醛糖还原酶基因AR的克隆.doc

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1、醛糖还原酶基因AR的克隆一、醛糖还原酶DNA模板的构建抽取人体血液，经过亲和色谱法提取mRNA，该过程可用商业化的试剂盒分离系统，得到高纯度mRNA。再用RT-PCR法，逆转录出c-DNA,再合成AR基因。二、引物设计登陆NCBI网站，进入“核酸”中，输入醛糖还原酶的登陆码：U37100，找到该序列：1CAAAAACAGCAACAGAAAGCAGGACGTGAGACTTCTACCTGCTCACTCAGAATCATTTCT61GCACCAACCATGGCCACGTTTGTGGAGCTCAGTACCAAAGCCAAGA

2、TGCCCATTGTGGGC121CTGGGCACTTGGAAGTCTCCTCTCGGCAAAGTGAAAGAAGCAGTGAAGGTGGCCATTGAT181GCAGGATATCGGCACATTGACTGTGCCTATGTCTATCAGAATGAACATGAAGTGGGGGAA241GCCATCCAAGAGAAGATCCAAGAGAAGGCTGTGAAGCGGGAGGACCTGTTCATCGTCAGC301AAGTTGTGGCCCACTTTCTTTGAGAGACCCCTTGTGAGGAAAGCCTTTGAGAAG

3、ACCCTC361AAGGACCTGAAGCTGAGCTATCTGGACGTCTATCTTATTCACTGGCCACAGGGATTCAAG421TCTGGGGATGACCTTTTCCCCAAAGATGATAAAGGTAATGCCATCGGTGGAAAAGCAACG481TTCTTGGATGCCTGGGAGGCCATGGAGGAGCTGGTGGATGAGGGGCTGGTGAAAGCCCTT541GGGGTCTCCAATTTCAGCCACTTCCAGATCGAGAAGCTCTTGAACAAACCTGGACTGAAA60

4、1TATAAACCAGTGACTAACCAGGTTGAGTGTCACCCATACCTCACGCAGGAGAAACTGATC661CAGTACTGCCACTCCAAGGGCATCACCGTTACGGCCTACAGCCCCCTGGGCTCTCCGGAT721AGACCTTGGGCCAAGCCAGAAGACCCTTCCCTGCTGGAGGATCCCAAGATTAAGGAGATT781GCTGCAAAGCACAAAAAAACCGCAGCCCAGGTTCTGATCCGTTTCCATATCCAGAGGAAT841GTGATTG

5、TCATCCCCAAGTCTGTGACACCAGCACGCATTGTTGAGAACATTCAGGTCTTT901GACTTTAAATTGAGTGATGAGGAGATGGCAACCATACTCAGCTTCAACAGAAACTGGAGG961GCCTGTAACGTGTTGCAATCCTCTCATTTGGAAGACTATCCCTTCGATGCAGAATATTGA1021GGTTGAATCTCCTGGTGAGATTATACAGGAGATTCTCTTTCTTCGCTGAAGTGTGACTAC1081CTCCACTCATGTC

6、CCATTTTAGCCAAGCTTATTTAAGATCACAGTGAACTTAGTCCTGTT1141ATAGACGAGAATCGAGGTGCTGTTTTAGACATTTATTTCTGTATGTTCAACTAGGATCAG1201AATATCACAGAAAAGCATGGCTTGAATAAGGAAATGACAATTTTTTCCACTTATCTGATC1261AGAACAAATGTTTATTAAGCATCAGAAACTCTGCCAACACTGAGGATGTAAAGATCAATA1321AAAAAAATAATAATCAT

7、该段序列在70---1020bp可以合成蛋白质1、将上述数据导入到软件中（PrimerPremier）2、根据起始密码子（AUG）和终止密码子(UAG、UGA、UAA)，点击“Find”分别找出各位置：ATG：70、106、502、925TAG：1115TGA：1018TAA：1114选择起始密码为502，终止密码为1018.输入软件300bp到900bp选择如下片段5`TCGGCAAAGTGAAAGAAG3`3`CTGATAGGGAAGCTACGT5`根据所选序列（143—1011）选择酶切位点在143—1011

8、序列含有的酶切位点有在目的序列外的限制性内切酶有选择EcoRⅠ和XbaⅠ作为双酶切限制性内切酶，EcoRIG^AATTCXbaIT^CTAGA则上游引物序列：5`ATATG^AATTCGAT---TCGGCAAAGTGAAAGAAG3`下游引物序列：5`TGCT^CTAGAT---TGCATCGAAGGGATAGTC3`三、PCR扩增1、为了减少非靶序列的扩