survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究

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1、survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究TheeffectofsurvivinantisenseoligonucleotideonapoptosisofHL-60cells前言1997年耶鲁大学的Altieri博士用EPR-1的cDNA在人类基因组库的杂交筛选实验中发现了一段15kb大小的基因片段，它编码了142个氨基酸组成的Survivin蛋白；Survivin的编码基因位于染色体17q25，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成员StructureofhumanIAPproteinfamily17q25BIR:bac

2、uloviralIAPrepeatRZF:ringzinc-fingleCARD:caspaserecruitmentdomainInhibitorofApoptosisLocationinhumanchromosomeSurvivin分子结构长α螺旋BIR区Survivin分子结构长α螺旋BIR区Survivin分子结构Survivin形成二聚体Survivin表达肺癌肝癌膀胱癌皮肤癌神经母细胞瘤乳腺癌食管癌胃癌白血病Survivin表达SURVIVIN选择性表达于绝大多数肿瘤组织在正常成人分化组织中不表达（包括癌旁组织）普遍

3、性独特性Survivin作用!Survivin作用Survivin抗凋亡肿瘤细胞分裂增加凋亡减少研究内容反义Survivinsurvivin表达受抑活化细胞凋亡技术路线HL-60细胞体外悬浮培养掺入反义寡核苷酸48h后分别于24h、48h形态学观察、死活细胞计数收获细胞、检测指标RT-PCRTUNELFCM材料细胞株HL-60细胞株（急性早幼粒细胞系）由中国科学院上海细胞所提供RNAgentsTotalRNAIsolationSystemPromega公司AccessQuickTMRT-PCRSystemPromega公司Pro

4、pidumIodide(PI,碘化丙啶)Sigma公司主要药品与试剂材料研究方法反义寡核苷酸的序列survivin反义硫代寡聚脱氧核苷酸(Aspo)序列5’GGCAACGTCGGGGCACCCAT3’[9]非特异性对照硫代寡聚脱氧核苷酸(Nspo)序列5’GCCATCGTAGGGGATCGCTT3’[9]上海SANGON公司合成与纯化培养箱20%新生小牛血清RPMI-1640液100U/ml青霉素100ug/ml链霉素37oC5%CO2饱和湿度倒置显微镜观察2~3天传代一次细胞系的培养和传代HL-60细胞Photo1.HL-60

5、cells（×100）Tab1.TheexperimentgroupinggroupfactorconcentrationControlRPMI-1640mixtureNspoNspo15.0umol/LAspo5.0Aspo5.0umol/LAspo10.0Aspo10.0umol/LAspo15.0Aspo15.0umol/L实验分组及寡核苷酸的掺入1000r/min离心5minRPMI-1640洗1次细胞起始浓度4×106/ml取细胞悬液1000ul接种至24孔板核酸100ul置CO2培养箱中孵育HL-60细胞细胞增殖能力

6、及活力观察HL-60细胞于24、48h取50ul细胞悬液0.4%台盼蓝染色计数死活细胞着色为死细胞拒染为活细胞计算细胞存活率细胞增殖能力及活力观察HL-60细胞survivinmRNA的表达总RNA的提取细胞沉淀加入300ulD液加入30ulSodiumAcetate加入苯酚:氯仿:异戊醇300ul冰浴15min10000g4℃离心20min转移上清加入等量异丙醇20℃放置10min10000g4℃离心10min75%冷乙醇洗涤RNA10000g4℃离心10min以无RNase的纯水溶解沉淀RNA纯度检验和定量RNAHL-60细

7、胞survivinmRNA的表达RT-PCR反应体系50µl48℃延伸45min95℃预变性2minPCR循环95℃45sec61℃1min72℃1min共30个循环72℃延伸5min模板RNA1ulAMV逆转录酶1ul上游引物3ul下游引物3ulAccessQuickTMMasterMix25ulTdt酶介导的缺口末端标记法具体操作按试剂盒说明书进行结果与判定：细胞核为棕褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞凋亡细胞指数=凋亡细胞数细胞总数×100%DNA倍体分析及凋亡率的检测实验流程单细胞悬液不含Ca2+或Mg2+的PBS洗细胞2次1

8、000g离心5min弃上清计数细胞总数500μlPBS重悬5ml冷乙醇4℃过夜离心洗细胞2次含1%小牛血清的800μlPBS重悬避光孵育1h100μl煮沸过的RNA酶A37℃30分钟FCM分析加入100μlPI统计分析结果均以“均数±标准差”表示，组间比较用单因