《生化实验分析》word版

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1、果蔬成分生化分析果蔬成分的分析主要分为四个方面：维生素C含量的测定、总糖和还原糖含量的测定、蛋白质含量的测定、过氧化物酶的分析。总体从实验目的、实验原理、实验试剂、实验结果和分析的角度进行分析一．实验目的：1、掌握微量测定维生素C的方法和技术。2、了解果蔬中维生素C含量。3、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。4、掌握蛋白质测定的方法和技术。5、了解果蔬中蛋白质的含量。6、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。二．实验原理：1.还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。氧化型染料在中性

2、或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。（此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。）2.蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收。多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就

3、可分别求出总糖和还原糖的含量。3.考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完

4、成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。4.10用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质，主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。5.在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。三．实验试剂：1%草酸溶液、2%草酸溶液、维生素C标准液、氧化型0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液、各种果蔬、蒽酮试

5、剂、标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）、6mol/LHCl溶液、20%NaOH溶液、标准蛋白质溶液、考马斯亮兰G-250染料试剂、0.05mol/LTris－HCl缓冲液（pH6.8）、0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.6、反应混合液。四．实验结果及分析：1.果蔬中维生素C的定量测定操作：1、制备新鲜果蔬液：如洗净新鲜橘子，擦干表面水分，剥去外皮，称20.0g橘子放入50mL量筒中，加2%草酸液至40mL刻度处（即稀释1倍）。用玻璃棒搅拌，静置10分钟，过滤，滤液即是（若样品中含大量铁，可用8%醋酸溶液提取，可在一定程度上延缓

6、Fe2+还原染料）。2、染料液装入滴定管中：应驱除滴定管中的气泡，调整好零点。3、滴定维生素C标准液：吸取1.0mL维生素C标准液放入锥形瓶中，加9mL1%草酸溶液，摇匀，用染料液滴定至微红色保持15秒不褪色即为终点。记下所用去染料液数量，可算出1mL染料相当于多少mg维生素C。4、滴定样品液：吸取10.0mL样品液放入锥形瓶中，同上操作进行滴定。可做两份，求平均值。实验结果：Vc标液用去2,6-二氧靛酚0.3mlV×CW萝卜：20.06g，定容到40ml，每10ml消耗2,6-二氧靛酚：0.85ml;结果得：每一百克样品中维

7、生素C含量m=×100=5.99mgV×CW盘菜：21.26g，定容到40ml，每10ml消耗2,6-二氧靛酚：1.0ml;结果得：每一百克样品中维生素C含量m=×100=6.21mg结果分析：不同果蔬中的维生素的含量不相同，如盘菜和萝卜中的Vc含量有差异，造成这种差异的原因可能是：1.没有将果蔬充分的碾碎，维生素没有完全释放出来，或者一部分残留在实验仪器上；2.在过滤多的时候，没有过滤完全，存在残渣；101.在移液时，常常把液体从一个容器移到另一个容器中，使实验的误差较大；2.在滴定时，没有明确液体刚变红的概念，可能滴得太多

8、；3.滴定的时间花费太长，还原性的物质发生了氧化。2.总糖和还原糖含量的测定操作：1、葡萄糖标准曲线的绘制，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标做图得标准曲线。2、样品中还原糖的提取和测定称取1g实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约