生防芽孢杆菌za1的gfp基因标记及其定殖动态研究

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文生防芽孢杆菌ZA1的GFP基因标记及其定殖动态研究StudyonLabelingBiocontrolBacteriaBacillusZA1withGFPanditsColonization王颖指导教师姓名杨成德副教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称植物病理学研究方向植物病害综合治理论文答辩日期2015年5月30日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席李春杰教授评阅人徐秉良教授李敏权研究员2015年6月项目来源：本论文的完成受国家自然基金项目：东祁连山高寒草地禾草内生细菌的生物功能及机制研究(31160122)资助，并受草业

2、生态系统教育部重点实验室（甘肃农业大学）开放课题：东祁连山高寒草地禾草内生细菌对牧草抗逆能力的影响及机制研究(CYzs-2011011)资助。甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要本试验运用绿色荧光蛋白表达载体标记拮抗菌株ZA1，测定了标记菌株的功能稳定性，研究标记菌株ZA1-gfp在马铃薯根际及根内的定殖动态，并对ZA1-gfp定殖土壤后对土壤微生物的影响进行安全性评估。主要得到以下结果：1ZA1的转化及ZA1-gfp的稳定性对外源质粒pGFP78进行甲基化修饰后转化ZA1，得到阳性转化子。转化后菌株ZA1-gfp与野生型菌株ZA1形态一致，在荧光显微镜下呈现明亮的绿色。标记菌株ZA1-gf

3、p遗传稳定性达100%；标记前后的生长速率差异不显著（P<0.05）；ZA1对马铃薯枯萎病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯坏疽病菌的抑菌率分别为64.50%、68.35%和66.55%，ZA1-gfp对三种病原真菌的抑菌率分别为67.46%、76.56%和66.75%，表明外源质粒的导入，不影响菌株的抑菌能力；另外，ZA1体内的外源绿色荧光蛋白基因不影响菌株的运动性。2ZA1-gfp的定殖动态ZA1-gfp在土壤中定殖浓度波动范围为3.68×104～7.31×104cfu/g。在自然土中，马铃薯根际ZA1-gfp的定殖浓度波动范围为2.97×103～1.46×105cfu/g，根内定殖浓度为4.86

4、×101～6.3×102cfu/g；在灭菌土中，马铃薯根际ZA1-gfp的定殖浓度介于2.44×102～2.38×103cfu/g，根内定殖浓度介于2.42×101～1.16×102cfu/g。方差分析结果表明，在灌菌后的60d检测时间范围内，ZA1-gfp在土壤及马铃薯根际、根内的定殖浓度差异不显著（P<0.05）；同时，马铃薯的根部横切面、根毛和根表皮等部位均观察到发绿色荧光的ZA1-gfp菌体或聚集菌落，其对马铃薯植株的促生作用显著（P<0.05）。3ZA1-gfp对土壤微生物的影响从3大类群土壤微生物总数看，自然土中施入ZA1-gfp，IR值在灌菌后的第15d、第25d和第35d分别为

5、1349.1、2163.74和1293.47，表明微生物总数量显著增加（P<0.05）。灭菌土中施入生防菌株，其IR值在灌菌后的第15d、第25d和第35d分别为-9.26、53.17和1249.45，微生物总数量相对于灌菌前的数量表现出增长的趋势。I甘肃农业大学2015届硕士学位论文从灌菌后土壤中的细菌、真菌和放线菌消长动态看，自然土中的细菌、真菌和放线菌的数量分别在3.66×108～2.63×109cfu/g，2.38×104～2.50×105cfu/g和8.11×104～6.32×105cfu/g范围内波动；在灭菌土中，三种微生物的菌量分别介于3.15×108～4.22×109cfu/g

6、，1.46×105～5.23×105cfu/g和1.41×104～3.65×105cfu/g之间，动态数据之间均未出现连续的显著性差异（P<0.05），可见，ZA1-gfp的施入并未对土壤中的土著微生物群落产生不利影响，即ZA1-gfp不影响土壤中土著微生物的群落稳定性。关键词：莫海威芽孢杆菌、GFP基因、遗传转化、马铃薯、定殖、土壤微生物II甘肃农业大学2015届硕士学位论文SummaryInordertostudythecolonizationofZA1intherootofpotatoandrhizospheresoil,thevectorwithGFPwastransformedint

7、obiocontrolbacteriaZA1andthestabilitywastested.Thenthesafetyevaluationwasusedforstudyingmicrobialinteractioninsoil.Themainresultsareasfollows:1TransformationofZA1andstabilityofZA1-gfpThevectorofpGFP78