中华按蚊多态微卫星dna位点的筛选和特征研究论文

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1、中华按蚊多态微卫星DNA位点的筛选和特征研究论文【摘要】目的：对中华按蚊多态的微卫星DNA位点进行分离和筛选，并阐明其特征.方法：应用中华按蚊基因组DNA的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针杂交，亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段，扩增放大，克隆并测序，构建中华按蚊微卫星DNA库.在其中挑选合适的微卫星位点，建立扩增体系.应用中华按蚊现场样本扩增不同的微卫星位点，聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的微卫星位点.结果：构建的中华按蚊微卫星DNA库中包含252条序列.freelann,1828）在我国分布广且种群数量大，是以往文献记载中疟疾和丝虫病的重要传播媒介［4-5］.本研究

2、拟构建中华按蚊的微卫星DNA库并筛选其中多态的微卫星位点，为中华按蚊基因组学研究积累基础资料，并为其相关研究提供新的分子标志.1材料和方法1.1材料构建中华按蚊微卫星DNA库的样本为上海实验室品系，由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供.现场中华按蚊采自云南思茅（200508，n=10）、云南盐津（200607，n=10）和湖北武汉（200607，n=10），选择雌性成虫为实验材料.1.2方法1.2.1微卫星DNA库构建基因组DNA的抽提参照Hammond等的文献进行［6］，-20℃保存待用.基因组DNA经Sau3AI酶切，回收200～800bp的片段，加SA

3、UL接头连接，接头序列如下：SAULA：GCGGTACCCGGGAAGCTTGG，SAULB：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC.以SAULA为引物，连接产物作为模板PCR扩增，反应液中含PCR缓冲液、2.5mmol/LMgCl2，0.2mmol/LdNTP，0.8μmol/L引物，0.6UTaq酶（上海生工生物工程有限公司）和2μL模板，在热循环仪（PTC100，美国ABI公司）上执行如下程序：72℃5min后，94℃1min，67℃1min和72℃2min共32个循环，72℃延伸5min.将扩增产物变性后，与Biotin16ddUTP（瑞士Roc

4、he公司）标记的寡核苷酸探针杂交，探针包括：(AAT)17，(GA)25，(CCT)17，(AC)25，(CAG)17，(CAC)5，(TC)10，(GT)8和(TG)18.用亲和素VectrexAvidinD（英国VectorLabs公司）捕获并超滤离心（美国Millipore公司）浓缩富集杂交的目的片段.以富集的核酸作为模板，SAULA为引物扩增，反应体系和程序同前.随后，用PCR产物再次杂交、捕获、浓缩富集和扩增.将上述扩增产物插入TOPOT载体（美国Invitrogene公司），转化E.coliJM109，挑选含微卫星DNA序列的阳性克隆，用四色荧光标记双脱氧链

5、终止法测序（PEABI3770全自动测序仪，上海英骏生物技术有限公司），应用BioEdit（Version5.0.9）软件包分析所获序列.1.2.2微卫星DNA多态位点筛选单蚊抽提现场中华按蚊基因组DNA，参照文献进行分子鉴别确认蚊种为中华按蚊［7］.选择22条重复次数较多，且典型的微卫星DNA序列，应用Primer3（Version3.1）软件包设计引物.以单蚊基因组DNA为模板，PCR扩增微卫星DNA（反应体系和程序同前），退火温度范围在55℃～60℃.扩增产物经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，银染、显色，依据凝胶上的条带判断其是否具有多态性.2结果2.1中华按蚊微卫星D

6、NA库构建的中华按蚊微卫星DNA库中包含282条序列，其中18条序列完全相同，21条序列较短（小于100bp），故有效的微卫星DNA序列共252条，GenBank注册号为EF620047～EF620298.分析所获的微卫星DNA序列，显示其长度范围为50～800bp，大多数在300bp左右.就重复情形而言，双核苷酸重复最为常见，三核苷酸重复次之，多核苷酸重复少见；含（CA）和（GT）重复的序列最多，重复次数不等，最多可达56次.所获的微卫星DNA依据文献［8］标准划分，结果完整序列为89条（35.3%），非完整序列51条（20.2%），复合序列47条（18.7%），其余为

7、非典型序列（25.8%）.2.2中华按蚊微卫星多态位点设计并合成了22对扩增微卫星DNA的引物，对现场样本进行扩增的结果显示，20个位点有特异的PCR产物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（一条带为纯合子，两条带以上为杂合子），共有15个微卫星DNA位点具有多态性（表1）.本研究的多态微卫星位点在退火温度为55℃时，均存在特异产物.表1中华按蚊多态的15个微卫星位点特征3讨论通过比较分析本研究所获中华按蚊微卫星DNA序列的特点，发现与已报告的冈比亚按蚊（An.gambiae）［9-10］，催命按蚊（An.funestus）［11-12