西瓜细菌性果斑病菌的gfp基因标记及在西瓜体内的定殖

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1、福建农林大学硕士学位论文摘要本研究通过XbaI和HindⅢ双酶切PS4GFP质粒，回收获得GFP片段，将GFP片段连接到同样双酶切回收的T-gfp质粒的大片段上，构建了重组质粒T-GFP2011；再通过EcoRI和HindIII双酶切T-GFP2011质粒，将回收得到的GFP片段连接到同样双酶切质粒PKK223-3大片段上，构建了能在西瓜细菌性果斑病菌中表达绿色荧光蛋白的载体PKK-GFP，且具有Amp抗性。研究还对果斑病菌感受态细胞的制备和转化条件进行优化，结果表明，采用NB培养基，在28℃摇床振荡培养至菌液浓度OD600=0.3-0.4，利用0.1M预

2、冷的含MgCl2的CaCl2处理所制备感受态细胞，其转化效率最高，并成功将GFP基因标记了西瓜细菌性果斑病A13菌株。标记后菌株的生物学测定表明，其与野生菌株生长趋势一致，但提前2h进入对数生长期；遗传稳定性较高，传代培养第15代时Amp抗性保持率100%，荧光保持率达到98%；具有较强的致病能力，与野生菌株没有显著差异。利用GFP基因标记好的菌株A13-PK-GFP进行定殖研究，结果表明，灌根接菌后，取样镜检可在西瓜的侧根周围观察到标记细菌富集、吸附，后侵入侧根表层，进入内皮层和维管束，沿维管束向上经主根、根茎交界、茎和叶转导，主要定殖在维管束、叶柄以及

3、气孔周围；子叶喷雾接种后，取样观察，首先在子叶、子叶上茎和新叶中观察到标记细菌，而子叶下茎菌量较少，根中没有观察到标记细菌，说明标记细菌在西瓜体内主要由下至上转导；另外，定殖动态研究结果表明标记细菌主要定殖在根和叶，灌根接菌后1d在根内分离回收到标记细菌，3d根内菌量达到最大2.3×105cfu/g，后有所减少，最终稳定在105cfu/g左右；灌根接菌后3d开始在叶内分离到标记细菌，8d时菌量达到最大4.8×105cfu/g，后趋于稳定。关键词：绿色荧光蛋白，定殖，基因标记，西瓜细菌性果斑病菌1福建农林大学硕士学位论文AbstractTheGFPsegme

4、ntwasobtainedbydigestingplasmidPS4GFPwithXbaⅠandHindⅢ,anditwasconnectedwiththelargesegmentofplasmidT-gfpwhichwasrecycledbydigestingwiththesameenzymes,thenarecombinantplasmidT-GFP2011wasestablished.TheGFPsegmentwasrecoveredbydigestingT-GFP2011plasmidwithEcoRⅠandHindⅢandwasattachedt

5、othebigsegmentofplasmidPKK223-3whichwasdigestedbythesameenzymes.Thenacarrier,PKK-GFP,wasobtained,whichcouldexpressgreenfluorescentproteininAcidovoraxcitrulliandalsohadAmpresistance.Thepreparationandconversationconditionsofthepathogencompetentcellswereoptimized.Theresultshowedthatt

6、hetransformationefficiencywasmuchhigherthananyothersastheprocedurewasfollowed,theNBmediumwasusedtoculturebacteriawithvibrationat28℃untilthebacterialconcentrationtoOD600=0.3-0.4,thencompetentcellsweretreatedwithprecooled0.1MCaCl2withMgCl2.,andatlasttheGFPgenewaslabeledinAcidovoraxc

7、itrullistrainA13successfully.Thebiometricsofthelabeledstrainshowedthatalthoughthegrowthtendencyoflabeledstrainwasthesameasthewildstrain,theformerenteredthelogarithmicphasetwohoursearlierthanthelater.ThegeneticstabilityofthelabeledstrainwashighasitsAmpresistancecouldkeep100%anditsf

8、lorescenceconservationratecouldre