rna干扰抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

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重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。学位论文作者签名：三墨：—二!遁：一一日期：—上立垒丘：jL塑学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或帮分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：丛丛6：笙!翻 重庆医科大学硕士研究生学位论文英文缩写bpcDNACMVDNADABDEPCDMSODNAdNTPHBVHBeAgHBsAgHICCLBMCSM匠IAmlnmRNAmPBSPCRPEGPTGSRNA符号说明英文全称basepaircomplementaryDNAeytomgalovirusdeoxyribonucleicaciddiasecobenzidinediethylpyrocarbunateDimethylsulfoxidedeoxyribonucleicaciddexyribonucleosidetriphophatehepatitisBvirushepatitisBviruseantigenhepatitisBvirussurfaceantigenhourimmunocytotochemistrylufia．bertainmediummultiplecloningsitemicroparticleenzymeimmunoassayminutemessengerRNAnucleotidephosphatebufferedsolutionpolymerasechainreactionPolyethyleneGlycolposttranscriptiongenesilencingribonucleicacid中文全称碱基对互补DNA巨细胞病毒脱氧核糖核酸二氨基联苯氨焦碳酸二乙脂二甲基亚砜脱氧核糖核酸脱氧核苷三磷酸乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e抗原乙型肝炎病毒表面抗原小时免疫细胞化学LB培养基多克隆区微粒子酶免疫实验分钟信使RNA核苷酸磷酸盐缓冲液聚合酶链反应聚乙二醇转录后基因沉默核糖核酸 重庆医科大学硕士研究生学位论文RNAirpmRT-PCRSecshRNAsiRNARNAinterferencerollsperminutereversctranscriptionPCRsecondshorthairpinRNAsmallinterfereneRNA2RNA干扰每分钟转数逆转录PCR秒钟短发夹鼬姐小干扰RNA 重庆医科大学硕士研究生学位论文RNA干扰抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究摘要目的及意义：构建哺乳动物shRNA表达载体，观察shRNA表达载体在细胞水平和机体水平对HBV抗原表达的抑制作用，为应用RNAi技术治疗乙型肝炎奠定一定的基础。方法：本研究将已构建好的I-IBV真核表达载体pHBVl．5，通过限制性内切酶，PCR鉴定确认正确后，转染Hela细胞。用RT-PCR检测皿vCmRNA转录；免疫细胞化学检测HBeAg前体的表达；MEIA分别检测培养上清和细胞裂解液qbHBsAg和HBeAg的表达水平；明确pHBVl．5在Hela细胞中的表达。采用基因重组方法将体外化学合成靶向HBVpreC／C基因的shRNA转录模板的DNA序列克隆到含有人U6启动子的载体pTZU6+I中。通过限制性内切酶，测序对构建的载体进行鉴定确认后，将pHBVl．5与已构建好的shRNA表达载体以不同比例分别共转染Hela细胞，72h后，用半定量PCR和MEIA分别分析shRNA表达载体对HBVCmRNA和HBsAg、HBeAg的抑制情况。再将pHBVl．5以水动力学方法快速(10秒之内)高负荷(2．5ml／只)注射Balb／cdx鼠尾静脉，注射后第6天，分别检测小鼠血清中HBsAg、HBeAg的表达水平；同时取小鼠肝脏组织，用RT-PCR检NHa3VCmRNA的表达，以确认小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型的建立。最后将pHBVl．5与前面体外实验筛选到的干扰作用最强的一个shRNA表达载体(psiHBVl)同样以水动力学方法快速高负荷地共注射Balb／cd、鼠尾静脉，同样于注射后第6天，用半定量PCR和MEIA分析shRNA表达载体对HBVCmRNA和HBsAg，HBeAg的抑制情况。结果：经限制性内切酶，PCR证实已成功构建HBV真核表达载体pHBVl．5，经转染后能3 重庆医科大学硕士研究生学位论文在Hela细胞和Balffed、鼠体内产生HBsAg、HBeAg、并转录HBVCmRNA。通过多次重复实验证实，psiHBVl在细胞水平和机体水平对HBeAg的表达均有显著抑制作用，且抑制作用存在剂量依赖性，而其余两个shRNA表达载体的抑制作用不如psiI-IBVl。三个shRNA表达载体都能不同程度的促进HBsAg的表达。结论：1．观察结果证实真核表达载体pHBVl．5在Hela细胞和Balb／cd、鼠体内均能成功表达HBV相关抗原、分泌产生HBsAg，HBeAg、并转录HBVCmRNA，因此可作为RNA干扰研究的靶载体。2威功构建带U6启动子的shRNA表达载体。3．初步筛选到在体内外均可显著抑制HBeAg表达的psiHBVl。4．本研究设计的三个靶向序列中，只有一个序列有大约70％的抑制率，而另外两个序列的抑制率相对较小，说明RNA干扰作用有较强的序列依赖性。5．无关干扰序列psiC几乎无干扰作用，说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性。以上结果为应用RNAi治疗乙型肝炎奠定了基础。关键词：乙型肝炎病毒，shRNA，RNAi，动物模型4 重庆医科大学硕士研究生学位论文’珊STUDYoFUS矾GRNAITo邛衄rI．T皿EXl慢皿SsIoNOFANnGENoF皿VOBJECTIVE：ToconstructthevectorexpressingshRNA，andtoobservetheeffectoftheRNAinterference．mediatedinhibitiononHBVexpressionintransfectedHelacellsandinmousemodelofacuteHBVinfection．METHODS：Theeukaryoticexpressionvectorcontainin91．5foldHBVaywtypewholegenomeWaSconfirmedbYrestrictionenzymedigestionandPCR．ThenthevectorWaStransfectedintoHelacellsandtheexpressionofHBsAgandHBeAgwasconfirmedbyMEIA、RT-PCRandIHC．ThevectorsexpressingshRNAconstructedbygenerecombinanttechnologywereconfirmedbyrestrictionenzymedigestionandsequencing．BothpHBVl．5andshRNAvectorsweretransfectedintoHelacellswithdifferentratio．After72h，theinhibitionrateWasanalyzedbysemi-quantityPCRandMEIA．HydrodynamicinjectionofnakedplasmidWasusedtoconstructamousemodelofacutehepatitisBvirusinfection．WhentheinfectionWaSconfirmedbydetectionforHBVantigens，theanimalmodelWaSestablishedsuccessfully．ThenpHBVl．5andshRNAvectorswereinjectedintomicetostudytheinhibitionofRNAiontheexpressionofHBVinvivo．TheinhibitionrateWaSanalyzedbymeauringtheHBsAgandHBeAgintheserumofmiceanddetectingtheexpressionofHBVCmRNAintheliver．RESULTS：ThepHBVl．5WasconfirmedbyrestrictionenzymedigestionandPCR．BothHBsAgandHBeAgwereexpressedinHelacellsandmiceaftertransfection．AlsotheshRNAvectorswereconfirmedbyrestrictionenzymedigestion，PCRandsequencing．The5 重庆医科大学硕士研究生学位论文expressionofHBeAgcouldbeinhibitedmarkedlybypsiI-IBVlinvitroandinvivo．TheeffectsoftheothertwoshRNAvectorswerepoorerthanpsiHBVl．AndallthethreeshRNAvectorscouldincreasetheexpressionofHBsAgatdifferentextent．CONCLUSION：1．ThepHBVl．5couldbeexpressedinHelacellsandinmice．2．TherecombinantvectorsexpressingshRNAwereconstructedsuccessfully．3．TheexpressionofHBeAgwasinhibitedbypsiHBVlabout70percent．4．OnlyoneofthethreedesignedsequencessuppressedtheexpressionofHBeAgmarkedly,itindicatedthattheeffectofRNAiwassequencedependent．5．TheinhibiteffectsofthesiRNAwerespecificforthesequence．AlltheseresultindicateditWaspossibletouseRNAiforinhibitingthereplicationofHepatitisBVirusinpatients．KEYWORDS：HepatitisBVirus,shRNA，RNAi，animalmodel6 重庆医科大学硕士研究生学位论文RNA干扰抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究刖罱乙型肝炎(HepatitisB，HB)为世界广泛流行的传染病，估计全球至少有20亿人曾感染过乙型肝炎，大约有3．5亿人成为慢性HBV感染者11J，其中15％一25％的感染者可能因此而发展为严重的终末期肝病一失代偿型肝硬化、肝衰竭或肝癌而死亡[21。乙型肝炎已成为困扰全世界的一个公共卫生问题，在我国其危害尤为突出：我国有7亿人曾感染过HBV，HBV携带者约有10亿，占人口总数的10％，现有慢性肝炎病人1200万，每年因肝病死亡约30万人，其中50％死于原发性肝癌，后者绝大多数与乙型肝炎有关[2】。重组乙肝疫苗的广泛使用[3】’使乙型肝炎的发病率有所下降，但由于母婴传播为我国HBV传播的主要方式，因此而致的I-IBV携带者对疫苗反应较差，故在未来50年中，乙型肝炎仍将是威胁人类健康的重要疾病。虽然重组干扰素、核苷酸类似物(拉米呋啶)对治疗乙型肝炎有一定效果，但是，有相当比例的病人在治疗过程中出现耐药或停止治疗后复发降6J，使得治疗效果大打折扣，前景不容乐观。因此，寻求一种有效治疗乙肝的方法仍然十分必要，RNA干扰(RNAinterference，RNAi)[7]的发现，为其提出了新的治疗思路。RNAi是指利用同源双链小型干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)诱导特异性基因表达抑制。RNAi的发现和应用是科学领域的又一个重大突破，它为肿瘤的治疗，病毒感染的防治，以及基因功能研究等诸多方面的研究提供了一种新思路、新方法【81，短短几年内有关这些方面的研究已获得令人欣慰的成果。RNAi的研究方法较多，其中，用载体表达小发夹RNA(smallhairpinRNA，shRNA)的方法倍受人们关注。本研究以带有人U6启动予的载体为骨架，构建了shRNA表达载体，以带有乙型肝炎病毒全基因的pHBVl．5作为干扰的靶载体，并把两者共转染Hela细胞，探讨shRNA表达载体在细胞水平对HBsAg，HBeAg表达的抑制情况。通过水动力学方法建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型，将体外实验筛选到的具有明显抑制效应shRNA表达载体与pHBVl．5以水动力学方法共注射Balb／cIJX鼠尾静脉，观察其在动物机体内对HBV抗原表达的抑制情况，为将RNAi技术用于乙型肝炎的治疗奠定基础。7 重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分1．5倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的鉴定及表达1．5倍lⅢV基因组是完整的病毒复制体，包含了5’末段重复ErdaI、EnhII，复制起始区(直接重复序列DRl、DR2)，前基因组转录起始位点，x和前c区启动子，x开放读码框等，可产生3．5、2．4、2．1kb等几乎所有HBV特异转录子，编码HBV几乎所有的标志性抗原，包括与病毒感染密切相关的HBsAg，HBeAg，I-IBcAg和HBVCmRNA。其中乙型肝炎病毒的核心区基因由前C区(87bp)和c区(549bp)组成，编码HBeAg前体蛋白、核心抗原(HBcAg)幕DHBeAg，从第一个ATG开始转录翻译的产物便是HBeAg前体蛋白，HBeAg前体蛋白经过加工处理，去除氨基端的19个氨基酸和羧基端的20个氨基酸后方可分泌到胞外成为HBeAg，HBeAg虽然在功能上与病毒的复制无密切关系，即使是HB“g缺失病毒也可继续复制，但HBeAg可引起机体免疫耐受，造成病毒持续感染；同时HBeAg和HBcAg共用同一条3．5KbRNA作为mRNA，故其是RNA干扰抑制病毒复制及抗原表达的理想靶点。本实验通过对pHBVl．5酶切、PCR鉴定，转染Hela细胞，用RT-PCR、免疫细胞化学、MEIA分别检钡UHBVCmRNA、HBeAg前体和成熟的HBeAg、HBsAg的表达，为研究RNAi抑制HBV抗原表达奠定相应的基础。1．实验器材1．1主要试剂：(1)、质粒抽提试剂盒(购于上海华舜生物有限公司)；(2)、限制性内切酶HindlII(购于立陶宛MBI公司)；(3)、PCR反应体系，cDNA合成试剂盒(购于立陶宛MBI公司)；(4)、PCR引物prec／c引物：上游引物P1：5'-AgAATTCAATgCAACTTTITCACCTCTg一3’(28nt)，P2：5'-AggATCCCTAACATTgAgATTCCCgAg一3’(27nt)，扩增片段大小为639bp，(由上海生工合成)；(5)、转染试剂lipofectamine2000(购于Iuvitrogen公司)；(6)、蛋白胨，酵母抽提物(购于Oxoid公司)；8 重庆医科大学硕士研究生学位论文(7)、琼脂糖(购于瑞士罗氏公司)；PCRmolecularmarker(bp)：2000，1000，750，500，250，100(购于宝生物大连有限公司)；DNAmarker(kb)：23．1，9A，6．6，4．4，2．3，2．0，0．6(购于华美生物有限公司)；(8)、抗HBeAg单克隆抗体(购于博士德公司)；微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测试剂盒(美国Abbott公司)；(9)、S-P免疫组化试剂盒(购于福州迈新)；1．2菌种、质粒及细胞(1)、质粒pHBVl．5含乙肝病毒ayw亚型1．5倍基因组全长基因(本室保存)；(2)、Hela细胞(由重庆医科大学肝病研究所任红教授惠赠)；(3)、pcDNA3．1(由重庆医科大学肝病研究所任红教授惠赠)；1．3主要液体(1)、细胞裂解液：0．5％SDS，1％TritonX-100，lmmolEDTA，25mmolTris．cI(PH=7．4)，lmmolPMSF；(2)、PBS(0．01M，PH=7．4)：Na2HP04．1214202．8949，KH2P04O．2619，溶解后加水至1000ml：(3)、RPMll640培养液：内含10％dx牛血清；1．4主要实验仪器核酸蛋白检测仪(瑞典GeneQuant)，核酸电泳仪(美国Bio-Rad)，PCR扩增仪(美国Bio—Rad)，台式离心机(日本三洋)，高速冷冻离心机(德国HETTICH)，恒温水浴箱(德国WB／OB7-45)，凝胶成象系统(美国BioRad)，AXSYM自动免疫分析仪(美国Abbott)，超净工作台(中国VS．1300L．U)，电子天平(美国TS400D)，超低温冰箱(美国FORMA)等。2．实验方法2．1质粒pHBVI．5的制备复苏保存于-70。C的菌种(含质粒pI-t13V1．5)，采用分区划线法接种于含有氨苄青霉素50pg／ml的LB平板上，于37。C孵箱孵育过夜，次日，用接种环挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素50“g／ml的LB液体培养基中，于37。C水浴摇床振9 重庆医科大学硕士研究生学位论文摇培养18h(160rpm)，第三天按说明书的操作步骤抽提质粒，并用核酸蛋白检测仪将质粒定量，置于．20℃保存备用。2．2质粒pl璃V1．5的鉴定2．2．1质粒pHBVl．5的酶切鉴定将质粒pHBVl．5用HindlII酶切，按照以下方案加样：灭菌双蒸水6ulpH]3V1．52ul酶切buffer1ulHindlIIlul37。C水浴反应3h，70℃水浴反应10min，灭活内切酶，取10ul酶切混合物于1．0％的琼脂糖凝胶中电泳。2．2．2质粒pHBVl．5的PCR鉴定以pHBVl．5为模板，用前C／C基因的一对引物Pl和P2进行PCR扩增：灭菌双蒸水32ul10×buffer5ulMgcl23uldNTP7ulP11ulP21ul模板DNAO．5ulTaq酶0．5ul反应条件：94℃3rain，94℃30sec，58"C30sec，72℃1min，30个循环，最后72℃10rnin。取5ul于1．2％的琼脂糖凝胶中电泳。2．3质粒pHBVl．5在Hda细胞内的表达2．3．1质粒pHBVI．5转染Hela细胞接种6X105个细胞于六孔板的一孔中，共9孔，次日待细胞融合到80．90％左右，进行转染。实验分为3组，空白对照组、转染空质粒组和实验组，分别取无血清的1640培养液250pl于两只洁净的EP管中，将质粒与脂质体分别稀释，按照空白对照组(10u1lipofectarnine2000)；空质粒转染组(4I．1gpcDNA3．1与10u110 重庆医科大学硕士研究生学位论文lipofectamine2000)；实验组(4ugpHBVl．5与10ullipofectamine2000)进行加样，5min后把两者混匀，于室温放置20min后加入六孔板中，于转染4h后移去培养液，换入新的含有10％小牛血清的培养液。2．3．2用MEIA分别检测培养上清中l皿sAg，珈BeAg和细胞裂解液中l珀sAg，m3eAg的表达。转染后72h收集培养细胞上清液，离，11,10000rpmx10min，取上清液用MEIA检测HBsAg，HBeAg的表达。同时用消化液消化、收集细胞，用PBS液洗涤3次后转入EP管中，加50ul细胞裂解液，4"C裂解lh后，在液氮与室温间反复冻融3次，4"C离心12000rpmx30min，吸上清用MEIA检测HBsAg，I-／BeAg的表达。2．3．3RT-PCR检测质粒pHBVl．5在Hela细胞中的表达。(1)、TRIZOL提取细胞总RNA转染方法同上。转染后72h，弃去6孔板中细胞培养液，加PBS洗涤2次，加lml／孔TRIZOL溶解细胞，用移液器吹打3次后，分次移出细胞裂解物到一干净的EP管中；将样品在室温条件下孵育5min，以使核蛋白体完全分解，再加入0．2ml氯仿，盖紧样品管盖，用力摇晃EP管15sec，置30"C孵育3rain；在4"C，12000×g高速冷冻离心15min；离心后混合物分成三层：下层(为红色的苯酚-氯仿层)，中间层，上层(为无色的水样层)，将水样层转移到一干净的EP管中，体积约O．5ml，加入0．5ml异丙醇；将混合的样品置室温孵育10min，并在4"C，12000×g高速冷冻离心lOmin；移去上层悬液，加lml75％7,醇洗涤RNA沉淀一次；旋涡振荡混合样品并在4"C，7500Xg高速冷冻离心5min；空气干燥RNA沉淀5min，用移液器分几次移取无RNA酶的水50p1溶解RNA，并于55℃孵育10min，于．70"C保存备用。(2)、DNaseI消化污染的质粒及基因组DNA在微量EP管中配置下列反应液：总RNA40．0u1，10xDNaseIbuffer5．01．tl，DNaseI(RNasefree)2．0ul，RNaseinhibitor(40u／u1)0．5p1，DEPC处理水2．5ul；37"C水浴孵育lh后，加50uIDEPC处理的水和100pl的苯酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)，充分混匀，10000rpm离心10min；将上清移至另一洁净的EP管中，加入100ul氯仿／异戊醇(24：1)，充分混匀，10000rpm离心10min；取上清移至另一洁净 重庆医科大学硕士研究生学位论文的EP管中，加10ul3MNaAc(PH=5．2)混匀，接着加入2001．t1冰冷的无水乙醇，于—20℃放置lh；10000rpm离心10min，弃上清，加入2001-tl70％的乙醇洗涤，弃上清，干燥，50ulDEPC处理水溶解RNA。(3)、RNA逆转录eDNA于冰上制备：总RNA2ul，oligodTlul，DEPC处理水91．tl，混匀，并离心5sec，70。C5rain，并立即置于冰上，短暂离心；按下列顺序加样：5xbuffer41．tl，Rnaseinhibitor1u1，10mmdNTP2ul，混匀并离心，37℃5rain，加入逆转录酶lul，42℃lh，70℃10rain，立即置于冰上。(4)、PCR扩增目的基因用引物P1和P2进行PCR扩增即加灭菌双蒸水32ul，10×buffer5ul，Mgcl23ul，dNTP7u1，P1lul，P21u1，重组质粒O．5ul，Taq酶0．5ul，反应条件为94"C3min，94。Clmin，58。C1min，72"Clmin，30个循环，72"C延伸10rain，于1．5％琼脂糖凝胶电泳PCR产物。2．3．4免疫细胞化学检测质粒在[Ida细胞中的表达。于96孔板中接种2x104个细胞／孑L，次日待细胞融合到80-90％左右，进行转染。简要转染方法是：分别取无血清1640培养液50Hl于两只洁净的EP管中，将质粒与脂质体分别稀释，按照空白对照组(O．5u1lipofectamine2000)；转染空质粒组(0．2ugpcDNA3．1与0．5ullipofectamine2000)；实验组(O．2pgpHBVl．5与O．5ullipofectamine2000)进行加样，5min后将两者混匀，于室温放置20min后加入96孔板中，于转染4h后移去培养液，换入新的含10％d、牛血清的1640培养液，转染后72h弃培养液，加入4％的多聚甲醛，室温固定30min，弃去多聚甲醛溶液，用O．5％的tritonx．100透膜15min，弃去残留液体，每孔加入50ul过氧化酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS液，每孔加入正常非免疫动物血清，室温孵育10min，除去血清，每孔加入50ul鼠抗HBeAg，4"C过夜，PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS液，每孔加入50ul生物素标记的第二抗体，室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS液，每孔加入50“l链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液，室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次3rain，除去PBS液，每孔加入50ul新鲜配制的DAB溶液，显微镜观察10rain，采集图象。3．实验结果 重庆医科大学硕士研究生学位论文3．1质粒pHBVI．5的鉴定3．1．1质粒pHBVl．5的酶切鉴定产生5．4kb和4．8kb大小的两条带，与预期结果相符(Figl·1)。图1—1质粒pHBVI．5的酶切Figl-1pHBVl．5digestedwithrestrictionenzymesLanel：DNAMarkerLane2：pHBVl．5Lane3：pHBVl．5／HindIH3．1．2质粒pHBVl．5的PCR鉴定见一639bp大小的扩增带(Fig1．2)。图1—2PCR扩增前C／C基因Figl-2AmplicationofpreC／CbyPCRLanel：PCRMarkerLane2：pHBVI．5Lane3：pcDNA3．13．2质粒pHBVl．5在Hela细胞内的表达3．2．1用MEIA检测培养上清液及细胞裂解液中的rmsAg，tmeAg表达转染pHBVl．5组的HBsAg和HBeAg在培养上清液及细胞裂解液中表达均为阳性，而转染pcDNA3．1组及空白对照组的HBsAg和HBeAg在培养上清液及细13 重庆医科大学硕士研究生学位论文胞裂解液中表达均为阴性(Table1-1)。表1—1培养上清液及细胞裂解液中rmsAg和HBeAg的含量Table1-1ThequanfitationofHBsAgandnaeAginsupernatantandcell耵sate(x±s'n气3)注：HBsAg(IU／mI)值>0．05为阳性；HBeAg(S／C0)值>1．0为阳性3．2．2前C／C基因的RT-PCR扩增未转染任何质粒和转染pcDNA3．1的细胞，RT-PCR未扩增出目的条带，而转染pHBVl．5的细胞，RT-PCR扩增出639bp大小的条带(Figl·3)。图1—3RT-PCR扩增前C／C基因Figl-3AmplieationofpreC／CbyRT-PCRLane1PCRmarker；Lane2pHBVI．5Lane3cDNAfromcellstransfectedwithpnBVl．5Lane4eDNAfromcellswithouttraasfection3．2．3免疫细胞化学实验结果转染质粒pHBVl．5的部分细胞呈棕黄色，主要分布于胞浆中，胞核中分布较少，而转染pcDNA3．1的细胞和未转染的细胞不显色(Figl·4)。14 图1—4免疫细胞化学技术检测HDeAg前体的表述(x200)Figl-4DetectingtheexpressionofHBeAgbyICCACellstransfectedwithpHBVI．5BCellstransfectedwithpcDNA3．1；CCellsnottransfected 重庆医科大学硕士研究生学位论文4．讨论pHBVl．5(pcDNA3．1-HBV)表达载体是研究siRNA靶向抑制作用的较佳载体。pcDNA3．1含强有力的巨细胞病毒(CMV)增强启动予，能在多种细胞内高效表达插入的目的基因。而且该载体还含有G418抗性基因和具调控作用的SV40启动子，有助于利用G418筛选稳定表达目的基因的细胞。因此用其作为HBVl．5的表达质粒，不仅有助于增强HBV基因的表达，还有助于观察siRNA的靶向抑制作用。pHBVl．5经酶切及PCR鉴定正确后，转染Hela细胞。采用RT_PcR和ME队定量分析，从mRNA转录水平和蛋白质表达水平的分析、检测结果表明，用该载体转染的Hela细胞能有效转录HBVCmRNA，并表达高滴度的HBeAg前体蛋白、成熟的HBeAg和HBsAg(Fig1-3，Table1-1)，用抗HBeAg进行免疫细胞化学检测的结果表明，HBeAg前体蛋白主要分布于细胞浆中，而在胞核中的分布极少(Fig1-4)。这些研究结果表明在有前C基因(87bp)存在的情况下，pHBVl．5可以表达HBeAg前体蛋白，这些前体蛋白在胞内通过内质网和高尔基复合体的3nT处理，成为成熟的HBeAg，分泌到胞外。这与国外的研究报道一致[gqol。本研究结果证实用含HBV全基因组的pHBVl．5表达载体转染Hela细胞后，可表达HBeAg、HBsAg等多种HBV抗原，并转录H]3VCmRNA。这些研究结果表明，利用pHBVl．5表达载体作为HBV的干扰靶基因，可同时观察具靶向抑制作用的siRNA对HBV不同抗原表达的抑制作用，有助于观察分析HBV不同抗原表达和相互作用的关系以及探索HBV不同抗原的功能。16 重庆医科大学硕士研究生学位论文第二部分RNA干扰在IIELA细胞中对HBV抗原表达的抑制作用探讨RNAi技术是近年发现的一种关闭基因表达的新方法，已广泛用于基因功能的研究，肿瘤基因治疗和病毒感染的防治研究。RNAi的发现，为人们提供了乙型肝炎防治研究的新方法，无疑为乙型肝炎的治疗提供了新思路。为进一步探索靶向HBV前C／C区基因的st浓NA表达载体对HBV抗原表达的抑制作用，我们在先前研究的基础上，再次根据前C／C区基因序列设计、构建了3个特异性靶向HBV前C／C区基因的shRNA表达载体和1个无关序列shRNA表达载体。经酶切和测序鉴定确认后，与1．5倍HBV真核表达质粒pHBVl．5共转染Hela细胞，用MEIA和半定量RT-PCR检测这些载体对I-IBeAg和HBsAg表达的特异性抑制作用。为将RNAi用于动物体内实验奠定基础。1．实验器材1．1主要试剂(1)、限制性内切酶SalI、Xbal和PCR反应体系，eDNA合成试剂盒(购于立陶宛MBI公司)；(2)、胶回收试剂盒HBl01(购于Q．BIOgene公司)；(3)、连接试剂盒(购于Promega公司)；(4)、质粒抽提试剂盒(购于上海华舜生物有限公司)；(5)、测序由上海基康生物有限公司完成；(6)、寡核苷酸OLIGO由上海生工合成；(7)、转染试剂lipofectamine2000(购于invitrogen公司)：(8)、胰蛋白胨、酵母抽提物(购于Oxoid公司)；(9)、DNAmarker(kb)：23．1,9．4，6．6，4．4，2．3，2．0，0．6(购于华美生物有限公司)；PCRmolecularmarker(bp)：2000，1000，750，500，250，100(购于宝生物大连有限公司)；琼脂糖(购于瑞士罗氏公司)；(10)、prec／c引物(同上)；内参B—actin引物为P1：5'-gggTCAgAAggATTCCTA17 重庆医科大学硕士研究生学位论文Tg-3’(20nt)，P2：5'-ggTcTcAAAcATgATCTggg一3’(20nt)，扩增片段为226bp；1．2菌种、质粒和细胞(1)、含人类u6启动子的质粒pTZU6+1(美国贝克曼研究所分子生物学研究室JohnRossi教授惠赠)；(2)、质粒pHBVI．5含有乙肝病毒(ayw亚型)1．5倍基因组全长基因(本室保存)；(3)、Hela细胞(由重庆医科大学肝病研究所任红教授惠赠)；(4)、JMl09由本室保存；1．3主要实验仪器核酸电泳仪(美国Bio—Rad)，台式离心机(日本三洋)，高速冷冻离心机(德国HETTICH)，恒温水浴箱(德国WB／OB7．45)，凝胶成象系统(美国Bio．Rad)，微粒子化学发光检测仪(美国Abbott)，核酸蛋白检测仪(瑞典GeneQuant)，超净工作台(中国VS-1300L-u)，电子天平(美国TS400D)，超低温冰箱(美国FORMA)等。2．实验方法2．1shRNA表达载体的构建路线圈(V192．1)。H挪时[，[整固耙甸序列．．●括^晌墨V翦C“基嗣耙铒详列图2—1pTZU6si的构建示意图Fi92-1procedureforconstructionofpTzunsi18④ 重庆医科大学硕士研究生学位论文2．2shRNA表达载体的构建2．2．1序列设计及合成根据ambion公司和invitrogen公司的在线设计软件，针对HBV前C／C基因序列设计了3对寡核苷酸，在其两端加上Xhol和Xba!酶切位点，T1T玎作为转录终止信号，loop选用TCCAAGAGA，并用BLAST软件进行同源性分析。所设计的靶向序列如下：OLIGOI1：5’圃GCCTTCTGACTrCTTTCCTT咂亟巫亘巫酗AAGGAAAGAAGTCAGAAGG圃3’OLIG012：5’勘GCCTTCTGACTTCTTTCC孙垣圃GAAGGAAAGAAGTCAGAAGGC．37OLIG021：5’圃GGGTGTTAATTTGGAAGATCc匮亘垂圃GGATCTTCCAAATTAACACC咂亘虱3’OLIG022：5’脚GGGTGTTAATI'TGGAAGATcc圃GGATCTTCCAAATTAACACCCG’OLIG031：5’垣囵GGGCCTAAAGTTCAGGCAAcl厘亘巫画GTTGCCTGAACTTTAGGCCC匣亟虱3’OLIG032：57勘GGGCCTAAAGTFCAGGC从cT叵亘亘匦囵AGTTGCCTGAACTTTAGGCCC．3’无关序列为：OLIGOCl：5’垣勘CTTAGAGTCTCCTGA(神叵亟函画CTCAGGAGACTCTAAGG匝虱7OLIGOC2：5’勘GCCTTAGAGTCTCCTGAGc厘亟亘圃GCTCAGGAGACTCTAAGGC．372．2．2寡核苷酸的退火将以上合成的寡核苷酸溶于100p】灭菌的双蒸水中，分别取OLIG01】和OLIG012各511l，加入到含有5ul100mmol的Nacl的EP管中，混匀，于94℃水浴5rain后，关掉水浴电源，待其自然冷却，以使其复性为双链。同法处理OLIG021和OLIG022，OLIG031和OLIG032，OLIGOCl和0LIGOC2。2．2．3载体的双酶切及回收按下列方案加样，用SalI和Xbal双酶切pTZU6+119 重庆医科大学硕士研究生学位论文灭菌双蒸水1lplpTZU6+I10p1双酶切buffer6p1SalI1．5ulXbal1．5ul于37。C反应3h，75。C10rain灭活内切酶，取酶切混合物于1．0％的琼脂糖凝胶中电泳。30rnin后用手术刀片切取经酶切的目的片段，再按照胶回收试剂盒HBl01说明回收相应片段，并溶于灭菌双蒸水中备用。2．2．4载体与退火寡核苷酸的连接按下列方案加样，制备连接反应混合物灭菌双蒸水pTZU6+I的双酶切产物退火的寡核苷酸片段10×连接bufferT4DNA连接酶于16"(2连接过夜。2．2．5转化连接产物4ulu13ululpl按以下步骤制备感受态细胞取JMl09菌种分区划线接种于LB平板I37。C孵箱过夜挑取单个菌落l接种到3mlLB培养液中437"C水浴摇床(160rpm)过夜取O．5ml加入到装有50mlLB培养液的三角烧瓶中l3TC水浴摇床(160rpm)4h取10ml加入一洁净的玻璃离心管中，l10000rpm离心5min弃上清，加入lml新鲜的LB液体培养基，混匀细菌沉淀 重庆医科大学硕士研究生学位论文I加lml2XTSS液，混匀I按1001．t1／管分装入新的EP管中，保存于一70。C备用吸取于-70。C保存的感受态细胞100li1，置于冰上自然解冻，加入连接产物5ul，混匀，置冰上30min；42。C热休克90sec，迅速置于冰上2min，接着置于37。C5min；加入预热的LB培养液lml，于37℃水浴摇床120转／min摇动培养1h；取200u1铺于含有氨苄青霉素50ug／ml的LB平板上，于37。C孵箱培养过夜。2．3重组质粒的鉴定2．3．1重组质粒快速鉴定次日见培养基上有10多个菌落形成，随机挑取8个菌落分别接种于含有50lag／ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，并于37。C水浴摇床160rpm摇动过夜，次日各取0．5ml菌液装入一新的EP管中，10000rpm离心5min，弃去大部分上清，留少许，并用旋涡混匀沉淀和留下的少许上清，加入70ul饱和酚混匀，室温静置或37。C水浴10min，13000rpm离心15min，取15ul上清于O．8％的琼脂糖电泳，根据电泳结果分析，取阳性克隆的菌液进行质粒抽提，用于鉴定。2．3．2重组质粒的抽提及定量抽提质粒，方法同前。并将质粒用核酸蛋白检测仪定量，一20。C保存备用。2．3．3重组质粒的酶切鉴定灭菌双蒸水15ul，加入重组质粒2ul、酶切buffer2ul、Saillul(或Xballu1)于37*(2反应3h，75。C灭活内切酶，取10ul酶切混合物于1．O％的琼脂糖凝胶中电泳。2．3．4重组质粒的测序鉴定将上述经酶切鉴定确任的阳性克隆菌液保存于20％的甘油中，储存于．70。C，并送交上海基康生物有限公司进行DNA序列测定。分别命名测序正确的质粒为psiHBVl，psiHBV2，psiHBV3，psiC。2．4shRNA表达载体与目的基因载体的共转染实验分为5组，目PpsiC组、psiHBVl组、psiHBV2组、psiHBV3组和对照组；每组设6个复孔(其中3个复孔用于MEIA检测，3个复孔用于RT-PCR半定量检测)。21 重庆医科大学硕士研究生学位论文接种Hela细胞(6x105个细胞／孔)于六孔板中，次El待细胞融合到80．90％左右，共转染psiHBV和pHBVl．5。共转染的简要操作程序是：分别取无血清的1640培养液250ul于两只洁净的EP管中，按Table2-1设计方案进行加样(即于一只EP管中JJflA．psiHBV／psiC和质粒pHBVl．5，另一只EP管@3IL,X,lipofectamine2000，此时，pHBVl．5与psi的转染比例为1：3)，5min后将质粒稀释液和脂质体稀释液两者混匀，于室温放置20min后，加入六孔板中。于转染4h后移去培养液，换入新的含有10％d、牛血清的培养液。表2—1共转染质粒的组成(pHBVl．s：psi=l：3)Table2-1Thecompositionofco-transfectedplasmids(pHBVl．5：psi=l：孔当pI-IBVl．5与psi以1：5比例转染时，各组的加样量分别为3．31．tg，pHBVl．5为O．7ug，lipofectamine2000为10lal；当pHBVl．5与psi以l：7比例转染时，各组的加样量分别为3．5ug，pHBVl．5为0．5ug，lipofectamine2000为10ul。2．5RNA千扰效果的观察2．5．1RT-PCR检测目的基因的表达情况(1)、TRIZOL提取细胞总RNA(方法同前)，放于一70。C备用；(2)、DNaseI消化污染的质粒及基因组(方法同前)；(3)、RNA逆转录cDNA(方法同前)；(4)、PCR扩增目的基因；接着分别用prec／c的引物和B-actin的引物进行分管PCR扩增，扩增B．actin和prec／c的反应条件均为94"C3min，94。C1min，58。Clrain，72"C1rain，24个循环，72"C7min。当pHBVl．5与psi以1：3和l：5转染时，取prec／c弓l物的PCR产物和B—actin；l物的PcR产物各5ul混匀，当pHBVl．5与psi以1：7转染时，取prec／c引22 重庆医科大学硕士研究生学位论文物的PCR产物和B．actin弓I物的PCR产物各15ul混匀，于1．5％的琼脂糖凝胶电泳，成像，并采用Bio—Rad的QantityOne进行图象扫描分析，以prec／c与B-actin93灰度比值A作为比较指标，抑制率=(AN月q—A女＆m)／Anm目×100％。2．5．2MEIA检测nmAg和naeAg的表达水平于转染后72h，收集培养液上清及细胞裂解液，用MEIA法检测上清及细胞裂解液qbHBsAg的含量N(IU／m1)和HBeAg的含量N(S／CO)，并计算抑制率，抑制率=(N”M组一N宴验组)／N对麒组×100％。2．6统计学方法：数据用x±s表示，采用SPSSl0．0进行方差分析，P<0．05认为差异有显著性。3．实验结果3．1重组质粒的鉴定3．1．1重组质粒的酶切鉴定由于合成的寡核苷酸退火后在其两端均具有Xbal和XholI的结合序列，而SalI和XhoI是同尾酶，所以合成片段可以与用SalI和Xbal酶切的载体连接，连接以后，重组质粒具有Xbal的识别序列，而SalI和XhoI的识别序列消失，故只能用Xbal线性化重组质粒，而SalI和Xhol不能线性化重组质粒。重组质粒psiHBVl，psiHBV2，psiHBV3及psiC经酶切鉴定正确，与预期结果相符(Fi92—2，2-3)。图2—2质粒lBirmvl,2,3的酶切电泳结果n醇-2psillBVl,2,3digestedwithrestrictionen巧nmes 兰壅堕翌查兰堕主里塑生兰堡堡苎LanelDNAMarker；,Lane2pTZU6+I；Lane3pTZU6+I／SaH；Lane4pTZU6+l／Xbal；Lane5psiHBVl；Lane6psiHBVl／SaH；Lane7psiltBVl／Xba|；Lane8psiitBV2；Laae9psiHBV2／Sail；Lanel0psiHBV2／Xbal；LanellpsiHBV3；Lanel2psiHBV3／SaH；Lanel3psiHBV3／Xbal图2—3质柱psiC的酶切电泳结果Fi92-3psiCdigestedwi恤restrictionenzymesLanelDNAMarker；,Lane2pTZU6+I；Lane3pTZU6+I／SaH；Lane4pTZU6+I／Xbal；Lane5psiC；Lane6psiC／Sail；Lane7psiC／Xbal3．1．2重组质粒的测序鉴定(1)、psiI-IBVl的序列GCCTATGATACTGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTITI'AAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTAllWGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC丽飘TAGAGC(JGACTTCGGTCCGCTT'ITTACTAGGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTI'CCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCC_r兀AGGGTf2)、psiHBV2的序列GCCTATGATACTGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTlTrAAAATTAT(3'ITrTAAAATGGACTATCATATGCTFACCGTAACTTGAAAGTATTTCGA'ITTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG 重庆医科大学硕士研究生学位论文阴影处为插入的寡核苷酸序列，匡圈为U6启动子的转录终止信号，匦霪鎏垂圈为loop序列。测序结果与合成序列一致，无任何碱基突变。3．2RNA干扰效果的观察3．2．1RT-PCR检测pree／cmRNA的转录情况psiHBVl转染组中HBVCmRNA的表达明显减少，抑制率为30．64蜘一53．75％，而psiHBV2，psiHBV3及psiC转染组中HBVcmRNA表达的减少相对较小(Fj醇一4，2-5，2-6)。 重庆医科大学硕士研究生学位论文甜直分别为1．24o．861．331．111．20抑制率分别为(％)o30．647．2610．483．23图2—4前C／CmRNA半定量(pHBVl．5：psi=lz3)Fi92．．4semi-quantitationofprer3emRNAbyFCRLane1controlgroup；Lane2psiJ__IBVlgroupLane3ps证lBV2group；Lane4psiHBV39roupLane5芦iCgroupA值分别为o．56o510．270,530．49抑制率分别为(％)o8．9351．785,3612．50图2—5前C／CmRNA半定量(pHBVI．5：pst=l：5)Fi醇-5∞mi--quantitafionofptxKJcmRNAbyPCRLane1controlgrou；Lane2psiCgroupLane3psiItBVlgroup；Lane4psiHBV2groupLane5psiltBV39ronp 重庆医科大学硕士研究生学位论文A值分别为1．600．741．631．381．58抑制率分别为(％)053．751．8813．751．25图2—6前C／CmRNA半定量(pHBVl．5：psi=l：7)Fi92_6∞mi．quantilationofpree／cmRNAbyPCRLanelPCRmarker,Lane2controlgroupLane3psiHBVlgroup；Lane4psiHBV2groupLane5psiHBV39roup；Lane6ps-Cgroup3．2．2MEIA检测nmAg和rmeAg的表达3种psiHBV对HBeAg的表达均有不同程度的抑制作用，psiHBVl对HBeAg的表达呈现显著的抑制作用(PO．05)(Table2—2，2-3，Fi92—7，2-8，2-9，2-10，注：图中R表示pHBVl．5与psi之比)。 重庆医科大学硕士研究生学位论文表2—2培养液上清HIhAg，IjmeAg的定量Table2-2．ThequanfitafionofHBsAg，HBeAginsupernatantbyMEIA(x±s’n-3)表2—3细胞裂解液中lmsAg，HBeAg的定量Table2-3．Thequantitationof胁Ag，HBeAgincelllysatebyMEIA(x±s'n=．3)注：括号内数字为抑制率。28 重庆医科大学硕士研究生学位论文图2-7MEIA检测细胞培养上清中HBeAg的舍量Fi92。7Thequantitation(S／CO)ofHBeAgincellsupernatantbyMEIA圈2-8MEIA检测细胞裂解液中HBeAg的含量Fi92-8Thequantitation(S／CO)ofHBeAgincelllysatebyMEIA 重庆医科大学硕士研究生学位论文图2-9MEIA检测细胞培养上清中HBsAg的含量Fi92-9Thequantitation(IU／m1)ofHBsAgincellsupernatantbyMEIA图2-10MEIA检测细胞裂解液中HBsAg的含量Fi92·10Thequantitation(IU／m1)ofHBsAgincelllysatebyMEIA 重庆医科大学硕士研究生学位论文4．讨论4．1本研究构建的shRNA表达载体的特点是：(1)、该载体含有人u6启动子，属RNA多聚酶III启动子。该启动子主要特点有：①能在正常情况下转录小的、非编码性的转录子，并且在转录后不经过带帽和聚腺苷酸化；②使用polIII启动予的质粒表达载体所产生短的RNA片段可以在哺乳动物细胞中引发RNAi反应，而不会导致非特异干扰素反应的发生[11-14]；③选用PolIII启动子的原因在于它可以在哺乳动物细胞中转录出许多小分子RNA，而且PolIII启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4．5个连续的u即终止转录，转录起始位点非常精确，可以准确控制转录产物的长度，这一点对于把握siRNA的长度至关重要，而精确的长度更有利于产生高效RNAi；④由RNaselII(Dicer)切割产生的siRNA分子在3’端有两个或三个突出的碱基，这种结构特征对于siRNA分子能否有效的抑制基因表达是非常重要的，并且37末段有两个尿嘧啶(uu)的siRNA分子比37末段有两个(从)、(CC)、(GG)的siRNA分子更能有效的抑制基因的表达；⑤启动子下游存在57．nⅥ●37序列为U6启动子提供转录终止信号，同时在第二个胸腺嘧啶处剪切，产生带有两个尿嘧啶的末端，与体外合成的siRNA分子非常相似；⑥siRNA质粒表达载体的优点在于可以进行较长期研究，带有抗生素筛选标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。⑦u6启动子+1位的G能赋予U6启动子较高的转录效率[15q6]。⑧另外一点，它可以不断地在体外复制扩增小干扰RNA，与化学合成比较而言，这种方法可以大大降低siRNA的制备费用。(2)、shRNA表达载体插入位点选用SalI和Xbal内切酶位点，因为SaU位点GTCGAC的第一个碱基是G，因此可以增强u6启动子的转录效掣⋯。实验设计时，在插入片段两端加上Xhol和Xbal位点，由于Xhol与SalI是同尾酶，插入片段可以和用Sall和Xbal双酶切的载体连接，连接以后SalI位、Xhol位点消失，因．t比：Xhol、SalI皆不能线行化重组载体，而Xbal可以线性化重组载体，可以利用这一特点来简单方便地鉴定重组载体。(3)、本研究构建的shRNA表达载体的作用机制是：载体导入细胞以后，可以在U6启动子的调控下，不断地转录产生RNA，RNA可以在胞内退火形成shRNA，shRNA进一步被核酸酶水解为RNAi的效应分子siRNA，从而与目的基因的mRNA31 重庆医科大学硕士研究生学位论文相结合，进一步水解目的基因的mRNA，从而抑制靶基因的表达[协阁。而产生的siRNA可作为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖性RNA聚合酶的帮助下产生新的长链dsRNA，如此循环反复，产生级联放大的瀑布效应，使得极少量的siRNA即可引起同源基因沉默。总之利用本载体进行RNAi研究，能够有效、持久地产生靶向目的基因的shR．NA，从而有助于评价其抑制靶基因的效果。4．2靶n司nBvpree／e基因的s枞表达载体可有效抑制皿BeAg表达(1)、选择HBVprec／c基因作为干扰靶基因HBV基因组由3．2kb的不完全双链开环DNA所构成，包含一条长的负链和长度可变的短的正链，以及c区(前C／c基因)，P区(P基因)，S区(s基因，前S2基因，前sl基因)和x区()(基因)4个重叠的开放读码框架。其在宿主细胞RNA多聚酶的作用下，以负链DNA为模板，可转录形成长度分别为2．4kb／2．1kb、3．5kb和0．7kb的RNA。本实验选择HBV前c／c基因作为RNA干扰靶基因，主要是基于：①3．5kbRNA既可作为I-IBV负链DNA复制模板的前基因组RNA，又可作为DNA多聚酶、HBeAg和HBeAg转译、转录的mRNA，因此其在子代病毒大量复制中起重要作用。据此事实不难设想，若利用siRNA诱导产生的靶向降解同源mRNA的作用，切断此条mRNA，有可能导致HBV复制模板减少、DNA多聚酶、HBeAg和HBcAg不能合成或合成减少；同时也可能避免由于前c区突变，前C／C蛋白在细胞内堆积所致的重症肝炎；无疑还可能控制因HBeAg所致的免疫耐受而造成的病毒持续感染。②根据HBeAg产生的遗传控制特点设想，选择靶向preC／C基因(e抗原编码区)的shRNA表达载体，观察其对HBV复制和其它抗原表达的影响，有可能揭示HBeAg在病毒复制过程中的功能作用。③前c／c基因相对较小，易于筛选到干扰靶位点。(2)、靶向髓Vprec／c基因的shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用本研究结果显示三种psiHBV对HBeAg的表达均有不同程度的抑制作用，而且其对HBeAg表达的抑制强度随其转染比例的增加而增强，呈现量效依赖关系(Table2．2、2-3，Fig2-4、2-5、2-6)。与空质粒对照组比较，psiHBVl对HBeAg的表达呈现显著的抑制作用。其培养上清中的HBeAg的抑制率为61．69％～71．39％；细胞裂解液中的HBeAg的抑制率为44．89％～52．94％。这些研究结果不仅充分表明靶向HBVprec／c基因的shRNA表达载体能够特异而有效地干扰HBeAg的表达，而且 重庆医科大学硕士研究生学位论文研究结果结合前述理由还提示通过靶向HBVpreC／C基因的psiHBVl表达载体抑制HBeAg表达，不仅有可能减少病毒复制，而且还有可能避免重症肝炎和持续性HBV感染的发生。另外，实验结果,显示psiI-IBVl对HBeAg的表达的抑制作用在mRNA和蛋白质的水平上不平衡，这可能是实验造成的误差，也有可能是mRNA和蛋白质的时相上的差异造成的。我们之所以选择在转染后72h检测干扰效应，是因为实验所选用的Hela细胞每24h分裂一次，最大沉默效应出现在转染后72h左右。(3)、靶向HBVprec／c基因的shRNA表达载体的靶向性，特异性我们在观察本研究结果时惊奇地发现靶向前C／C基因的3种psiHBV不仅不能抑常tJHBsAg表达，而且有促进其表达的作用，它们对I-IBsAg表达的促进作用亦随其转染比例的增加而增强，并与HBeAg表达的抑制程度呈负相关关系。与空质粒对照组比较，psiHBVl对HBsAg表达呈现显著的促进作用，其致细胞培养上清中HBsAg表达的增加率为87．97％～97．44％；细胞裂解液中HBsAg的增加率为122．24％～191．19％(Table2-2、2-3)；此实验结果不仅与我们预期的、靶I句preC／C的shRNA有可能同时抑制FIBe和HBs抗原表达结果不一致，而且与国内外某些研究报道、靶preC／C的shRNA可同时抑制HBe和HBs抗原表达的结果亦不相符。然而我们认为该结果似乎更符合siRNA作用具靶向性、特异性的特点。因为1．5倍HBV基因组是完整的病毒复制体，能转录形成3．5kb，2．4kb，2．1kb和0．7kb四种mRNA，HBeAg和HBsAg分别由3．5kb和2．4／2．1kbmRNA转译产生，而我们所设计的psiHBV是靶向前C／C基因的，因此只能够特异性降解3．5kb的mRNA，抑制FIBeAg表达，而不能抑制HBsAg表达。这可能就是为什么psiHBVl只对I-[BeAg有效而对HBsAg无效的原因。而psiHBVl促进HBsAg的增加的原因，我们初步设想可能是由于HBsAg与HBeAg之间存在着互为调节，彼此消长的关系，但具体机制如何，还有待进一步实验证实。实验中我们观察到与靶序列无关的psiC几乎没有干扰作用，说明siRNA产生的干扰作用具有高度的特异性。(4)、调节HBsAg抗原表达有可能是HBeAg的重要功能我们使用靶I甸PreC／C基因的shRNA表达载体能显著抑带tJHBeAg、增]31]I-IBsAg产生的结果无疑提示抑制或调节HBsAg产生可能是HBeAg的重要功能。根据我们的实验结果，结合I-IBeAg与病毒复制、DNA多聚酶和HBsAg的消长规律，以及存在于HBV感染细胞表面HBsAg是特异性CTL攻击、杀伤HBV感染细胞的重要标记 重庆医科大学硕士研究生学位论文的基本事实，我们推断HBeAg作为调节蛋白有可能通过以下两种方式抑制或调节HBsAg产生，诱导免疫耐受和免疫功能紊乱，以保护成熟的HBV颗粒和HBV感染细胞，不受免疫攻击：①在HBV感染早期(al】I-IBV复制期)调节HBsAg适时、适度表达，从而避免因其过早、过度表达诱导特异性CTL和抗体产生所致的HBV感染细胞损伤，以使HBVfl＆够完成在细胞内的复制过程。②HBeAg可在HBV完成其复制增殖过程后消失，解除对HBsAg产生的限制作用，以促使产生大量仅FhI-IBsAg组成的小球形颗粒和管形颗粒，以封闭，阻断特异性抗体和CTL细胞对HBV感染细胞和Dane颗粒的清除、杀伤作用，从而保护在肝细胞内复制的HBV不被清除。或许I-IBeAg就是通过这种重要保护机制来保i正HBV在细胞内有效复制和在细胞外扩散。HBeAg作为一种免疫调节因子可抑制T细胞的细胞毒活性；前c区Ca83变异不再产生HBeAg时，可使CTL细胞毒作用增强，肝细胞遭受严重损伤，致使病变加重；大量HBeAg[弱性的HBsAg持续带毒者、终生感染者及慢性肝炎存在的事实似乎也支持上述推论。这或许也正是HBsAgI扫单独的2．1KbRNA作为mRNA转译产生和编]I目JHBsAg的s区段基因可与肝细胞DNA整合，使其可在I-IBV已从细胞内消除，肝细胞仍能不断复制衄sAg的原因。因为只有具这种结构特点和产生机制的HBsAg编码基因，才能够被有效调控，而且也只有表面抗原的产生受到有效控制，才可能有效保护HBV和皿V感染细胞不遭受强烈的免疫攻击，而使HBv能够在体内长期生存。这或许也是国外一些学者认为许多慢性HBV感染缺乏自发性病毒清除，而成为终生感染的重要机制。4．3RNAi靶位点的选择是靶向抑制基因表达成败的关键(1)、靶位点选择的重要性本研究结果证实在所构建的3个具不同序列、靶向preC／C基因不同部位的shRNA表达载体仅psiHBVl能够非常有效的沉默preC／C基因，抑制HBeAg表达，而psiHBV2和psiHBV3无论在mRNA水平还是蛋白质水平的抑制作用都不及psiH]3V1。这一研究结果支持siRNA抑制靶基因表达的有效性，在很大程度上取决于其靶向的mRNA部位及与靶mRNA序列的匹配程度的结论，无疑亦提示siRNA靶位点的选择是靶向抑制基因表达成败的关键‘协20]。因靶向的mRNA部位及其与靶mRNA序列匹配程度不适当，导致siRNA不能有效抑制靶基因表达的现象，称为siRNA的靶向偏离作用(off-targeteffects)[21-22]，克J]艮siRNA的靶向偏离作用是今 重庆医科大学硕士研究生学位论文后将siRNA用作治疗制剂必须面临的严峻挑战。最近的研究证实采用推理设计运算法则(rationaldesignalgorithms，即Darmachon或Invi仃ogen公司的smartdesign方法)，设计合成多个靶向siRNA分子，再通过实验寻找理想，高效的siRNA，有可能提高siRNA的抑制效率，克服siRNA的靶向偏离作用，从而获取高效、特异抑制靶基因表达的功能性siRNA(functionalsiRNA)。因此本研究参照靶位点的优化设计理论【2”51，利用ambion公司和invitrogen公司的在线设计软件，结合载体表达的shRNA能在细胞或体内更稳定、更持久地发挥抑制作用的研究结果，针对HBV前C／C基因序列设计并构建了3个靶shRNA表达载体，通过实验从中筛选到能显著抑常lJHBeAg表达的psiI-1]3Vl表达载体。(2)、干扰靶位点的选择原则本研究与其它许多研究均证实RNAi位点的选择是实验成败的关键，但研究实践发现靶位点的选择有一定的不确定因素，并非所选择的每个位点都有显著的抑制作用，其对靶基因的抑制效率需经过实验验证、确定。有的学者认为RNA的二级结构的存在影响了siRNA与mRNA的结合，导致RNA诱导产生的沉默复合物不能切割目标RNA[261，也有学者认为靶位点的选择与RNA和蛋白质的结合状态有一定的关系【271。目前，国内外的研究小组多以在以往的经验基础上，通过增加靶位点的数量来提高siRNA的成功率【28】。本研究靶位点选择的大致原则是：①选择以AA开始，后面紧接着19或者21的核苷酸的序列；②Gc含量大约在30．50％；③在序列后面加上5-6个T作为转录终止信号；④尽量避开mRNA的二级结构区；⑤尽量不选ATG开始的前100个核苷酸以内序列和后100核苷酸以内的序列。 重庆医科大学磺士研究生学位论文第三部分RNA干扰对小鼠急性乙型肝炎病毒感染的抑制作用前面我们采用RNAi技术，证实了psiHBVl在体外能显著抑制HBeAg的表达。但是在体内效果如何，却不得而知?由于乙型肝炎的宿主范围极窄，只有黑猩猩等灵长类动物支持HBV的复制研究，但在实验的早期用灵长类动物作为动物模型来评价RNAi的效果，困难是显而易见的。为克服这些困难，本实验中，我们利用水动力学方法，将含1．5倍乙型肝炎病毒全基因的真核表达载体以快速，高负荷的方式注射Balb／c小鼠，建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型。并在此基础上，将RNAi技术应用于小鼠急性乙型肝炎感染的体内模型，以观察并评价psiHBVl表达载体在体内能否抑制乙肝病毒抗原表达，为今后将RNAi技术用于乙型肝炎的临床治疗奠定一定的基础。1．实验器材1．1主要试剂(1)、质粒大量抽提试剂盒(QIAGEN公司)；(2)、cDNA合成试剂盒，PCR反应体系(购于立陶宛MBI公司)；(3)、RNA提取用TRIZOL(购于Invitrogen公司)(4)、MEIA试剂盒(美国ABOTT)；(5)、PCRmolecularmarker(bp)：2000，1000，750，500，250，100(购于宝生物大连有限公司)；(6)、PCR引物pree／c引物：上游引物P1：5'-AgAATTCAATgCAACTITIq'CACCTCTg．3’(28nt)，P2：5’-AggATCCCTAAATTgAgATTCCCgAg一3’(27nt)，扩增片段大小为639bp(由上海生工合成)；(7)、内参B—actin的引物为P1：5'-gggTCAgAAggATTCCTATg一3’(20nt)，P2：5'-．ggTCTCAAACATgATCTggg-3’(20nO，扩增片段大小为226bp(由上海生工合成)；(8)、胰蛋白胨、酵母抽提物(购于Oxoid公司)； 重庆医科大学磺士研究生学位论文1．2动物及质粒(1)、4-5周龄Balb，c小鼠(四川大学华西医学中心实验动物中心提供)：(2)、含人类u6启动子的质粒pTZU6+1(美国贝克曼研究所分子生物学研究室JohnRossi教授惠赠)；(3)、质粒pHBVl．5含有乙肝病毒ayw亚型1．5倍基因组全长基因(本室保存)；(4)、含人U6启动子及干扰序列的质粒psiHBVl(第二部分构建)；(5)、含人U6启动子及无关于扰序列的质粒psiC(第二部分构建)；13主要实验仪器核酸电泳仪(美国Bio．Rad)，台式离心机(日本三洋)，高速冷冻离心机(德国HETTICH)，恒温水浴箱(德国WB／OB745)，恒温振荡培养器(哈尔滨HZS—HA)，凝胶成象分析系统(美国Bio．Rad)，核酸蛋白检测仪(瑞典GeneQuallt)，微粒子化学发光检测仪(美国AXSYM)，梯度PCR仪(德国EppendorD，超净工作台(中国VS．1300L-U)，电子天平(美国Ts400D)，超低温冰箱(美国FORMA)等。2．实验方法2．1小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型的建立2．1．1质粒pI][BVl．5及pcDNA3．1的大量抽提复苏保存于．70℃的菌种，采用分区划线法接种于含有氨苄青霉素50ug，mI的LB平板上，于37℃孵箱孵育过夜，次日，用接种环挑取单个菌落接种于含有氨苄青霉素50¨g／ml的LB液体培养基中，于37℃水浴摇床振摇培养18h(160印m)第三天按质粒大量抽提试剂盒说明，抽提质粒，并用核酸蛋白检测仪对所抽提的质粒定量，置于一20℃保存备用。2．1．2裸质粒pHBVI．5注射小鼠尾静脉取10ug的pHBVl．5，用2．5mlPBS稀释后，在10秒钟内由小鼠尾静脉注射入小鼠体内，同时设立pcDNA3．1对照及PBS对照组，每组6只。各质粒的注射方案如下：实验组(10ugpHBVl．5+2．5mlPBS)；pcDNA3．1对照组(10ugpcDNA3．1+2．5mlPBS)；PBS对照组(2．5mlPBS)。2．1．3小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型的确定 重庆医科大学磺士研究生学位敞(1)、MEIA检测HBsAg和HBeAg的表达情况于质粒注射后第6天，摘除小鼠眼球取血，分离血清，用MEW方法检Nd,鼠血清中HBsAg的含量N(IU／m1)和HBeAg的含量N(S／C∞。(2)、RT-PCR检测肝脏组织内HBVCmRNA的转录情况处死小鼠，取出肝脏，TRIZOL提取肝脏组织总RNA(方法同前)，于-70℃保存备用；用DNaseI消化污染的质粒及基因组(方法同前)：接着将RNA逆转录为cDNA(方法同前)；用PCR扩增目的基因。2．2psilfllBVl在小鼠体内对ItBV抗原表达的抑制作用2．2．1质粒pltBVl．5，pTZO针I，psiltBVl，psic的大量抽提分别复苏保存于一70℃的，含pHBVl．5，pTZU6+I，psiHBVl，psiC的菌种，采用分区划线法接种于含有氨苄青霉素50ug／ml的LB平板上，于37℃孵育过夜，次日，用接种环分别挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素50ug，mI的LB液体培养基中，于37℃水浴摇床振摇培养18h(160rpm)，第三天按质粒大量抽提试剂盒说明，分别抽提质粒pHBVl．5，pTZU6+I，psiHBVl，psiC，用核酸蛋白检测仪对所抽提的质粒分别定量，置于一20℃保存备用。2．2．2动物的分组将清洁无菌喂养、体重为22—259、4．5周龄的Balb／c雄性小鼠(四川大学华西医学中心实验动物中心提供)，随机分成5组，每组6只。A组为空载体对照组，共注射pI-IBVl．5和pTZU6+1；B组为干扰组，共注射pHBVl．5和psit-IBVl；C组为无关干扰组，共注射pHBVl．5和psiC；D组为感染组，注射pHBVl．5；E组为空白对照组，只注射PBS缓冲液。2．2．3裸质粒的注射各质粒的注射量如下：空载体对照组(10ugpHBVl．5+70ugpTZU6+2．5mlPBS)；干扰组(10ⅡgpHBVl．5+70ugpsiHBVl+2．5mlPBS)；无关干扰组(10ugpHBVl．5+70ugpsiC+2．5mlPBS)；感染组(10ugpHBVl．5+2．5mlPBS)；空白对照组(2．5mlPBS)，在10秒内由尾静脉注射入小鼠体内。2．2．4psilIBVl抑制小鼠体内EIBV抗原表达的观察(1)、HBsAg和HBeAg抑制水平的观察注射质粒后第6天，镊子摘除小鼠眼球取血，分离血清，用MEIA检测I-IBsAg 重庆医科大学硕士研究生学位论文的含量N(IU／m1)和HBeAg的含量N(s／CO)，抑制率=(N*R目·N女§m)／Nw％m×100％。(2)、HBVCmRNA抑制水平的观察①肝组织总RNA的提取切取约35mg的肝脏组织块，用玻璃研磨器研磨至组织块被彻底研细，再用TRIZOL提取肝组织总RNA(方法同前)。②DNaseI消化污染的质粒及基因组(方法同前)；③RNA逆转录eDNA(方法同前)；④RT-PCR检测HBVCmRNA转录水平分别用pmc／e的引物和B．actin的引物进行分管PCR扩增，扩增B-actin和prec／e的反应条件均为94℃3min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，24个循环，72℃7min；分别取每个样本的pree／c弓[物的PCR产物和B．aetin91物的PCR产物各15lll混匀，于1．5％的琼脂糖电泳，成像，并采用Bio—Rad的QarIt畸One进行图象扫描分析，以pree／e与B—aetm的灰度比值A作为比较指标，抑制率=(A目m*_A女*飙)／A*月目×100％(3)、统计学处理：数据用X±s表示，采用配对t检验。3．实验结果3．1小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型的建立3．1．1小鼠血清中nasAg和nmAg的含量注射pHBVl．5组血清中的HBsAg和HBeAg表达均为阳性，而注射pcDNA3．1组及PBS对照组血清中的HBsAg和HBeAg表达均为阴性(T曲1e3-1)。表3-l小鼠血清中HBsAg’tlBeAg的定量1hMe3．1．ThequanfihfionofItBsAgandm3eAg血辩憎蚰lb／ebyIVlEIA(x士s，n=n垫型墅!丝!型竺!!望!!生!苎竺Q笪!oltBVl．5感染组1．42士0312．57士0A2p卸lNA3．1组E02-+0．01o．28i-0．04PBS对照组o．02-+0·010．23士0·惦注：HBsAg值>o．05IO／ml为阳性；flBoAg(S／CO)值>1．0为阳性 兰壅墨型查兰堕主堑塞皇堂垡塑奎3．1．2RT-PCR检测目的基因的表达注射pcDNA3．1及PBS组的小鼠，肝脏RT-PCR未扩增出目的条带，而注射pHBVl．5组的小鼠，肝脏RT-PCR扩增出639bp大小的条带。图3—1RT-PCR扩增前C／C基因Fi93-1Amplicationofpr葩／CbyRT—PCRLane1PCRMarker；Lane2pltBVI．5groupLane3pcDNA3．1gronprLane4PBSgroup3．2psiHBVl在小鼠体内对皿BV抗原表达的抑制作用3．2．1小鼠血清中nAg和皿BeAg的含量psiHBVl注射组血清中HaeAg显著减少①<0．01)，抑制率为53．15％，而HBsAg显著增加①<0．01)；psiC注射组血清中瑚e翘及HBsAg均无显著改变(P>O．05)(Table3-2，Fi93-2，3-3)。表3-2小鼠血清中rmsAg,HBeAg的定量Table3-2ThequantityotrmsAgandHBeJ^gin∞nofBalb／cbyMEIA(x±s，n=田塾型堕丝!里塑!!塑!塑竺!墅鲤!!婴垡型塑塑对照组1．06i0．2402．22士0_250．39．22psic1．13i0．30+’五砷感染组1．25i0．26空白组0．眈士0．0l2．13士o．4l++2．49士0．360．34士0．1153．154．0S注：·表示与对照组相比P<0．01，”表示与对照组相比P>0．05 重庆医科大学硕士研究生学位论文图3-2MEIA检测小鼠血清中m3eAg的含量Fi93--2Thequantitation(S／CO)ofHBeAginsellbyMEIA图3-3M]EIA检测小鼠血清中卸瞻Ag的舍量Fi93-3Thequanfitafion0U／m1)ofHBsAginserabyMEIA 重庆医科大学硕士研究生学位论文3．2．2ItBVCmRNA抑制水平的观察psiHBVl注射组中HBVCmRNA的表达明显减少，抑制率为52．56％，而psiC注射组HBVCmRNA的表达无明显改变(Fi93—4)。A值分别为0．950．370．780．73抑制率分别为(％)52．5606．41图3_4RT-PCR检测Balb／c小鼠肝脏组织中ItBVCmRNA的表达Fi93-4senhuantitationofHBVCmRNAbyRT-PCRinliverLanelBlankcontrolgroup；Lane2infectedgroupLane3psiHBVlgrouplLane4pTZU6+IcontrolgroupLane5psicgroup4．讨论4．1小鼠急性EIBV感染动物模型的建立为研究siRNA在机体水平的抑制作用奠定了基础(1)、HBV感染动物模型的成功建立具重要意义由于HBV的宿主范围极窄，仅对人及灵长类动物易感，使其体内研究相当困难，极大限制了对HBV的深入研究。因此，寻找一种经济，方便，操作简单的HBV动物模型的建立方法已成为研究热点。早在1999年zhallg等口91就提出通过小鼠的尾静脉快速、高负荷注射裸质粒，使其在小鼠肝细胞内高表达的水动力学方法来建立h-BVBalb／c动物模型。此后，YangPL等[30】和Suzuki等㈨分别用1．3倍和1．5倍的PHBV真核表达质粒注射小鼠尾静脉，成功建立了小鼠急性HBV感染的体内模型。本实验利用水动力学方法，将pHBVl．5表达质粒经尾静脉注射入小鼠体内，转染后第6天即可查见血清HBsAg，HBeAg高表达，肝脏组织的HBVcmRNA表达 重庆医科大学硕士研究生学位论文为阳性。这些观察结果表明用此法导入的HBV真核表达质粒，不但能有效启动HBV复制、转录、翻译等全过程；而且还可表达病毒蛋白，证实我们已成功建立Balb／c小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型。该方法的优点是：(i)Balb／csjx鼠容易饲养，价廉易获，个体小易操作。②直接注射少量的裸质粒，不用接触活病毒，对实验人员相对安全。③实验所需周期短，一般不超过l周。④注射小鼠后，小鼠感染率高，HBsAg，HBeAg的表达较高，有利于从机体水平进一步研究siRNA的干扰作用。(2)、psiHBVl亦能显著抑制动物体内的HBeAg表达、同时增加HBsAg的表达本研究结果表明psiHBVl可致pI-IBVl．5表达质粒转染的Balb／c小鼠体内的HBeAg表达减少53．15％：HBsAg的表达增加39．22％，与对照组小鼠相同指标比较，均有显著差异(P<0．01)，与其它研究观察到靶向前C／C基因的siRNA，可同时抑制HBeAg和HBSAg的产生的结果不同【28，321，具体原因尚待进一步研究确定。(3)、体外实验与体内实验的一致性研究结果表明psiHBVl在显著抑制机体内HBeAg的表达的同时亦能显著增加HBsAg的表达，与体外实验的结果相一致。同体外实验一样，psiHBVl对HBeAg表达的抑制作用在mRNA和蛋白质水平上不平衡，这可能是实验造成的误差，也有可能是mRNA和蛋白质的时相上的差异造成的。(4)、实验时间的选择我们选择质粒注射后第6天来观察Balb／cdx鼠的感染情况以及siRNA对病毒抗原表达的抑制作用，是因为在小鼠急性乙型肝炎感染的模型中，宿主对HBV的感染是一急性自限性的过程，为了排除宿主自身免疫系统的影响，而选择病毒复制和表达均稳定的时间点p21。4．2RNAi技术在抗ltBV基因治疗中的现状及前景RNA干扰，又称之为转录后基因沉默(posttranscriptiongenesilencing，PTGS)[33-34]，被誉为2002年10大科技发现之首。它可能是广泛存在于植物、线虫、果蝇、真菌和动物中的一种重要的抗病毒机制【35。361，有如脊椎动物的免疫系统[翊，能特异地发挥抗病毒感染作用，有可能成为一种有广泛应用前景的、抗病毒感染的基因治疗方法。RNA干扰已成功地运用于一些病毒的研究，如人类免疫缺陷病毒(mV)、丙型肝炎病毒(HCv)、乙型肝炎病毒(ribV)、SARS冠状病毒等[28,38。41]。 重庆医科大学硕士研究生学位论文许多研究结果表明采用RNA干扰技术可特异、靶向抑制这些病毒的复制和特异性抗原的表达。目前siRNA的产生主要有体外转录[421、化学合成【431、PCR扩增转录框【“】、降解长双链RNA、siRNA载体表达【451或病毒载体表i本t461等多种方法，其中各个方法均有其独特的优势，适合于不同的用途。载体表达方法可使导入细胞或机体内的siRNA表达载体不断产生siRNA／shRNA，从而达到能在较长时间内持续抑制相应基因表达的目的H¨9】。同时已有研究表明由u6启动子引导产生的shRNA的抑制效率，远高于体外化学合成的siRNA--聚体或其他它形式的siRNA[5叭。由于载体在体内可以较长时间转录siRNA或shRNA，所以此方法可以用于较长时间的研究，甚至有可能用于病毒性疾病的临床治疗。RNAi作为一种抗HBV感染的治疗策略具有很大的优势。首先，siRNA的高度特异性不会激发任何非特异性反应，因此可以最大程度上减少由于非特异反应引发的副作用。其次，HBV基因组上存在大量siRNA潜在靶位点，如果选择保守序列作为靶序列就可以减少逃逸变异体的产生，对不同的基因型和不同准种均有基因沉默作用。靶向同一基因组序列不同位点的多个siRNA同时使用可以增强抑制效果，同时减少病毒基因变异带来的耐药现象。另外，目前抗HBV治疗中多数药物如拉米夫定等均需要在病毒复制状态下起到抗病毒作用，而siRNA对于复制活动期和复制非活动期的病毒均有抑制作用，利用这一点至少可以将siRNA作为拉米夫定等的辅助治疗手段应用于抗HBV的治疗中，更有利于清除病毒。利用RNAi技术抑制HBV的研究才刚刚起步，但已经取得了很大的成绩。要筛选出最终能完全清除HBV感染的siRNA，必须进一步提高转染效率和RNAi作用的时间，减少人体细胞对siRNA导入产生的拮抗性，并生产出对人体细胞具有高效性的载体等。由于siRNA的作用不依赖于病毒的复制，使得该技术可以和现有抑制HBV复制的药物联合应用，或许可能建立抗HBV的“鸡尾酒治疗法”，但应用到人体还需要一个漫长的过程。相信随着科技的发展，RNAi技术的应用也必将从体外细胞实验走向动物和临床，RNAi将为发展特异性的抗HBV基因药物治疗提供新的技术平台。 重庆医科大学硬士研究生学位论文全文小结1、已构建好的1．5倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体pI-[BVI．5，能在Hela细胞内表达HBeAg前体，也可以分泌表达成熟的HBeAg，HBsAg。2、成功构建靶向HBV-prec／e基因的3个shRNA表达载体和1个无关序列shRNA表达载体，经多次重复实验证实其中psiHBVl有显著抑制HBeAg表达、增加HBsAg表达的作用，而另外两个psiH]3V对HBeAg和HBsAg的表达的影响作用不如psiHBVl，干扰作用呈现出剂量依赖性及靶位点依赖性。表明通过该研究，我们已筛选到能有效抑制FIBeAg表达的功能性shRNA表达载体。3、成功建立I-IBV急性感染动物模型，为在体内研究RNAi对I-I]3V的抑制作用提供了重要的物质保证。4、psiHBVl与pH]3V1．5共同高负荷，快速注射Balb／c小鼠后，psiHBVl能有效地抑制Balb／c小鼠体内HBeAg的表达，提示其可能对急性乙型肝炎病毒感染有治疗作用。5、本研究经多次重复实验证实：psiHBVl在显著抑制I-1]3eAg表达的同时可显著促进HBsAg的表达，提示调节HBsAg表达可能是HBeAg的重要功能。 重庆医科大学硕士研究生学位论文本课题的创新点及不足之处(一)本课题的创新点l、选用乙肝的全基因表达载体pHBVI．5作为靶载体，可同时观察具靶向抑制作用的siRNA对HBV不同抗原表达的抑制作用，有助于观察分析HBV不同抗原表达和相互作用的关系以及探索HBV不同抗原的功能。2、选择HBv_—prec／c作为干扰的靶基因，从mRNA水平和蛋白质水平两方面证实了shRNA表达载体在细胞水平及机体水平对HBV抗原表达的抑制作用。(二)本课题不足之处1、所构建的shR_NA表达载体没有绿色荧光蛋白报告基因，不方便估计各组之间的转染效率是否一致。2、未进行稳定表达HBV相关抗原的细胞株的筛选。 重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献【1】MastEE，AlterMJ，MargolisHS．StrategiestopreventandcontrolhepatitisBandCvirusinfection：aglobalperspective[-J1．Vaccine，1997；17：1730．1733[2】TangZY．Hepatoeellularcarcinomacause，treatmentandmetastasis[J]．WorldJGastroenterology,2001；7：445—454[3】KaoJ／I,ChenDS．GlobalcontrolofhepatitisBvirusinfectionFJ3．LancetInfectDis．2002；2：395-403【4】4Dienstag几，CianciaraJ，KarayalcinS，eta1．DurabilityofserologicresponseafterLamivudinetreatmentofchronichepatitisBl-J]．Hepatology,2003；37(4)：748．755f5]Mareellin只ChangTT,LimSqTongMJ，eta1．AdefovirDipivoxil437StudyGroup．AdefovirdipivoxilforthetreatmentofhepatitisBeantigenpositivechronichepatitisB[J]．NEnglJMed。2003；348(9)：808-816[6】LaiCL，RosmawatiM，LaoJ，eta1．EntecavirissuperiortolamivudineinreducinghepatitisBvirusDNAinpatientswithchronichepatitisBinfection[J]．Gastroenterology,2002；123(6)：1831-1838【7】FireA，XuS，MelloCC，eta1．potentandspecificgeneticinterfencebydoublestrandedRNAinC．elegansI-J1．Nature，1998；391：806．811[8]HannonGJ．RNAinterferencel-J]．Nature，2002；418：244．251【9]OuJH，LaubO，RuaerWJ．HepatitisBvirusgenefunction：theprecoreregiontargetsthecoreantigentocellularmembranesandcausesthesecretionoftheeantigen．[J]．P．N．A．S，1986；83(6)：1578-82【10]Jean—JeanO，LevreroM，WillH．ExpressionmechanismofthehepatitisBvirus(HBV)CgeneandbiosynthesisofHBeantigen．[J]．Virology,1989；170(1)：99．106[11]MiyagishiM，TairaK．U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3’overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells[J]NatuteBiotechnol，2002；20(5)：497．500【12]BrummelkampTR，BernardsRAgamiR．AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancellsFJ]．Science，2002；296：550．553(13]PaddisonPJ，CaudyAA，HannonGJ．StableSuppressionofgeneexpressionbyRNAiinmammaliancells[J1．PNAS，2002；99(3)：1443．144847 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重庆医科大学硕士研究生学位论文文献综述RNAi抗病毒感染的研究进展汪光蓉‘1捌综述朱道银【1】唐思洁【2】审校1．重庆医科大学免疫微生物教研室(重庆，400016)；2．．／il：lh医学院分子生物研究所(四川．南充，637007)【摘要】RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指由双链RNA(double·strandRNA，dsRNA)i；l发的转录后基因沉默机$1J(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)，具有序列特异性和高效性。RNAi作为一门新的基因阻断技术，其作用是由dsRNA启动，通过在转录水平，转录后水平，翻译水平等多个水平上，对同源基因表达的特异阻断和抑制来实现的。它在抗病毒感染的研究中显示出强大而特异的作用，故受到人们的广泛关注。本文就近年来有关RNAi抗病毒感染的研究进展作一综述。【关键词]dsRNA；RNA干扰；病毒RNAi是一种在动植物体内广泛存在的序列特异性的转录后基因沉默机制，它由与待抑制基因序列同源的双链RNA启动，引起相应mRNA特异性降解，从而导致该基因的沉默【1捌。RNAi现象的发现纯属偶然。1995年，康乃尔大学的SuGuo和Kemphues在研究线虫的基因功能时，用有待研究的基因mRNA互补的反义RNA特异性阻断秀丽线虫q6par-1基因的表达，而用正义RNA(即与mRNA相同的RNA)作为对照。实验结果令他们大吃一惊：不但注射反义的RNA阻断Tpar-1的表达，而且用于对照的正义RNA也阻断Tpar-1表达。当时人们对这一奇异现象一直迷惑不解【3】。直到1998年，卡耐基研究院的Fire和马萨诸塞州大学医学院的CraigMello才找到了问题的答案。他们将纯化后的单链RNA(包括正义RNA和反义RNA)分别注射给秀丽线虫，结果它们对par-1的抑制效果都非常微弱，但当他们将正义RNA混合后注射线虫，却能高效特异的阻断par-1的表达，其抑制基因的效率比纯化后的单链RNA至少要高出100倍。因此他们认为SuGuo实验时是因为单链RNA中污染了少量的dsRNA才引起当时那～奇异现象。他们将由dsRNA引起的这一序列特5】 重庆医科大学硕士研究生学位论文异性基因沉默现象称之为RNA干扰【4J。1．RNAi的作用机制在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内，dsRNA可来自于RNA病毒的感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些dsRNA激发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因的表达被抑制。同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。由此可见，RNAi的自然功能可能是抗寄生的外源核酸的一种原始免疫反应。虽然目前对于RNAi的作用机制仍不十分清楚，但对于其发生机制已有初步认识。其中涉及到几种重要物质，如dsRNA、dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNAspecificendonuclease，dicer)、RNA诱导沉默复合体(RNA-inducingsilencingcomplex，Ⅺsc)以及RNA依赖性RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase，RdRP)。现在认为RNAi作用机制主要呈现于以下水平：1．1转录后抑制基因转录后，RNAi作用于相应的mRNA，使得目的基因的表达关闭，从而导致转录后抑制。整个过程包括三个阶段：起始阶段，效应阶段和放大阶段。首先在起始阶段，外源dsRNA进入细胞内，被Dicer识别并降解为21—23nt的siRNA。然后进入效应阶段，在此阶段siRNA解链，反义siRNA与相关蛋白结合形成RISC，RISC进而识别与siRNA具有完全互补序列的mRNA。最后步入放大阶段，新产生的siRNA可作为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖性RNA聚合酶的帮助下产生新的长链dsRNA，如此循环反复，产生级联放大的瀑布效应，使得极少量的siRNA即可引起同源基因沉默【56J。1．2翻译抑制RNAi抑制相应的mRNA翻译，使相应的蛋白表达受阻．在RNAi作用中，除了引起特异mRNA降解的siRNA9'[,，还有一种引起非特异mRNA降解的stRNA(smalltemporalHA)，它是由长度约为70nt的RNA组成的茎环样前体．经Dicer识别并降解为21--25nt的dsRNA【7]，通过RISC的作用，结合在相应mRNA的3’末端非翻译区(3’uTR)，阻断mRNA的翻译，从而发挥作用。1．3转录抑制该机制是诱导产生目标基因的染色质结构的改变，使目的基因的转录受限、表达关闭。有报道dsRNA可诱导组蛋白H3及相应DNA区域甲基化。如果甲基化出现在启动子区域，则转录就不能进行，如甲基化出现在编码区，则转录进行，但在转录后水平上沉默。 重庆医科大学硕士研究生学位论文2．RNAi抗病毒感染的相关研究RNAi可有效地关闭序列特异的基因，是细胞控制病毒基因表达、抑制病毒复制的重要防御机制。最近研究显示，RNAi可通过间接抑制宿主细胞表面受体基因的表达，阻断细胞受体功能，或者直接抑制病毒基因的表达和复制来有效关闭受感染细胞中的病毒基因从而抑制包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBⅥ、人乳头瘤病毒(HPV)等病毒。2．1HIV感染Novina[8】用HIV的gap蛋白的编码基因作为目标基因构建siI冰A，转染siRNA的HeLa细胞，两天后观察至IJP24蛋白的水平比对照组低4倍，五天后低达10倍。Cobum【9】等人利用HIV的调控蛋白(ratandRev蛋白)编码基因作为RNAi的靶基因，均观察到Ⅲv复制的明显抑制。KasanofiM掣1o]以PARP～1为靶基因构建siRNA表达载体，分别导入Hela和Jlll细胞，也收到了预期的抑制效果，在一定程度上阻止了病毒的复制，起到了抗病毒感染的作用。现在的研究认为，CCR5和CXCR4联合受体在Ⅲv病毒感染过程中，对于病毒的入侵起着重要的作用。通过抑制ccR5和CXCR4的表达就可以阻止病毒的感染。AndersonJ【“j等以CCR5和CXCR4为靶基因构建siRNA，以腺病毒为载体，分别感染Magi．CXCR4细胞和Ghost．R5细胞。经流式细胞仪检测，CCR5和CXCR4受体的表达分别减少了73％和72％。这些实验均有力地证明了siRNA能有效抑制HIV的复制、整合和基因表达。2．2HCV感染HCV是引起慢性肝炎、肝硬化和肝癌的常见病毒之一，有着高度的变异性，临床慢性化比例相当高，现仍没有有效疫苗来预防，而传统的药物治疗效果欠佳。SenA【12】以针对NS5A序列设计siRNA，导入HepG2细胞，同时观察到Ns5A蛋白表达的抑制以及由NS5A介导激活的IL-8启动子的抑制。PrabhuR等113]分别以编码HCV结构基因的E2和编码非结构基因的NS3，NS5B作为靶基因构建siRNA表达载体，与编码HCV全长基因组的质粒共同转染细胞，采用Westernblot和细胞免疫化学检测，发现E2，NS3以及NS5B的表达都受到了明显的抑制。近来的种种研究结果提示，RNAi具有抗HCV感染的潜在的应用前景。2．3HBV感染HBV的感染率在我国高达10％，寻找有效的抗HBV疗法有着十分重大的意义。ZhouXM[14]等构建了能在真核细胞内表达并带有报告基因一绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA的抑制性质粒，能产生针对HBV的s基因的 重庆医科大学硕士研究生学位论文siRNA，导入Hela细胞后，经RT。PCR检测发现HBsmRNA的抑制率为75．6％，荧光显微镜定量HBs--EGFP的抑制率为63．3％。ELISA检测细胞上清中的HBsAg水平，都有明显的降低。WuY等通过水动力法成功建立了Balb／c的HBV感染模型，并将在体外已经证实、对HBV有明显抑制作用的siRNA表达载体和编码HBV全长基因组的质粒，同时以水动力学法尾静脉注Balb／c，6天后取小鼠血清检测HBsAg、HbeAg，小鼠肝脏做免疫组织化学检．钡I]HBeAg和RT—PCR检测HBVC区mRNA水平，都呈现明显的抑制作用f15】。这也更进一步表明RNAi在体外和体内同样发挥着高效、特异的抗病毒作用。2．4其他病毒感染随着研究的深入，人们发现越来越多的病毒都能在一定程度上被RNAi抑制。现在发现的有呼吸道合胞病毒、SARS病毒、人乳头瘤病毒、猪瘟病毒、流感病毒等等。NiB等【l6】用针对SARS冠状病毒基因组中编码非结构蛋白序列的siRNA表达载体，转染E6细胞系，观察到了RNAi的阻断效应，有效地抑制了病毒的复制．当前的研究结果显示，RNAi针对不同基因序列都有效，而且特异性强、效率高、操作方便，这为预防治疗病毒感染开辟了一条新途径。3．RNAi抗病毒的展望RNAi技术作为一种全新的抑制基因表达的技术，在抗病毒感染方面显示出广阔的前景，因为它与其他抗病毒手段相比有下列显著的优点：①高特异性。RNAi引起的是转录后特异的基因沉默，是针对与dsRNA序列同源的mRNA的降解，对非同源基因的表达没有影响，从而避免了其对机体正常系统的干扰，故仅产生极低的毒副作用。同时也决定了在进行siRNA设计时，必须严格进行碱基配对【l”。有研究发现，一个碱基的错配可以使效率明显降低。②高效性。RNAi抑制基因的表达效果显著，只需极微量的dsRNA便可抑制大多数致病基因的表达，使该基因产物的表达量下降约90％，类似基因敲除功能，这与RNAi作用机制中存在一个级联放大的瀑布效应有关。③作用多重性。RNAi不但可以直接抑制病毒基因的表达，亦可阻断病毒相关受体的表达，切断病毒感染途径。④作用长效性。siRNA对核酸酶的降解较之反义核酸更有抵抗性，因此比反义方法有更长的疗效。这种效应可以在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传给子一代【18】。但在医学上，对RNAi的研究迄今仍停留在基础研究水平上，离I}岛床运用还有一段距离，其安全性、可靠性还有待迸一步确定。而且病毒变异性大，使得针对某一特定基因的siRNA设 重庆医科大学硕士研究生学位论文计变得困难。相信随着对RNAi机制研究的深入，RNAi将成为抗病毒感染的一种新方法。参考文献1．HammondSM，BemsteinE，BeachD，eta1．AnRNA—directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells．Nature，2000，404(4)：293-962．Sharp，PA．RNAinterference．GenesDev，2001，15(6)；485-4903．GuoS，Kemphues，KJ．Par-1，agenerequiredforestablishingpolarityinC．elegansembryos，encodesaputativeSer／ThrkinasethatisasymmetricallydistalbutedCell，1995，81(8)：611-6204．FireA，XuS，MontggomeryMK，eta1．Potentandspecificgeneticinterferencebydouble—strandRNAinCaenorhabditiselegans．Nature，1998，391(7)：806—81l5．GregoryJ,Hannon．RNAinterference．Nature，2002，418(6)：244-2516．ZamorePD．TuschlT-SharpPA．eta1．RNAi：double-strandedRNAdirectstheATP—dependentclavageofMa-naat21to23nucleotideintervals．Cell，2000，101(1)：25-337．GrishokA，PasquinelliAE，ConteD，eta1．GenesandmechanismsrelatedtoRNAinterferenceregulateexpressionofthesmalltemporalRNAsthatcontrolC．elegansdevelopmentaltiming．Cell，2001，106(1)：23—348．NovinaCD，MurrayMF，DykxhoomDM，cta1．siRNA-directedinhibitionofHIV-Iinfection．NatMed，2002，8(7)：681～6869．CoburnGA，CullenBR．Potentandspecificinhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1replicationbyRNAinterference．JVirol，2002，76(18)：9225-3110．KameokaM，NukuzumaS，ItayaA，eta1．RNAinterferencedirectedagainstPoly(ADP·Ribose)polymeraselefficientlysuppresseshumanimmunodeficiencyvirustype1replicationinhumancells．JViml，2004，78(16)：8931—411．AndersonJ．AkkinaR．HIV-lresistanceconferredbysiRNAcosuppressionofCXCR4andCCR5coreceptorsbyabispecificlentiviralvector．AIDSResTher，2005，2(1)：85—9012．SenA，SteeleRGhoshAK，eta1．InhibitionofhepatitisCvirusproteinexpressionbyRNAinterference．VirusRes，2003，96(1—2)：27—35 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