survivin 反义寡核苷酸诱导胃癌原代细胞凋亡的实验研究

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1、survivin反义寡核苷酸诱导胃癌原代细胞凋亡的实验研究【摘要】目的探讨survivin反义寡核苷酸对人胃癌原代细胞凋亡的影响，为胃癌的靶向治疗提供实验依据。方法利用人胃癌实体瘤新鲜标本培养胃癌原代细胞，胃癌细胞分为空白对照组、脂质体组、正义寡核苷酸组及反义寡核苷酸转染组。用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胃癌原代细胞，48h后，观察肿瘤细胞的形态变化，ethodsTheprimarycellshumangastriccarcinoma.Theculturedprimarycellscontrolgroup，liposomes

2、controlgroup，SODNcontrolgroupandASODNexperimentgroup.Aftertransfectingcellsfor48hoursusingsynthesizedsurvivinASODNbyliposome，culturedcellarycellmorphologicalchangesicroscope，survivinprotEinexpressioninedbyfloetry.ResultsPrimarycellsalmorphologicalchangeofprimarycelletrysh

3、oongshamgroup，lipsomegroupandlip-SODNgroup（P>0.05）.ConclusionSurvivinantisenseoligonucleotidecaninducetheapoptosisandinhibitthegroarycellofgastriccarcinoma.SurvivinASDONmightbeamethodtopromotetheapoptosisofthecellofgastriccarcinoma.［Keyarycell;gastriccarcinoma胃癌是一种严重危害

4、我国人民健康的常见病，寻找有效的治疗方法已成为日益紧迫且严峻的问题。目前治疗胃癌的主要手段是以手术、化疗为主，辅以放射治疗、中药、免疫治疗等手段［1］，但上述方法均有其一定的局限性，这些方法的单独或联合应用并没有使胃癌患者的整体存活率得到明显提高。由此，治疗肿瘤开始向靶向治疗方向发展［2］，靶向治疗的前提就是要寻找分子标靶。survivin是一个理想的分子标靶［3］，它通过直接或间接抑制caspase-3、7而实现其抗凋亡功能［4］，还具有调节细胞增殖，参与新生血管形成等作用。针对survivin这个新靶点，研制出来反义survivin。

5、许多研究已经证实survivin反义寡核苷酸（ASODN）能够诱导胃癌SGC-7901［5～7］细胞的凋亡，而在胃癌原代细胞中少见有报道。本实验利用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胃癌原代细胞，探讨survivin反义寡核苷酸对胃癌细胞的凋亡诱导作用。1材料与方法1.1材料1.1.1胃癌实体瘤从医院手术室内取胃癌实体瘤标本，经适当处理后进行胃癌细胞的原代培养。1.1.2试剂胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品，RPMI1640购于Invitriogen公司。脂质体JetPEITM转染试剂为PolyPlus-transfe

6、ction公司产品。survivin反义寡核苷酸（ASODN）序列:5’>CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG<3’survivin；正义寡核苷酸（SODN）序列:5’>CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG<3’两链所有碱基全硫代修饰，均为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。细胞处理试剂盒由上海昂佰生物医学科技有限公司生产。1.2方法1.2.1胃癌原代细胞的培养在医院手术室取胃癌新鲜标本，无菌操作，取肿瘤组织块，用含青、链霉素及两性霉素B的D-Hanks20ml浸泡后，切成1mm×1mm×1mm大小组织块

7、，放入鼠尾胶原包被的培养瓶内，组织块间距约0.5cm，加培养液至组织块底部刚好没入液面下。培养瓶放入37℃含5%CO2培养箱内。24h换液1次，直至细胞长出多量后，加入常规量培养液。培养细胞呈半贴壁生长，传代时直接从一培养瓶内转移入另一培养瓶内继续培养，培养至第3代时，收集细胞，取广义原代细胞概念（10代内），对培养至第3代的胃癌细胞进行实验操作。1.2.2细胞分组及转染收集培养至第3代处于生长对数期的肿瘤细胞，接种于24孔板，分为4组：空白对照组，脂质体组，正义寡核苷酸组，反义寡核苷酸转染组。用JetPEITM脂质体作为转染介导物。各注

8、意事项均按说明书进行，以保证最大的转染率。空白对照组加入生理盐水，脂质体组仅加入脂质体，正义寡核苷酸组及反义转染组加入脂质体及寡核苷酸链复合物。细胞量及液体量按JetPEITM说明书推荐的量进