百草枯致小鼠帕金森病模型多巴胺能神经元损害作用的研究

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1、百草枯致小鼠帕金森病模型多巴胺能神经元损害作用的研究【摘要】目的研究环境毒素百草枯（PQ）诱发帕金森病(PD)过程中多巴胺能神经元的损害和基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9的表达规律。方法C57BL小鼠按体重10mg/kg经腹腔注射PQ，分别观察动物行为，高效液相法测定纹状体部多巴胺（DA）含量的变化。免疫组化染色法观察和计数黑质（SN）酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的数量，免疫组化法观察术后不同时间点MMP2、MMP9的动态变化。结果与对照组比较，模型组SN致密部TH阳性神经元数明显减少（P＜0.01），纹状体DA含量明显低于对照组（P＜0.01），MMP2、MMP9的

2、表达增强。结论大剂量的PQ可使小鼠产生类似于PD的行为和DA能神经元的损害，MMP2、MMP9可能参与了DA能神经元的损害过程。【关键词】百草枯；帕金森病；多巴胺能神经元【Abstract】ObjectiveToinvestigatebiologicaleffectofparaquat(PQ),environmentalfactor,ondopaminergicneuronsofsubstantianigra(SN)，andtheroleofmatrixmetalloprotEinases(MMP)inthepathogenesis.MethodsTheC57BLmiceg/kgP

3、Q,andHPLCine(DA)instriatum.Immunohistochemistryassayeasuretheimmunoreactivityoftyrosinehydroxylase(TH)inSN.ResultsparedountofTHpositiveneuroninMPTPgroupightinjurydopaminergicneuronsofsubstantianigra,MMP2andMMP9mightattendthepathogenesisinC57BLmice.【Keyinergicneurons帕金森病(PD)确切病因尚不清楚。近年来随着环境毒素与P

4、D之间的关系日益受到重视，PD已被认为是一种环境密切相关疾病。百草枯(PQ)低剂量腹腔注射可引起成年小鼠黑质(SN)部多巴胺(DA)能神经元减少和产生明显的行为和神经功能障碍〔1，2〕。是模拟环境毒素暴露诱发PD的理想动物模型。基质金属蛋白酶(MMP)在正常脑内少有表达，脑损伤发生后，血管内皮细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、神经细胞和浸润的中性粒细胞都可以表达大量的MMP2和MMP9，与脑微血管通透性、血脑屏障(BBB)通透性、BBB崩溃、炎细胞浸润、脑水肿及加重缺血性脑损伤明显相关。本文采用腹腔注射PQ的小鼠作为模型，研究环境毒素暴露诱发PD过程中DA能神经元的损害和MMP2、

5、MMP9的表达规律。1材料与方法1.1造模〔1〕健康雄性C57BL小鼠16只，鼠龄8g/kg经腹腔注射PQ(美国Sigma公司)，连续3d；对照组注射相同体积的生理盐水。观察小鼠的行为学改变。1.2标本采集在实验观察第30天，小鼠用1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以20ml生理盐水冲洗血液，随后用4℃含4％多聚甲醛的0.1mol/LPBS(pH7.4)先快后慢灌流固定，取脑置于20％蔗糖(4℃)直至沉底，用冰冻切片机行冠状连续冰冻切片，进行免疫组织化学和HE染色。1.3纹状体DA的提取和含量的测定〔1〕用10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后

6、，快速断头取脑，在预冷的0.1mol/LPB缓冲液(pH7.4)中剥离出纹状体，经干冰固化称重后迅速保存在液氮中。测定时取出标本置于匀浆器中，加入1ml预冷的高氯酸，制成匀浆，于台式冷冻离心机中4℃、14000r/min离心30min，留取上清液，采用高效液相色谱(HPLC)测定DA含量。1.4免疫组织化学染色SABC免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，抗酪氨酸羟化酶(TH)兔多克隆抗体、羊抗MMP2和羊抗MMP9多克隆抗体（均为武汉博士德公司产品）。切片首先在含0.3％TritonX100的PBS中浸泡30min(室温)后依次加入：①小鼠抗TH单克隆抗体稀释液，室温孵育1h；②生

7、物素标记的驴抗小鼠IgG，室温放置1h；③ABC复合物室温浸泡1h，然后用DAB呈色。染色的切片经漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封片。在显微镜100倍视野下计数各组切片SN区TH阳性神经元，并照相。1.5统计学处理组间比较采用单因素方差分析及t检验。2结果2.1行为学和病理学变化连续腹腔注射PQ3d后，PQ组小鼠均出现不同程度的运动障碍，动作迟缓、震颤、竖毛、竖尾和活动减少。病理学可见脑组织有大量坏死空腔，在海马组织周围尤其明显（图1）。　　2