dna多态分析基础

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1、第三章DNA多态性分析基础人类DNA遗传标记----法医物证学应用研究的热点♦由常量检材到微量检材----微量检材的检验♦由蛋白质水平到DNA水平----陈旧检材的检验、取材的广泛性♦实现了仅能否定到高概率肯定---提高了法庭证据的可靠性人类DNA遗传标记----特定的座位上出现等位基因♦出现在编码区或非编码区♦表现为序列多态性或长度多态性第一节DNA分子结构与功能一、DNA的分子结构DNA是由4种核苷酸通过磷酸二酯键连接成的线性多聚体1.DNA的基本结构单位碱基AGCT核苷核苷酸脱氧核苷酸=碱基+脱氧核糖+

2、磷酸dNTPdNDPdNMP2.DNA的分子结构一级结构--DNA分子中核苷酸的排列顺序链接方式3’,5’磷酸二酯键连接戊糖和磷酸构成多聚核苷酸对骨架含氮碱基突出于骨架上不对称末端5’-自由的磷酸，3’-游离的羟基生物学意义1.遗传信息的载体2.构成DNA遗传标记的结构基础二级结构--两条DNA单链形成的双螺旋结构双螺旋结构的特征1.两条单链逆向平行排列，绕同一中心轴形成双螺旋2.两条单链间以氢键连接碱基互补原则：A=T,C=G**稳定性与G+C含量呈正比**嘌呤和嘧啶相等:A+G=C+T配对原则的意义1.复

3、制的分子学基础遗传信息传给子代2.转录的分子学基础RNA合成的模板–蛋白质3.DNA多态性分析的分子学基础DNA遗传多态性三级结构---超级螺旋结构结构特征真核生物DNA三级结构--核小体140bpDNA双链缠绕组蛋白8聚体60bp的连接链（结合有组蛋白H1）生物学意义压缩DNA分子体积，有利于在细胞中包装组蛋白对DNA分子完整性的保护作用统计数据人类基因组DNA直线长2m细胞核直径5umDNA分子被压缩了近一万倍二、DNA的理化性质DNA是生物大分子，因此具有高分子物质的一般性质粘性较大溶液的粘性与溶质分子

4、的不对称性有关两性电解质DNA含有磷酸基团（-）和含氮碱基（+）♦等电点低--中性或弱碱性溶液--带负电电泳技术进行分离的分子基础♦可以与金属离子（Na,K,Mg.Mn）结合成盐DNA+盐（乙醇或异丙醇）DNA沉淀析出♦可以和组氨酸结合使DNA分子更具有稳定性吸收紫外线碱基含有共轭双链(最大吸收波长260nm)♦对DNA样品进行定量分析1.DNA的变性概念：在加热、溶液碱性、有机溶剂、二甲基亜砜、甲酰胺等条件下，DNA双链间的氢键断裂，形成两条单链DNA分子的过程。变化：溶液粘度降低,沉降速率增加,浮力密度上

5、升,紫外线吸收增强增色效应～随温度上升，DNA溶液的紫外线吸收增强，A260nm值♦DNA对紫外线吸收强度与变性程度成正比♦OD260值：双链DNA<单链DNA<单核苷酸融链温度～随温度上升，一半DNA分子变性时的温度(Tm值)♦Tm值与DNA分子中G/C含量呈线性关系估计DNA的GC含量(G+C)%=(Tm—69.3)×2.44估算引物的Tm值Tm=4(G+C)+2(A+T)♦Tm值受介质中离子强度的影响在高离子强度溶液中相对稳定（1mol/LNaCl）某些因素影响下→DNA分子共价键断裂→小片段DNA的过

6、程：DNA降解2.DNA的复性概念：当撤除变性因素后，原变性的两条互补DNA单链通过基配对又重新缔合成为双链结构的过程叫复性。**加热后变性的DNA在温度降低过程中的复性有称为退火影响：温度影响～最适为Tm以下25℃，过高不易复性；过低碱基错配离子强度～足够盐浓度—中和DNA分子携带负电荷—利于复性分子结构～简单序列的、小分子DNA--易发现互补序列-复性快溶液浓度～高浓度DNA溶液较低浓度DNA溶液易复性**影响复性过程的主要因素：复性温度与溶液的离子强度杂交：在复性的条件下，来源不同、但具有碱基互补的DN

7、A单链按碱基配对原则形成双链DNA分子的过程称作杂交。**局部碱基序列具有同源性的DNA分子也能形成局部杂交产物杂交技术：在复性条件下，探针与靶DNA单链形成杂交双链用以分析两核酸分子间的碱基互补程度探针：标记有失踪物的寡核苷酸片段三、DNA的复制和基因表达1.DNA的复制概念：复制是指以原来的DNA为模板合成相同DNA分子的过程复制的基础--碱基互补原方式：♦半保留复制♦半不连续过程：复制的起始双链解开引物合成DNA链延伸5’-3’方向DNA聚合酶复制的终止引物切除缺口连接DNA聚合酶--催化脱氧核苷三磷酸

8、聚合成DNA链的酶条件：必须有引物、复制模板、合成DNA的原料dNTP及微量Mg2+作用：具有合成、切除和校对的综合功能♦大肠杆菌DNA聚合酶I—polA基因编码的多功能酶68kdC端2/35’-3’聚合酶活性—合成103kdN端1/33’-5’外切酶活性—校对作用35kd5’-3’外切酶活性—切除♦真核生物DNA聚合酶—四种酶都具有5’-3’方向聚合作用α—参与核DNA的合成（链合成的引发）β—具