rna干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响

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1、RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响作者：郝林,郑骏年,李望,杨文发,刘俊杰,温儒民,陈家存,孙晓青【摘要】目的探讨针对人端粒酶RNA（hTR）及其催化亚基（hTERT）的小干扰RNA（siRNA）对肾癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响。方法将hTRsiRNA、hTERTsiRNA（100nmol/L）单独或联合转染人肾癌7860细胞，采用RTPCR法检测hTR、hTERTmRNA表达，TRAPELISA法检测端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖，免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果（1）hTRsiRNA可显著降低7860细胞hTRm

2、RNA表达(P<0.01)，hTERTsiRNA可显著降低hTERTmRNA表达(P<0.01)，但彼此互不影响。（2）二者均能显著抑制端粒酶活性(P<0.01，P<0.01)，并增加7860细胞增殖抑制率及凋亡细胞阳性率(P<0.01，P<0.01)。二者联合应用与单独应用差异亦无显著性(P>0.05)。结论hTR、hTERTsiRNA通过抑制各自基因表达，抑制人肾癌细胞端粒酶活性，进而抑制增殖、促进凋亡。【关键词】肾癌；小干扰RNA；端粒酶RNA；端粒酶逆转录酶ofProliferationandInducti

3、onofApoptosis　　Key；SmallinterferingRNA；HumantelomeraseRNA；Humantelomerasereversetranscriptase　　0引言端粒酶被激活导致肿瘤细胞无限增殖，抑制端粒酶活性能使肿瘤细胞无法合成端粒而凋亡，因此是肿瘤治疗的理想靶点[1]。端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR)及端粒酶逆转录酶(hTERT)组成。端粒酶以hTR为模板合成端粒DNA，hTERT则是催化这一反应的唯一限速酶。RNA干扰能特异、高效阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具。我们应用RNA干扰技术阻抑hTR、hTER

4、T表达,观察其对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响。　　1材料与方法　　1.1材料人肾癌透明细胞株7860由本室保存。hTRsiRNA、hTERTsiRNA、阴性对照siRNA、siRNA转染试剂盒为美国Ambion公司产品。总RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒为美国Promega公司产品。TRAPELISA端粒酶活性检测试剂盒购自Roche公司。原位末端凋亡检测试剂盒购自SantaCruz公司。　　1.2方法　　1.2.1siRNA的设计、合成由Ambition公司设计、合成针对人端粒酶hTR序列及hTERT基因显性失活突变体区（NM003219

5、，碱基序列位置2182～2200）的siRNA。hTR序列如下:正义链：5'UUGUCUAACCCUAACUGAGtt3'，反义链3'ttAACAGAUUGGGAUUGACUC5'。hTERT序列如下:正义链5'CAAGGUGGAUGUGACGGGCtt3'.反义链3'ttGUUCCACCUACACUGCCCG5'。经基因库检索确认与hTR、hTERT以外的基因序列无同源性。　　1.2.2细胞培养及转染7860细胞于含10%FCS的RPMI1640中常规培养48h，按转染试剂盒说明将hTRsiRNA、hTERTsiRNA调整到终浓度为1

6、00nmol/L，单独或联合加入培养细胞内,另以生理盐水(空白对照)、脂质体、阴性对照siRNA作对照。培养24h后检测hTR/hTERTmRNA表达及端粒酶活性，72h后检测细胞增殖及凋亡。　　1.2.3RTPCR提取总RNA，RTPCR试剂盒一步法行RTPCR反应。hTR上、下游引物序列如下：5'CTGGGAGGGGTGGTGGCCATTT3'，5'CGAACGGGCCAGCAGCTGACAT3'。hTERT引物：5'GCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAA3'，5'AATCATCCACCAAACGCAGGAGC3'。以GADP

7、H基因作为内参照。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并扫描分析，以hTR、hTERT/GADPH表达水平行半定量分析。　　1.2.4端粒酶活性的测定采用端粒重复序列扩增酶联免疫吸附(TRAPELISA)法进行检测,根据A=A450A690计算端粒酶活性,并计算与空白对照组比值。具体步骤按说明书进行。　　1.2.5MTT法检测细胞增殖处理后7860细胞加入MTT10μl/孔(5mg/ml)，继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜100μl/孔，溶解甲瓒紫结晶，酶标仪570nm波长处测定吸光度A值，计算抑制率。　　1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡7

8、860细胞于玻片上固定，洗片后与Tr