榄香烯抗喉癌作用的实验研究

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名学急胞日期：翌!：!型中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，

2、即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文212作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：鲎整丝指导教师签名：霆盘塑日期：翌!：!：兰[：·中文论著摘要·榄香烯抗喉癌作用的实验研究一、实验目的喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤，约占

3、全身恶性肿瘤的1％～5％，在耳鼻咽喉恶性肿瘤中占第三位。我国北方是相对高发地区。目前喉癌的治疗实行综合治疗即根据肿瘤的生物学行为，通过手术、放疗、化疗、生物治疗、中医等手段的合理应用，达到最大程度消灭肿瘤、保留喉功能、提高患者生存率和生存质量的目的。近来临床研究证明，对于局部进展期的喉鳞癌使用新辅助化疗即诱导化疗可增加局部控制率，使用同步化放疗有利于保留喉的功能，减少肿瘤转移和提高患者的生存质量。目前化疗多采用含铂类的化疗方案，常有一定的副作用，造成骨髓抑制、肝肾毒性、感染、胃肠反应、甚至死亡等。所以寻找高效、低

4、毒的化疗药物是亟待解决的问题。实验药理学研究证实榄香烯对体内外多种肿瘤细胞具有较强的抑制和杀伤效应。临床研究也发现榄香烯对多种肿瘤有确切疗效，呈现广谱的抗肿瘤特点。榄香烯不但有直接抗肿瘤作用，而且还有免疫保护作用、与放疗化疗有协同作用，能缓解癌性疼痛、升高白细胞和抑制血小板聚集等作用。相对于大多数化疗药物而言，该药毒副作用小，无明显肝肾功能损害，不发生骨髓抑制，长期使用无耐药性产生。但其抗人喉鳞癌作用机制及地位如何，尚在探讨之中。Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原，是近年来研究最多、最具有前途的细胞增生标记。V

5、EGF．C与其配体VEGFR-3结合，调节肿瘤血管新生以及淋巴管生成，促进肿瘤细胞进入淋巴管，在肿瘤生长和转移的不同阶段都具有重要的作用。本研究主要通过体内外实验观察榄香烯对喉癌的治疗作用，通过免疫组化和逆转录PCR技术检测1067、VEGF．C和VEGFR-3的表达，探讨榄香烯治疗喉癌的机理。二、实验材料和方法(一)实验材料喉鳞癌Hep．2细胞株购自上海中国科学院细胞库。榄香烯乳100mg／20ml(批号：H10960114)购自大连金港制药公司。BALB／e．nu裸鼠40只，购自上海中国科学院实验动物中心，5

6、．6周龄，雌雄各半，体重19．28-22．6689，平均为21．27士0．809。无特定病原体(SpecificpathogenFree，SPF)条件饲养，保持一定湿度、温度(25-28x2)。(二)实验方法1、细胞培养和药物毒性实验：体外培养人喉癌Hep．2细胞，分别以浓度为0(对照)、lO、20、30⋯⋯和120I_tg／ml的榄香烯处理24小时，应用MTT比色法测定不同浓度榄香烯对Hep-2细胞增殖的影响，并绘制剂量．效应曲线；通过透射电镜观察检测细胞凋亡；采用PI单染法用流式细胞仪检测喉癌细胞的凋亡率，测

7、定细胞周期。2、建立移植瘤模型，进行药物干预：每只裸鼠于右耳后下皮下注射lxl09个／L喉癌Hep．2细胞悬液0．2ml，待肿瘤生长25天，至直径>1em时，将40只裸鼠抽签法随机化平均分为两组，任意选取其中一组作为治疗组，治疗前称重，测量瘤体大小，经检验两组动物的体重和瘤体积在处理前差异无统计学意义。两组动物每3天腹腔给药1次，同时测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。每次注射榄香烯120mg／kg，对照组给予同等量PBS液，共给药8次。停药后3天，处死裸鼠，剥离肿瘤，称量瘤重和鼠重，测量肿瘤长、短径，并计算肿瘤体积和抑

8、瘤率。快速将每一例肿瘤组织分为两份，一份一80"C冰箱保存。另一份10％甲醛固定。3、免疫组化SP法检测Ki67、VEGF．C和VEGFR-3的蛋白表达：兔抗人VEGF．C多克隆抗体(rabbitanti-VEGF—c)，编号：ZA．0266,兔抗人VEGFR-3多克隆抗体(rabbitanti．VEGFR-3)，编号：ZA-0267：兔抗人l【i．67单克隆抗体(rab