apelin对大鼠坐骨神经切断后脊髓前角神经元凋亡的影响

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1、硕士学位论文第二章材料与方法1．材料1．1主要仪器设备DZF一1B型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂)显微手术器械(宁波医疗器械有限公司)10／0无创显微缝合针线(上海医菱医疗器械销售有限公司)HPIAS-1000型彩色病理图文报告分析系统(LKB公司，瑞典)超薄切片机820型(Keichert公司，美国)LDZX一40S型立式自控蒸汽消毒器(上海甲安医疗器械厂)1．2主要试剂生理盐水(中南大学湘雅医学院)，f4％多聚甲醛(中南大学湘雅医学院)10％水合氯醛(中南大学湘雅医学院)Apelin(M一13)(SANTACRUZbiotechnology，INC

2、)SAl022一兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)粘片剂APES(武汉博士德生物工程有限公司)0．02MPBS(PH7．2-7．6)(1000ml蒸馏水中加氯化钠8．59、Na2HP042．89、NaH2P040．49自行配置)0．01枸橼酸盐缓冲液(1000ml蒸馏水中加枸橼酸三钠39、枸橼酸0．49自行配置)DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)原位凋亡细胞检测试剂盒(北京中山公司)1．3实验动物实验动物：健康雌性成年SD大鼠由中南大学实验动物中心提供，清洁级，重量180-～2409。饲养条件：湿度55％～60％，温度：22～24。C。2

3、．方法2．1实验分组硕士学位论文第二章材料与方法取健康雌性成年SD大鼠48只，体重180"--'2409，按手术先后随机分为2组，实验组(A组)：坐骨神经切断缝合后硅胶管内注射Apelin蛋白，对照组(B组)：坐骨神经切断缝合后硅胶管内注射0．9％生理盐水。每组分术后4h、8h、24h、72h、7d、14d6个时相点，每个时相点4只大鼠。2．2动物模型构建取健康成年雌性SD大鼠，建立坐骨神经切断缝合术动物模型：大鼠称重后10％的水合氯醛(400mg／kg)腹腔注射麻醉。右后肢脱毛备皮，再将实验大鼠四肢捆绑固定于手术操作台。络合碘消毒后，铺无菌纱布。取右后

4、肢股后外侧切口长约2．Ocm。依次切开皮肤、皮下组织及筋膜，于股后肌间隙找到坐骨神经，并稍作分离。于距梨状肌下孔0．5am处切断坐骨神经，远端套上硅胶管(内径1．Omm、长1．Oam)，在放大10倍手术显微镜下用10-0无创缝线与近端予以断端神经外膜缝合，将硅胶管移至断端缝合处，给予缝合固定，尽量做到无反折、扭曲，并用凡士林将硅胶管两端封固。实验组：24只大鼠分别用微量注射器术后立即在硅胶管内注入Apelin蛋白抗原30

5、l1。对照组：24只大鼠分别用微量注射器术后立即在硅胶管内注入0．9％生理盐水30

6、ll，伤口内滴入少许庆大霉素稀释液预防感染。最后1

7、号线间断缝合筋膜及皮肤。(如图1-4)术毕。术后标记分笼喂养，所有动物均禁食8小时后，人工按摩膀胱排尿，直至膀胱恢复自动排尿。术后按照实验设计的时间点取材检测。2．3标本采集、制备按照实验设计的时间点，以10％的水合氯醛(400mg／kg)腹腔注射麻醉，取前正中切口，切开皮肤、皮下组织，打开胸腔，剪开左心室置管入主动脉升部，剪开右心耳，用生理盐水快速灌洗至肝脏变白，然后用4％多聚甲醛0．1mol／L磷酸盐缓冲液(pH=7．4)500mL灌注固定。切取L4—6脊髓，标本取出后随即用4％多聚甲醛0．1mol／L磷酸盐缓冲液(pH=7．4)固定，72h后石蜡包

8、埋，连续切片，切片厚度5胁，每隔20张取1张切片，每个标本取10张，分别行苏木精一伊红染色和TUNEL标记检测凋亡细胞。2．4检测指标：苏木精一伊红染色和TUNEL标记检测凋亡细胞2．4．1苏木素一伊红(HE)染色：将L4"--'L6节段脊髓常规脱水、石蜡包埋、横向切片，片厚5IJ,m，每间隔20张留取1张，裱片：然后脱蜡，HE染色，梯度乙醇脱水、透明、封片、观察。4硕士学位论文第二章材料与方法2．4．2TUNEL标记检测凋亡细胞：采用原位凋亡细胞检测(试剂盒，购自北京中山公司)。主要步骤如下：切片脱蜡和水化后，双蒸水和0．05mol／LPBS液(pH7

9、．6)冲洗；蛋白酶K(20mg／L于10mmol／LTris—HCI，pH7．4)37℃水浴槽内消化30min，PBS液冲洗5min×3次；滴力HTUNEL反应液(TdT酶溶液和地高辛标记的核苷酸混合物溶液于使用前按比例混合)，每张切片50ul，37。C孵育60min；PBS液冲洗后碱性磷酸酶转换液(AP—anti—DIG-Fragment)37"C孵育30miraPBS液冲洗后，NBT／BCIP显色5～15mimPBS液冲洗后，核固红对比染色，脱水，中性树胶封固。TUNEL操作过程u帕：切片用二甲苯常规脱蜡，用20pg／ml蛋白酶K消化，滴平衡缓冲液，

10、室温下置10min，加入TdT酶和地高辛一dUTP置于37"C湿盒中60分钟。室