鸡β防御素8cdna的克隆与在毕赤酵母中的表达

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1、摘要B．防御素属抗菌肽，因具有广谱抗微生物和免疫增强作用以及对病原微生物不易产生抗性等优点而成为当前生物医学的研究热点之一。为探讨B．防御素在巴斯德毕赤酵母系统中的高效表达，本研究以家禽B一防御素Gal．8为研究对象，运用分子生物学技术，从安徽三黄鸡肝脏组织中克隆出Gal．8基因片段，并构建pGEM．TEasyoGal．8克隆重组质粒和pPIC3．5KoGal．8表达重组质粒，诱导表达了融合蛋白GST-Gal．8。具体内容和结果如下：1．应用RNATrizolReagent试剂盒抽提法，从安徽三黄鸡肝脏组织中提取了总RNA。总RNA经1％琼脂糖

2、凝胶电泳后得到两条清晰的条带(28s和18s)，经分光光度计检测OD260／OD280值为1．8，RNA纯度符合实验要求。2．参考GenBank注册的鸡B．防御素eDNA序列(DQ677639)，设计两对引物Pl／P2、Pl／P3，PI／P2扩增Gal．8基因片段，Pl／P3扩增编码成熟肽基因。抽提总RNA用随机引物逆转录合成eDNA第一链，运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，从安徽三黄鸡肝脏组织中克隆出目的基因，对PCR产物进行纯化回收，构建pGEM．TEasy-Gal．8克隆载体。提取纯化重组的克隆质粒并测序，经GenBank的BLA

3、ST比对：克隆安徽三黄鸡Gal．8获得的201bp碱基在第101、117位有碱基变异，同源性达98．3％；分析Gal．8编码框分别由20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、41个氨基酸的成熟肽组成。以pGEM．TEasy-Gal．8质粒为模板，Pl／P3为引物PCR扩增出123bp碱基的Gal一8成熟肽基因片段。3．Gal．8成熟肽基因和pPIC3．5K载体双酶切后连接，构建pPIC3．5K-Gal一8表达载体。对PCR鉴定的阳性转化子进行线性化与纯化，电转化入巴斯德毕赤酵母，以1％甲醇进行诱导表达96小时后，做SDS．PAGE以鉴定所有

4、转化子的表达情况。以上研究表明：本研究成功的运用分子生物学技术从家禽组织中克隆Gal．8基因片段，构建Gal．8克隆载体和Gal．8的成熟肽基因表达载体，甲醇诱导表达了融合蛋白GST-Gal．8。本论文的研究为防御素抗菌肽在畜牧业上的应用与开发提供了一定的研究基础。关键词：家禽Gal．8毕赤酵母克隆表达AbstractBeta-defensinisallantimicrobialpeptideinpoultryandshowesactivityofantimicrobialandfunctionofenhancesimmunityandlitt

5、leisknownaboutresistivityforpathogenicmicrorganism，itisoneofthefocusformanyscholar．Inordertoinvestigatethehighexpressionof13-defensinsinPichiaPastorissystem，thestudymainlyappliedmolecularbiologyandmolecularcloningtechnology．ThefragmentofGal-8wasclonedfromtheliverofThreeYello

6、wBroiler．TherecombiantplasmidofpGEM—TEasy-Gal一8andpPIC3．5K-Gal一8wereconstructed．andtoleadthefusionproteinGST-Gal-8Waspresented．Theresultswereshowedasfollowed：1．TrizolReagentWasadoptedtoextracttheRNAintheliverofThreeYellowBroiler．28sand18sRNAbandswerefoundby1．O％agarosegelelec

7、trophoresis，TheODvaluesofRNAatwavelenghsof260nmand280nmweredeterminatedbyspectrophotometer，TheratiosofOD260／OD280was1．8．TheresultssuggestedthatthepurityofobtainedRNAWashighenoughtosatisfytherequirementofexperiment．2．AccordingtothereportedeDNAgenesequence(DQ677639)ofGallinaci

8、nbeta-defensin，twopairsofprimersweredesigned，Pl／P2amplifiedGal-8geneandPI／P