噪声所致耳蜗毛细胞表达ｎｆ－κｂ中维生素ｅ的调节

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1、噪声所致耳蜗毛细胞表达ＮＦ－κＢ中维生素Ｅ的调节【摘要】目的探讨维生素E在噪声暴露引起的大白鼠听力损伤有明显的保护作用及机制。方法健康雄性纯种ethodsTaketheaudibilitythresholdbasilarmembranestretchedpreparationandimmunofluorescencestainastheindex,observingthattheratsinEandsodiumchloride,checktheauditorybrainstempotentialandthelost

2、rateandNF-κBoftheOHCinthecochleahaircellsexpressionquantitativeanalysis.ResultAfterthenoiseexposure,theratsinEhavesignificantlouchlomunofluorescencestaindemonstratethatthegrouphavevitaminEhaveloinEhasobviousprotectioninthehearingimpairmentofrats,inE;NF-κB　　　　

3、噪声可产生可恢复的暂时性阈移（TTS）或不可恢复的永久性阈移（PTS），甚至造成噪声性耳聋。对噪声性听力损伤机制迄今尚无明确报道。本实验在大白鼠噪声暴露前30天至暴露后7d灌胃维生素E，对其防止TTS转变为PTS及促进听力恢复有无保护作用进行探讨。分析维生素E干预噪声听觉损伤与耳蜗毛细胞中NF-κB的表达的关系，确定VE减少噪声引起的毛细胞死亡的分子机制。　　1材料与方法　　1．1动物分组与处理选择鼓膜听觉脑干电位仪测4000Hz频率双耳听阈在23~28dB的健康雄性大白鼠30只，体质量180~200g；随机分

4、为3组；正常组12只（24耳）维生素E组12只（24耳），单纯暴露组12只（24耳）。维生素E组在暴露前30d至暴露后7d连续灌胃［4mg/（kg•d）］。单纯暴露组在暴露前30d至暴露后7d连续灌胃0．9％生理盐水［5ml/（kg•d）］。噪声暴露：连续用药30天后即行噪音暴露，将动物置于小笼内(40cm×30cm×30cm)每笼2只，放入暴露舱（0．5m×1．5m×0．5m）用UZ-3型噪声发生器发生，A-K200功率放大器放大，有位于暴露舱四周的扬声器向暴露舱播放。暴露时用声压计进行连

5、续监测，噪音保持在频率为4000Hz，平均声强为116dBSPL（soundpressurelevel）。动物暴露范围内声扬不均匀度为±2dB。持续暴露6h。　　1．2听阈测试测试在隔音屏蔽室内进行，10％水合氯醛（330mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后安插针式电极，记录电极的安装用不锈钢针刺入前颅顶正中穿透皮肤至颅骨骨膜，置于冠状缝中点处，同时给声耳及对侧耳后皮下分别刺入不锈钢针，作为参考电极和接地电极。TDH-39型耳机给声，声源距耳廓1cm，诱发电位用信号处理机叠加处理，进行测试：刺激声为交替短声（clic

6、ks），重复率10次/s。实验选用主要参数为：带道滤波为32~3KHz，扫描时间为10ms，叠加为512次。测试声强由110dBSPL开始，接近阈值后按5dBSPL渐档递减，电生理反射由针式电极引出，经放大及处理后以波形的方式显示于荧光屏，阈值是以肉眼刚能辨认的脑干电位波群中以Ⅲ波的声强表示。　　1．3耳蜗基底膜铺片三组动物完成最后一次听阈测试后(噪声暴露停止后第7天)处死动物立即取出颞骨,打开听泡,4%甲醛固定24h,10%EDTA脱钙1周,分离出基底膜,三组动物随机抽出各6只(12耳),在常规苏木素染色,在放

7、大400倍的光学显微镜下，以目镜中0．24mm显微测微尺为测量尺度，逐个视野从蜗底向蜗顶进行OHC记数。以OHC境界模糊或消失、细胞碎裂或缺失为OHC死亡标志。钩部和蜗尖各有4个视野不做记数。所得数据分析OHC损失分布情况。　　1．4免疫荧光染色三组动物基底膜各6只(12耳)，用0．1mol/LPBS洗涤3次，每次5min，加入0．1%TritonX-100处理15min，5%羊血清封闭1h，加入一抗（NF-κB工作浓度1：100），室温孵育1h，用0．1mol/LPBS洗涤3次，每次15min，加入，Alexa

8、Fluor555Goatanti-rabbitIgG（工作浓度1：400），室温、避光放置1h，0．1mol/LPBS洗涤3次，每次15min，轻轻摇动。弃掉洗涤液，最后样品均再用1g/ml的Hoechst33342室温染色5min，甘油封片。用Fluovie.　1．5统计学方法采用FluovieaStat．2．03（sigma）统计软件，采用oneo等[1