人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定

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1、人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定【关键词】噬菌体表面呈现技术单链抗体肝癌　　0引言　　肝癌是我国常见的恶性肿瘤，目前治疗措施是以肝切除术为主的综合治疗。但对于肝癌的早期诊断、治疗疗效尚不理想[1]。单链抗体(ScFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组蛋白,是保持了亲本抗体抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段[2]。构建抗HCC噬菌体抗体库和制备特异性单链抗体具有较大的基础研究价值和广阔的临床应用前景[3]。本实验就是利用噬菌体表面呈现技术,构建了抗人肝癌单

2、链抗体基因噬菌体表面呈现文库,并从中筛选到有抗原结合活性的抗体。　　1材料和方法　　1.1材料　　Trizol试剂、cDNA合成试剂盒和凝胶纯化试剂盒购自Gibco公司，E.coliTG1、pCANTAB5E、M13KO7helperphage购自Promega公司，HRP/羊抗M13噬菌体抗体、T4DNA连接酶、限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ购自Pharmacia公司，TaqDNA聚合酶购自Takara公司，淋巴细胞分离液购自上海生化试剂厂。SOBAG琼脂板，2×YTAG，2×YTAK等试剂均自行配制。引物为10种VH和VL引

3、物混合物、与VH基因3′端和VL基因5′端序列互补的linkerPrimerMix、带有SfiⅠ酶切位点的VH5′端引物和带有NotⅠ酶切位点的VL3′端引物,引物设计参考文献[5],引物合成由北京Sunbiotech公司完成。肝癌细胞株SMMC7721由武汉大学典藏中心提供。30份肝癌患者的外周血标本采自湖北省肿瘤医院和武汉大学中南医院普外科。　　1.2方法　　1.2.1从肝癌患者外周血中分离淋巴细胞无菌抽取30例肝癌患者外周血各5ml,于每管中加入3ml淋巴细胞分离液,采用密度梯度离心法分离淋巴细胞。　　1.2.2提取总RNA及c

4、DNA第一链的合成用Trizol试剂提取淋巴细胞中的总RNA。以oligo(dT)18为引物,用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA。　　1.2.3VH、VL基因的扩增和鉴定分别以10种VH和VL混合物为引物,以cDNA第一链为模板,加入TaqDNA聚合酶，PCR扩增全套VH、VL基因,反应体积50μl,反应条件为:94℃，1min；55℃，2min；72℃，2min；共30个循环。72℃延伸10min。循环结束后,以1.5%琼脂糖凝胶回收并纯化DNA。　　1.2.4ScFv基因的扩增和鉴定以与VH基因3′端和VL基因5′端序列互补的l

5、inkerPrimerMix为引物,进行重叠延伸反应,将VH、VL随机拼接为ScFv。反应体积50μl,反应条件为94℃，1min；63℃，4min；共7个循环。用SfiⅠ、NotⅠ限制性内切酶切割上述ScFvPCR产物,与相应双酶切的pCANTAB5E载体片段用T4DNA连接酶连接。　　1.2.5ScFv基因噬菌体呈现文库的构建取连接产物转化感受态E.coliTG1,于SOBAG琼脂板上过夜,筛选出转化菌落,用2×YT－AG稀释培养细菌悬液至A600nm=0.3,37℃震荡培养，加入M13k07,离心后于2×YT－AK中过夜,离心

6、收集上清,即为抗人肝癌单链抗体库。　　1.2.6噬菌体抗体库的筛选在上清中加入PEG/NaCl，取含叠氮钠的封闭液稀释PEG沉淀的重组噬菌体,室温下孵育,加入SMMC7721细胞抗原包被的锥形培养瓶中孵育。PBS、PBST洗瓶。将对数生长期的E.coliTG1加入上述免疫吸附后的培养瓶内孵育。移至50ml细菌培养管中,再加入M13K07,37℃震荡培养,共4轮富集筛选。　　1.2.7噬菌体抗体库抗体特异性测定将富集的重组菌涂平皿，从中挑选30株单克隆菌株。均加入辅助噬菌体超感染后,置于2×YTAG中过夜。接种适量SMMC7721细胞

7、于96孔培养板中,待细胞长满孔底后,用0.125%戊二醛室温固定10min,以3%BSA封闭非特异结合部位。每孔加上述噬菌体抗体50μl,经0.05%T13抗体进行结合反应,37℃温育1h,PBS洗板5次,ABTS显色。以M13KO7为阴性对照,测定孔ELISAOD值为阴性孔2～3倍者为阳性。　　2.3噬菌体抗体库的筛选经对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选,测定噬菌体滴度,计算每一轮筛选后噬菌体的收获率，噬菌体收获率由第1轮的6.6×10-9%增到第4轮的1.7×10-6%,共增加了257倍。　　图1全套VH、VL基

8、因的扩增（略）　　图2ScFv基因的扩增（略）　　2.4Panning筛选及抗原结合活性鉴定从第4轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选30个克隆,用ELISA测定上清液中噬菌体抗体与SMMC7721细胞结合活性。加入H2O2