杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达案例

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1、杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达案例杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达案例1.实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统以胞外表达形式获得目的蛋白A。2.实验设计（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（2）选择钟鼎特色载体pFast-bacI，构建表达质粒pFast-bacI-A，转化后通过蓝白筛选方法获得重组的Bacmid表达载体；（3）转染SF9细胞进行蛋白表达，通过WesternBlot检测蛋白A是否表达；（4）通过Ni柱纯化获得目的蛋白A，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度。3.蛋白分析（1）经EditSeq翻

2、译目的蛋白A序列：m.w.=42.62kda，pI=8.46（2）经UniProt匹配，蛋白物种来源：狒狒（3）目的基因稀有密码子分析及蛋白结构分析目的基因稀有密码子分析蛋白亲疏水分析蛋白跨膜结构域分析蛋白信号肽预测分析结果：①目的基因不含昆虫表达体系稀有密码子。②目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、有信号肽序列。结论：将目的基因构建在pFast-bacI载体上，转化后通过蓝白筛选方法获得重组的Bacmid表达载体，利用基因自带信号肽分泌表达，并在目的蛋白C端添加His标签后便于纯化。1.pFast-bacI-A表达载体构建1.1pFast-bacI-A

3、质粒酶切验证：钟鼎特色载体pFast-bacI酶切鉴定Marker:200,500,800,1200,2000,3000,4500Line1:酶切前质粒Line2:酶切后质粒基因名称：A（OD260/OD280:1.82）酶切位点：BamHI/HindIII4.2pFast-bacI-A质粒测序验证：部分序列比对结果图1.重组杆状病毒表达载体（Bacmid，杆粒）鉴定结果5.1质粒浓度表1质粒检测结果SampleIDng/ulVolume(ml)260/280260/230ZD2018B00189510000.051.82.15.2PCR鉴定结果图1重组

4、基因PCR鉴定分析M:DNA分子质量标准；1:重组基因A1.蛋白表达及纯化纯化蛋白WesternBlot鉴定分析M:蛋白质分子质量标准1:纯化蛋白蛋白表达WesternBlot鉴定分析M:蛋白质分子质量标准1:细胞裂解上清2:细胞上清3:细胞裂解上清(阴性)4:细胞上清(阴性)纯化蛋白ASDS-PAGE(reduced)分析M:蛋白质分子质量标准1:纯化蛋白1.实验结论经蛋白表达鉴定WB分析，目的蛋白A在SF9细胞中胞内检测到蛋白表达，胞内蛋白纯化经SDSPAGE分析，目标带位置有单一条带。