鸡β-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达

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1、鸡β-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达姓名：庄杰导师：张兴群概述β-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫反应，如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引起人们广泛关注。动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒副作用，无残留，无耐药性，热稳定性和溶解性良好，对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好。因此，防御素越来越受到研究人员的关注。防御素防御素是一类碱性阳离子抗菌肽，相对分子质量为3500-4500左右，分子中含有6-8个保守的半胱氨酸残基，形成3-4对分子内二硫键，并通

2、过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的β-片状结构。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式及前体性质的差异可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素。防御素具有广谱抗微生物作用，包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒，为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。抗菌机理防御素种类多种多样，抗菌谱也各不相同。不同的防御素的作用方式可能不同，同一种防御素与不同微生物作用时机理也可能不同。防御素的杀菌机理主要有以下几种：1.破坏细胞膜，形成离子通道防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合，其疏水部分在疏水作用和分子张力作用下，能够改变细胞膜的

3、流动性和厚度，从而使细胞膜上出现孔洞，导致细胞质外渗或细胞外的物质进入到细胞内，严重时会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡。抗菌机理2.抑制胞外大分子的合成防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。3.抑制胞内功能防御素也能够破坏某些重要的胞内过程，从而促进细胞死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存活更长的时间，这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制的存在。抗病毒机理防御素抑制和杀伤肿瘤细胞的机制与杀菌的机制不尽相同，它比杀菌机制更为复杂。一方面，它能通过其细胞毒性，主要是对细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体

4、和细胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果；另一方面，防御素能通过调动机体免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。防御素的应用现状1在医药行业的应用细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题，防御素因其具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，并与典型的抗生素具有协同作用，能中和内毒素，调节机体免疫应答和炎症反应，调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛关注2在食品行业的应用在食品方面，防御素主要用作防腐剂，防止食品腐败变质。防御素的应用现状3在农业上的应用防御素在农业中可用于农作物抗病育种。4在畜牧业上应用防御素作为饲料添加剂对细菌具有很强的抑制作用，能够促经畜

5、禽生长，提高饲料的利用率，动物在采食以后不会再体内残留。酵母表达系统酵母是目前研究比较成熟的一种表达系统，研究表明，防御素在酿酒酵母中的表达水平较低，而选用毕赤酵母则可获得高效表达，其表达水平高达70mg/L，且重组肽具有与天然肽相似的二级结构和生物活性。酵母表达系统作为外源蛋白表达系统，毕赤酵母有其独特的优势：遗传操作简单；对重组蛋白可以进行翻译后加工修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；具有强有力的乙醇氧化酶(AOXI)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，对工业放大生产有利；毕赤酵母自

6、身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。防御素毕赤酵母的构建及筛选利用TRNzol试剂盒从安徽三黄鸡肝脏中抽提总RNA，并进行电泳检测；根据Genbank中登录的鸡β-防御素-1基因序列，设计一对特异性引物，利用设计的引物扩增Gal-1成熟肽基因片段；将此片段与pMD-18-T载体相连，构建重组克隆载体pMD-18-Gal-1，转化大肠杆菌DH5α后进行鉴定、序列测定；后将测序正确的目的片段与载体pPIC3.5K连接，构建重组表达质粒pPIC3.5K-Gal-1，单酶切后用电转化的方法将构建的重组表达载体整合入毕赤酵母GS115中，然后进

7、行了高拷贝的筛选和表型的鉴定。高拷贝筛选一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。pPIC3.5K含有neo基因，赋予毕赤酵母G418抗性。而G418抗性水平主要依赖整合的neo基因的数目。单拷贝pPIC3.5K整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/mL的G418抗性水平。因此可以通过G418抗性水平初步推断该克隆所包含的拷贝数。高拷贝筛选实验中使用浓度分别为0，50，100，200，300μg/mL的G418来进行高拷贝的初步筛选，然后进一步通过实时定量PCR来验证，两者结果基本一致。但也有研究发现高拷贝与高表达并不一

8、定对应。因此，基因拷贝数对表达量的影响还无法预测，高