雷帕菌素高产菌株推理选育和发酵新工艺的研究

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1、浙江大学硕士学位论文雷帕菌素高产菌株的推理选育与发酵新工艺研究摘要雷帕菌素是一种由吸水链霉菌(Str．hygroseopicus)产生的含氮的非典型三烯类大环内酯类抗生素，是一种非常重要的免疫抑制剂，已在临床器官移植中得到了广泛的应用。本文首先对雷帕菌素生产的原始菌种进行分离纯化，并通过发酵培养基的优化，确定了较适的发酵培养基和培养条件。最终，雷帕菌素的发酵水平能够稳定在200mg／L以上。从雷帕菌素的生物合成途径出发，构建了去葡萄糖抑制、赖氨酸耐受、莽草酸耐受、双重营养缺陷等筛选模型，在模型指导下，通过紫外诱变进行菌种的理化性选育，最终得到稳定的高产

2、菌株。该菌株的摇瓶发酵水平稳定在450mg／L以上。在120L全自动通用发酵罐上进行了雷帕菌素的放大研究，通过控制和调节不同的搅拌转速试验，结果表明雷帕菌素发酵的最低临界溶氧控制在lO％以上。在此基础上，进行20吨通用发酵罐发酵试验，确定了3个发酵关键点：1)当甘油消耗至1％以下时才进入雷帕菌素产物合成期；2)当甘油补给充分时，L．赖氨酸的流加明显提高雷帕菌素的产率；3)最佳产物合成pH需控制在4．8±0．2。在以上发酵关键点明确基础上，建立起甘油、莽草酸和赖氨酸的流加发酵工艺，在20吨发酵罐上雷帕菌素的发酵水平达到了700mg／L，产量较最初的发酵水

3、平提高了4倍。关键词：雷帕菌素；推理选育；吸水链霉菌；流加发酵；发酵放大3浙江大学硕士学位论文ABSTRACTRapamycinisproducedbyStreptomyceshygroscopicusandatrienemacrolideantibioticwithanti—fungal，anti—inflammatory,anti—tumorandimmunosuppressiveproperties．Ithasbeenwidelyappliedintheclinictreatmentoforganictransplantationasallimp

4、ortantimmunosuppressiveagen仃apamycinproducingstrainderivedfromTheoriginalstrain(str．hygroscopicus)Wasisolatedfromculturemediumandusedfortheoptimizationofmediumcomponentsandcultureconditions．Underthesuitableconditions，theproductivityofrapamycin(200mg／L)Wasachievedwimtheisolatedst

5、rainsafter7dfermentationAccordingtothebiosyntheticpathwasyofrapamycininStr．hygroscopicus，severalscreeningmodelsWasconstructedtogethigh·yieldstrans，includingallieviatingglucoseinhibition，increasingthetoleranceoflysineandshikimicacid，nutritionaldeficienciesoftworelatedaminoacids．B

6、yusingthesescreeningmodel，severalhigh—yieldmutantswereobtainedfromoneUV-mutantionlibraryofStr．hygroscopicus．Thehighestproductivityofrapamycin(450mg／L)Wasattainedintheshakeflaskscalewithonemutant．Theproductionofrapmycinwastestedwithone120一literfermentor．Theresultsshowedthatthelow

7、estlevelofdissolvedoxygenshouldbeover10％forthehigh-levebiosynthesisofrapamycin．Thenfurtheup—scaledfermentationswerecardedoutin20，000literfermentaorinthepilotplant．Theresultsshowedthattherewerethreecontrolpointsduringthewholefermentationprocess，including：1)theproductbegantosynthe

8、sizewhentheconcentrationofglyceroldropeddowntol