阿伦膦酸钠对骨髓生成破骨细胞骨吸收作用的影响

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1、阿伦膦酸钠对骨髓生成破骨细胞骨吸收作用的影响作者：陈明，郑琼，方真华，勘武生【摘要】［目的］研究阿伦膦酸钠对体外培养的小鼠骨髓生成破骨细胞及其骨吸收作用的影响。［方法］收集小鼠骨髓细胞于含有10-8mol／L的1，25二羟基维生素D3［1,25-(OH)2D3］的α-MEM完全培养基中体外培养，设置不同浓度的阿伦膦酸钠给药，并于培养的第6、9、12d观察记录抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)阳性多核巨细胞［破骨样细胞(osteoclast-likecell,OLC)］生

2、成数，反映破骨细胞生成情况。记数培养12d骨磨片上骨吸收陷窝数及吸收面积，反映骨吸收情况。［结果］随着阿伦膦酸钠浓度的增高，TRAP阳性的细胞数减少，骨吸收陷窝数及面积均减少。［结论］阿伦膦酸钠可抑制骨髓细胞体外培养中破骨样细胞的形成，体外可抑制破骨细胞骨吸收作用。【关键词】阿伦膦酸钠；骨髓细胞；破骨细胞；骨吸收Abstract：［Objective］Tostudytheeffectofalendronateonboneresorptionandosteoclast-likecellsformationinmousebonemarr

3、okunmingmouseol/L［1,25-(OH)2D3］.TRAPpositivecellsationofosteoclast-likecells.Thenumberofboneresorptionpitsandareaonboneslicesberofboneresorptionpitsandareaarroarroa)，α-MEM培养基(Sigma);胎牛血清(Gibco)；(萘酚AS-BI磷酸钠，六偶氮副品红，酒石酸钾钠)自配；阿伦膦酸钠由默沙东公司提供，薄骨片自行制备。TRAP孵育液的配制：孵育液A液，0.2mol／L

4、醋酸缓冲液，pH5.0；B液，六偶氮副品红，取副品红1g加去离子水20ml，浓盐酸5ml，加热至90℃过滤制成副品红溶液，置于黑色瓶4℃储存，临用前与4％亚硝酸钠等比例混合；C液，取萘酚AS-BI磷酸盐20mg加入N-二甲基甲酰胺1ml溶解。取A液18ml、B液1ml、C液1ml混匀，用1mol／L氢氧化钠或盐酸调pH至5.0，加入酒石酸钾钠282mg配成TRAP孵育液，过滤备用。薄骨片的制备：将新鲜牛股骨的皮质骨用钢锯及粗细金刚砂石制备成6mm×6mm大小，30μm厚的骨磨片，骨蒸馏水中在超声波清洗仪内清洗3次，每次10min。紫

5、外线照射消毒，然后将骨片浸泡于α-MEM培养液内(含青霉素1000u／ml，链霉素1000μg／ml)，换液3次，每次20min。1.2骨髓细胞的收集培养参照1.6统计学处理所有数据采用均数±标准差x±s表示，结果采用方差分析q检验，检测不同处理组之间TRAP染色阳性细胞数、骨吸收陷窝数及面积差异有无统计学意义。2结果培养6d后对照组玻片上开始出现数目不等的多核巨细胞，相差显微镜下细胞形态清晰，呈油煎蛋形、长条形、漏斗形或不规则形，有片状或丝状伪足，这些细胞胞浆丰富，有几个到十几个细胞核，胞浆内可见大小不等的空泡，细胞形态会随着培养

6、时间延长而变化。TRAP染色胞浆颗粒呈紫红色，经鉴定为破骨细胞(图1～3)。培养6d10-4mol／L组未见明显破骨样细胞，10-5mol／L和10-6mol／L组可见很少的破骨样细胞出现。第9、12d玻片TRAP染色均可见数目不等的TRAP阳性细胞，但对照组OLC细胞远多于各实验组，且随着阿伦膦酸钠浓度的增高，TRAP染色阳性细胞呈递减趋势(表1)，两两比较显示，3个实验组TRAP阳性细胞数均明显少于实验组(P<0.01)，说明阿伦膦酸钠具有抑制骨髓生成破骨细胞的作用。表1不同阶段各组TRAP染色阳性细胞记数注：*对照组比，

7、P<0．01，△与10-6mol/L组比，P<0.05扫描电镜观察破骨细胞形态多样，与相差倒置显微镜所见一致，可见大而扁平的薄纱样伪足，细胞表面大量丝状突起。骨吸收陷窝呈圆形、椭圆形，底面粗糙，边界清晰(图4)。细胞培养12d骨片吸收陷窝数与面积测量结果(表2)，不同浓度的阿伦膦酸钠均明显抑制破骨细胞对骨磨片的骨吸收。表2阿伦膦酸钠对骨吸收陷窝与面积的影响注：*与对照组比，P<0.01图1～3体外培养6d，小鼠骨髓经1，25-（ＯＨ）２Ｄ３诱导生成破骨细胞，TRAP、HE染色鉴定及倒置相差显微镜下显示破骨细胞形态多

8、样，胞浆丰富，有较多伪足200×图4扫描电镜下观察到骨片吸收陷窝1500×3讨论3.1破骨细胞培养与鉴定破骨细胞由于数量少，体积大，含丰富蛋白水解酶并且有紧贴骨基质生长等特点，使得分离中破骨细胞易受损伤，获得较纯前破骨细胞难度较大，尤