荧光法测定醛糖还原酶活性的优化

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1、荧光法测定醛糖还原酶活性的优化作者：王俊杰方会龙段小毛肖和平谷娟李玲欧阳冬生【摘要】　　目的找出优化NADP生成荧光法测定红细胞醛糖还原酶(AR)活性的方案。方法通过研究血红蛋白浓度、激发荧光水浴时间以及NADP溶液贮存时间对荧光强度的影响，优化红细胞AR活性测定的NADP生成法；以此方法测定正常及糖尿病大鼠AR活性。结果NADP生成法的精确度受血红蛋白影响，在终止反应后的NADP溶液中加入250μl6％高氯酸沉淀血红蛋白可消除此影响；水浴激发荧光时间5、30、60min，荧光值变异系数无差异；在激发荧光前将反应体系生成的NADP溶液贮存于-2

2、0℃的条件下至少可以稳定保存4izethetheNADPgeneratingfluorimetricmethodforaldosereductase(AR)activity.MethodsTheeffectofhaemoglobin，thetimeofaqueousbatharousingfluorescenceandstoragetimeofNADPsolutiononthefluorescentvalueizedthattheNADPgeneratingfluorimetryassayederythrocytesARactivity.A

3、Ractivityofnormalanddiabeticmellitusratined.ResultsTheaccuracyofthisassayoglobinconcentrationinatedbyadding250μl6﹪perchloricacidtoprecipitatehemoglobinasthereactioninated.Ithadnodifferenceforthevariationcoefficientoffluorescencevalueethatthefluorescencein.NADPsolutioncouldbe

4、storedintheconditionof-20℃for4alrats(P＜0.05).ConclusionsOptimizedNADPgeneratingfluorimetrycanmeasureactivityoferythrocyteARaccurately.【Keya公司)，其他试剂均为国产分析纯。荧光分光光度计(日本产岛津RF5000)，京都血糖仪(日本第一科学株式会社)。　　1.2.2大鼠糖尿病模型的复制　　大鼠适应性喂养3d，禁食12h，糖尿病组按5.5ml/kg体重单次腹腔注射STZ溶液(STZ用0.1mol/LpH4.2

5、的柠檬酸缓冲液配成10mg/ml的溶液)，3d后尾静脉采血随机测血糖≥13.5mmol/L者为糖尿病大鼠，对照组注射等量柠檬酸缓冲液。饲养期间所有大鼠自由饮水进食。4l，3000r/min×10min分离红细胞，然后加4倍体积4℃预冷的生理盐水，3000r/min×10min×3次离心洗涤红细胞，按照50μl/支分装(一支实验管，其余备用)，-20℃冻存。取冻存红细胞加200μl10mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，振荡溶解10min，3000r/min×10min，去沉淀。　　1.2.4AR活性测定反应体系　　　　每份样品一式三份，冰上

6、操作，反应体系（终浓度）：135mmol/LPBS，100mmol/L硫酸铵，0.04mmol/LDL甘油醛，150μmol/LNADPH，5μl红细胞溶血液，总体积200μl。实验管加上述所有试剂，空白管以去离子水代替NADPH。加入DL甘油醛后立即37℃水浴反应。　　1.2.5终止反应　　5min后，将样本同时放入冰浴中，加入600μl0.5mol/LHCl后60℃水浴15min来终止反应并破坏反应剩余的NADPH。冰浴冷却后加入250μl6％高氯酸3000r/min×10min离心沉淀血红蛋白，吸取上清1ml，-20℃冻存。　　1.2

7、.6荧光值测定　　加入2ml6mol/LNaOH(内含10mmol/L咪唑)37℃水浴5min激发NADP产生荧光，Ex360nm/Em460nm测定荧光强度。　　1.2.7血红蛋白含量测定〔6〕　　用高铁氰化血红蛋白法。实验管加稀释液3ml，红细胞溶血液12μl，空白管以去离子水代替红细胞溶血液，混匀，静置5min，以空白管调零测实验管在540nm的吸光度值，计算血红蛋白含量Hb(g/L)＝OD540×367.7。每份样品平行做三份取均值。　　1.2.8绘制标准曲线并计算AR活性　　反应体系与条件同上，去离子水代替红细胞溶血液，NADP(0～

8、1000μmol/L)代替NADPH，以NADP浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标做标准曲线，求回归方程。由方程求得NADP生成量，以每分钟产生1μmol