，纳他霉素的生产能力不受葡萄糖效应的影响，摇瓶发酵单位达到了1920m∥l，比出发菌株ATCCl3326的发酵单位318mg／l提高了5倍以上。(3)通过试验确定了纳他霉素斜面培养温度

3、、种子培养温度、种子培养时间和接种量；确定了纳他霉素发酵培养的最适温度、发酵培养基的初始pH值、摇瓶发酵周期。进一步采用止交没计及旋转纲合设计进行了纳他霉素种f及发酵配方的优化。通过摇瓶试验分别确定了纳他霉素的斜面培养基、种子培养基及发酵培养基配方。纳他霉素摇瓶发酵单位最高达到了5054m鲋，比发酵起始培养基发酵单位1975m酣提高了1．56倍。(4)考察了2碳至4碳单位的盐类、酸类、醇类、酯类等前体性物质对纳他霉素生物合成的影响。结果表明盐类及酸类前体体物质抑制纳他霉素合成，醇类及酯类前体性物质则促进纳他霉素合成。丙酸钠对纳他霉素合成

4、的抑制作用最强，而正丙醇则对纳他霉素发酵的促进作用最好。氨基酸对纳他霉素的生长合成也有一定影响，其中，O．5鲋的L一缬氨酸可以提高纳他霉素产量达到27．O％；而加入29／l的天冬氨酸将使纳他霉素产量减少51．5％。(5)在30l发酵罐中进行了高产菌株LK04—196分批发酵生产纳他霉素的试验，确定了晟优控制条件，使纳他霉素发酵单位平均达到了3784m∥1，最高达到了3902m鲫。通过对分批发酵过程典型代访}过程的分析，确定了流加补糖策略：控制纳他霉素发酵过程中的糖浓度在359／l以上，补料时间24小时，可以延长发酵周期至120小时，纳他

5、霉素发酵单位可提高34．6％，达至0了5094mg／l。(6)以纳他霉素30l发酵罐控制工艺为基础，通过调整通气量及搅拌速度，控制发酵过程中的溶氧水平，成功地实现了纳他霉素分批发酵规模的放大，在1m3、4m3及18m3发酵罐中纳他霉素产量分别达到了4．26鲋、4．05鲋及3．83鲥。建立了支持向量机模型，该模型通过对发酵过程的学习，可以较好地模拟并预测工业放大过程中各级发酵规模的代谢过墨口．，I一1o～3磐础丘薪r+10占书n‘￡}面錾产^妇{t￡^雹毒：虹—l喜：4．不117cn1一九f．1n1磐薷塾描SrVl止笪爿亡^，『摘要究的基

6、础上提出一条绿色环保、操作简单、成本较低的非溶媒提取I：艺。采用该．J：艺制备了高纯度纳他霉素样品。对纳他霉素产品进行了全面的结构鉴定，证明产品结构与文献报道的纳他霉素化学结构完全一致。本论文的创新之处在于：建立了发酵液中纳他霉素双波长分光度分析方法；利用空间搭载育种结合推理选育技术，筛选得到了一株完全解除葡萄糖阻遏的菌株：采用控制发酵过程溶氧水平的方法，成功地实现了纳他霉素发酵的，L：业放大；以纳他霉素在发酵液及水溶液中的稳定性及溶解性研究为基础，提出了纳他霉素绿色、环保、={}二溶媒提取工艺。在以上研究工作的基础上，在山东鲁抗医药股

7、份有限公司成功地实现了纳他霉素工业化生产。关键词：纳他霉素、褐黄孢链霉菌、空间育种、发酵、支持向量机、溶解度、稳定性、提取、下业放大符号说明PX；tY8、8t，8{，8§qP“xKLaDO。riDONQReM蒯dP洲Pg～磁p肛V孢子存活率(％)氮源浓度实际值(鲫)氮源浓度无因次数值r纳他霉素浓度(m酣)回归方程的截距响应面回归系数比产物形成速率(g昏lh。)比生长速度(h。)菌丝体浓度(91-1)体积氧传递系数ofl)临界溶氧浓度惭)溶氧浓度(％)搅拌转速(巾m)通气蹙(m3／h)搅拌雷诺数搅拌叶周线速度(州s)无通气情况下单位体积有

8、效输入功率(w／m3)有通气情况下单位体积输入功率(w／m3)以氧的分压差为推动力的体积溶氧系数(m0102／m1．mill．anll)发酵液密度(Kg／m3)发酵液粘度(N．s／m2)发酵液体积(m3)浙