杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定).ppt

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1、杆状病毒表达系统疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测&杆状病毒表达系统昆虫细胞的培养重组pFastBac质粒的构建重组Bacmid的产生与鉴定获得重组杆状病毒蛋白表达&病毒扩大OverviewBac-to-BacBaculovirusExpressionSystem能快速并有效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid+辅助质粒Bac-to-Bac表达系统的组成和工作原理Bac-to-Bac表达系统的组成和工作原理Expe

2、rmiantaloutlineInsectCellLines：Sf9orSf21cells——主要用于转染，空斑实验和滴度测定HighFive™cellsorMimic™Sf9cells——转染效率低，主要用于蛋白表达Grace'sInsectMediumwithL-glutamineandsupplementedwith（pH6.5）：3330mg/Llactalbuminhydrolysate3330mg/Lyeastolate350mg/LNaHCO310%heat-inactivatedfetalbovineserum昆虫细胞的培养Atmosphere：air,1

3、00%pipettingacrossthemonolayerscrapingcellscrapershittingtheflaskagainstthepalmofyourhandTemperature：27.0—28.0℃Subculturing：Preservation：90%serum,10%DMSO严格程序降温，-80℃过夜后转移液氮保存。昆虫细胞的培养重组pFastBac质粒的构建选择合适的载体重组Bacmid的产生重组Bacmid的鉴定PCR法:pUC/M13ForwardandReverseprimer或者pUC/M13ForwardorReverseprime

4、randaprimerthathybridizeswithinyourinsertBacmidDNA≥135kb获得重组杆状病毒——转染Sf9cells1.小提好的BacmidDNA，置4℃不超过1周2.转染试剂：Cellfectin®ⅡReagent3.转染后细胞的形态变化细胞变大增殖明显变慢或不增殖裂解脱落融合(VSV/G)或4.收毒，短期内4℃避光保存，长期保存分装后置-80℃病毒扩增&蛋白表达扩增病毒：接毒量为0.05—0.1MOI一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106—1×107PFU/ml，P2代毒滴度1×107—1×108PFU/ml比如：P1代毒滴度为5×

5、106PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量2×107cells，那么蛋白表达：接毒量为1—5MOI杆状病毒滴度测定两种病毒滴度测定方法的比较：空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectiousunitsperml,orIFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法（PFU/ml）更短。BacPAK™RapidTiterKit本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在

6、光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。注意事项：细胞铺板5×106cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染色，保证细胞活力≥95%。2.病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释度孔斑点成10倍关系的关键。3.整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。4.实验完毕3h后数斑，效果更佳。5.结果判定：疫苗免疫动物后免疫效力评价体液免疫检测ELISA抗体中和抗体细胞免疫检测细胞因子mRNA水平检测—qPCR细胞因子蛋白质水平检测—ELISA淋巴增殖实验—MTT法ELISA抗体制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病

7、毒3.设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。（2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提高包被效率。每次包被板子条件一致，4℃16-18h。2.血清样品不溶血，防止干扰结果。方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。微量中和实验技术中和抗体中和实验原理分类固定病毒—稀释血清法固定血清—稀释