基因重组pct蛋白在大肠杆菌中的克隆表达和纯化

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1、第二军医大学硕士学位论文bpCRPDABDNAE．coliII广6IPTGLBODPAGEPCRPCTSDSSIRSBasepairCreactionproteinDiaminobenzidineDeOxymonucleicacidEscherichiacoliIntedeukine．6英文缩略词表碱基对C反应蛋白二氨基联苯胺脱氧核糖核酸大肠杆菌白细胞介素一6Isopropylthio一口一D—galactoside异丙基·口一D-硫代半乳糖苷Luria．BertanimediumOpticaldensityLB培

2、养基光密度Polyacryamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PolymerasechainreactionProcalcitoninSodiumdodecylsulfate聚合酶链反应降钙素原十二烷基硫酸钠Systemicinflammatoryresponsesyndrome系统性炎症反应综合症TNF．aTumornecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子-a"IrisTrihydroxymethylamino—methanee三羟甲基氨基甲烷-4．独创性声明本人声明所呈交的

3、学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印

4、或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日基因重组PCT蛋白在大肠杆菌中的克隆表达和纯化中文摘要中又于茼晏目的：构建降钙素原(PCT)基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法：按人的全长PCTcDNA序列，设计引物用标准的PCR法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a(+)中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化

5、大肠杆菌Ecoli(DH5a)，经异丙基．B．D．硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后，用Ni-NTA亲和层析纯化获取蛋白，用SDS．PAGE和westernblot的方法鉴定。结果：扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Westernblot分析证明目的蛋白有反应性。结论：本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，

6、为进一步获得高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。关键词：降钙素原，克隆表达，纯化第二军医大学硕士学位论文Abstractobjective-ToconstructtheprokaryoticexpressionvectorforprocalcitoningeneandexpressitinE．coli，SOastoobtaintherecombinantPCTproteinwithhi

7、ghyield，lowcostandhighpurity．Methods：Thefragmentmatura

8、tionregionofPeTwasobtainedbyfull-genesyntheticprocedurewithafull-length(exceptsignalpeptide)humanPC'I"cDNAastemplate，andwasinsertedintoplasmidpET-21a(+)bymeansofgenere-arrangement．TherecombinantplasmidpET-PeTwasidentifiedbyrestrictionendonucleaseanalysisandDNA

9、sequencing．FollowinginductionbyIPTG，therecombinantproteinwasexpressedandthenpurifiedbyNi·NTAaffinitychromatographyunderdenaturingconditions．TheinterestproteinwasviewedbySDS—PAGE，fu