抗人β淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

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1、抗人β淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定作者：段朝晖，毛越苹，罗晓红，李民友，劳伟思，王英，朱振宇【摘要】目的：运用噬菌体展示技术构建抗人β淀粉样肽（Aβ）特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法：从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，分离纯化mRNA，经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段，再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起，克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，转化至大肠杆菌T

2、G1，经辅助噬菌体M13KO7超感染后回收全部重组噬菌体，构建噬菌体抗体库，SDSPAGE鉴定纯度.结果：经琼脂糖凝胶电泳分析，RTPCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325bp，与预期VH，VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体，回收后构建成库容量为1.1×108的噬菌体抗体库，经SDSPAGE鉴定，得到Mr约为30000ku，纯度较好的ScFv抗体.结论：成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库，为抗

3、人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.【关键词】噬菌体展示技术；单链抗体；阿尔茨海默病；β淀粉样肽【Abstract】AIM:ToconstructandidentifythespecificantihumanβamyloidpeptideScFvbyphageantibodylibrarydisplaysystem.METHODS:TotalRNAspleenBcellsofBALB/cmiceimmunizedyloidpeptide,andmRNAthetotal

4、RNA,thenthefirststrandcDNAentsplifiedbyprimaryPCRandtheamplifiedVHandVLPCRfragmentsbledScFvgenefragmentsplifiedandrestrictionsitesentsidspCANTAB5EandthephagemidscontainingScFvgeneedintopetentE.coliTG1cells.ThetransformedcellsidsmunephageScFvlibraryentsampli

5、fiedbyprimaryPCRatchedtheexpectancyofVHandVLgenefragments.ThepurifiedVHandVLPCRfragmentsidmunephageScFvlibraryolecularmunephageScFvlibraryissuccessfullyconstructed.ThesuccessfulpreparationofantiAβScFvechanism,diagnosisandtreatmentofpatientsersdisease.【Key;s

6、inglechainvariablefragment;Alzheimersdisease;βamyloidpeptide0引言阿尔茨海默病（alzheimersdisease,AD），又称早老性痴呆症，是一种以记忆丧失、行为失常、人格改变、思维能力下降和认知功能障碍等为特征的中枢神经系统退行性疾病.有研究报道β淀粉样肽（βamyloidpeptide,Aβ）与AD的发病直接相关［1-2］.目前国内仅有制备Aβ42多克隆抗体的相关工作，有关建立良好的血液标志物检测方法的研究报道还较少见.本实验通过噬菌体抗体库技

7、术［3-4］构建抗Aβ的单链抗体库，为检测血液或脑脊液中Aβ水平并用于诊断AD［5-6］和抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定以及临床治疗应用打下基础.1材料和方法1.1材料雌性BALB/c纯系小鼠20只，6～7entas公司)；鼠ScFv噬菌体抗体展示系统(瑞典Amershampharmacia公司)；Trizol试剂(美国Gibco公司)；DNA多聚酶，QIAquickPCR纯化试剂盒(荷兰Qiagen公司)；SfiI内切酶，NotI内切酶(美国NEB公司)；T4DNALigase(美国Invitrog

8、en公司)；Aβ(美国Americanpeptide公司).1.2方法1.2.1动物免疫将0.5mL的Aβ42(150mg/L)与等量的完全福氏佐剂混合乳化，直到油包水的状态，取5只小鼠用Aβ42进行免疫.第一次基础免疫：每只小鼠自后足垫注射0.1mL.基础免疫后2L，共加强免疫2次.45d后引颈法处死免疫小鼠，取其脾脏.1.2.2总RNA抽提与mRNA的纯化用TRIzol试剂抽提小鼠脾细胞的总RN