nucleostemin基因特异性rna干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

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1、Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响：郑学芝，胡静，孙卫，刘桂莲，刘晓霓，蔡子微【摘要】目的探讨应用RNA干扰技术抑制nucleostemin(NS)基因表达对胃癌SGC7901细胞株增殖和凋亡的影响。方法阳离子脂质体法将构建好的NSsiRNA表达载体转染胃癌SGC7901细胞株，采用MTT法测试各组细胞增殖抑制率；RTPCR法检测各组细胞NS基因表达情况，流式细胞术检测细胞周期，AnnexinVFITC/PI法检测细胞凋亡率。结果与对照组相比，S组细胞的增殖减慢，24、48、72h细胞增殖抑制率分别为53.21

2、%、71.54%、87.47%；NS基因表达量下降，G0/G1期细胞百分率显著升高(58.34%)，S期细胞减少(20.68%)，细胞凋亡率增加(26.85%)。结论RNA干扰技术可抑制胃癌SGC7901细胞株NS基因的表达，使细胞增殖减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，凋亡率增加。【关键词】RNA干扰；nucleostemin；胃癌；细胞增殖；凋亡ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectonproliferationandapoptosisbyRNAinterferencetoinhibitNucleostemin(

3、NS)geneexpressioningastriccarcinomaSGC7901cells.MethodsTheNSsiRNAexpressionvectoracellsineTM2000reagent.Thenetry,cellapoptosisratiobyAnnexinVFITC/PIkit.ResultsparedaSGC7901cells,decreasecellproliferation,arrestcellcycleandincreaseapoptosisratio.KEYI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT、DMSO购自

4、Gibco公司。LipofectamineTM2000Reagent、Zeocin购自Invitrogen公司。AnnexinVFITC/PI试剂盒购自BD公司。RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司。引物合成及PCR产物测序由上海申能博彩生物科技有限公司完成。1.2细胞培养和转染胃癌SGC7901细胞培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃、50mL/LCO2潮湿空气的培养箱内培养，48h细胞贴壁后，更换培养液，然后2～3d传代1次，以维持细胞处于对数生长期。转染前1d将细胞接种到24孔板上，按每孔2×105个细胞传代。转

5、染方法按LipofectamineTM2000Reagent使用说明步骤进行。1.3单细胞细胞克隆的筛选及鉴定PCDNA4/CNSsilencer质粒和空载体PCDNA4/Cvector质粒转染胃癌SGC7901细胞后2～3d(分别命名为S组和V组)，开始使用抗生素Zeocin(200mg/L)筛选，单克隆形成后进行扩大培养，未转染的胃癌SGC7901细胞作为空白对照(N组)。以载体上Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法鉴定细胞克隆是否外源基因整合阳性。其引物序列为：上游引物5′ATGGCCAAGTTGACCAGTGC3′，下游引物为5′

6、TCAGTCCTGCTCCTCGGCCA3′。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，PCR产物大小约370bp，用PCR产物做琼脂糖凝胶电泳。1.4细胞的形态学观察倒置显微镜下观察各组细胞形态学的变化情况。1.5MTT比色法测定细胞增殖抑制率在96孔培养板上接种3组细胞，每组24复孔，每孔以1×103细胞浓度进行接种，分别于24、48、72h三个时间段进行MTT测定，每次每组测定8复孔。以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定490nm处的吸光度值(A值)；测3次，取平均值。细胞增殖抑制率＝1-细胞存活率＝(1

7、-实验组A值/空白对照组A值)×100%1.6各组NS基因表达水平的检测用RTPCR方法验证各组细胞NS基因表达丰度变化。参照Genbank中NS和GAPDH的基因序列及参考文献[3]，设计引物序列如下：NS基因扩增产物约570bp，上游P1：5′ATGAAAAGGCCTAAGTTAAAGAAAGC3′，下游P2：5′GCTCTCCAAATTCTCCTTTGGTA3′；GAPDH基因扩增产物长度约280bp，上游P3：5′GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA3′，下游P4：5′TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG3′。

8、PCR反应条件为94℃5min→(94℃30s→50