oatp1b1及cyp3a4基因多态性对阿托伐他汀转运代谢影响分子机制的研究

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1、摘要背景：阿托伐他汀(AtoⅣaStatin，ATV)是新一代p．羟基．p．甲基戊二酰辅酶A(HMG．CoA)还原酶抑制剂，可竞争性抑制胆固醇的生物合成，显著降低血脂水平。虽然ATV己广泛用于高胆固醇血症的治疗，但其调脂疗效呈现明显的个体差异仍给临床应用带来困扰。有研究表明，ATV与其他他汀类不同之处在于，其既是摄入型转运体OATPlBl的底物，又主要经CYP3A4代谢。故OATPlBl及CYP3A4的基因多态很可能影响ATV的转运与代谢，从而导致ATV疗效和副作用个体差异的出现。因此，系统研究与ATV转运、代谢相关OATPlBl及CYP3A4的基因多态性及其相互问的关联意义重大。目的：

2、本课题旨在通过构建OATPlBl幸1a、+5和幸15重组质粒模型，研究ATV在不同OATPlBl基因型个体中药物体外转运的差异；通过野生型及不同位点突变型CYP3A4重组酶系，研究不同CYP3A4基因型代谢ATV的差异；通过统计分析研究所获数据，探讨ATV在不同基因型个体中转运和代谢差异的分子机制及二者的关联性；为ATV在临床的合理应用提供理论与实验依据。方法：l、建立HPLC及LC．MS检测ATV生物样本的方法，摸索ATv的重组蛋白酶样品及HEK293T细胞样品处理方法。2、构建稳定表达目的基因的细胞模型。将携带OATPlBl木15．GFP融合基因的慢病毒(OATPlBl木15质粒构建

3、、慢病毒包装、滴度测定由上海吉凯基因完成)感染HEK293T细胞，建立稳定表达OATPlBl宰15的HEK293T细胞模型，结合本实验室己成功表达OATPlBl水1a、OATPlBl幸5的HEK293T细胞模型，采用上述三种细胞模型比较ATV在不同基因型0ATPlBl个体中摄取转运过程的差异。3、ATv在表达oATPlBl丰la、枣5及丰15的HEK293T细胞中吸收转运实验。实验分为空白对照组、OATPlBl木1a、木5及唪15三种质粒组，考察摄取缓冲液PH对摄取过程的影响；考察不同时间点(5、10、20、40、60min)对摄取过程的影摘要响；考察底物浓度(5、10、20、50、10

4、0、150¨M)对摄取过程的影响。采用LC．MS法测定细胞样品中ATV的量，比较ATV在三种不同基因型质粒模型中的摄取动力学参数(Km、Vm舯CLinI值)，分析两个位点突变对ATV转运过程的影响。4、ATV在野生型及不同位点突变型CYP3A4重组酶系中体外酶促动力学分析。实验分为空白对照组和CYP3A4木1(谢ldtype)、CYP3A4半3(M445T)、CYP3A4木5(P218R)、CYP3A4木16(T185S)、CYP3A4木18(L293P)五种重组酶组，每组分别加入系列浓度的ATV10“l，孵育体系中重组酶终浓度为1m∥ml，温孵60min后，加入100“l冰乙腈终止反应

5、后处理样品，采用RP．HPLC法测定孵育体系中ATV及其代谢产物的量，比较ATV在CYP3A4野生型与突变型重组酶系中的酶促动力学参数(Km、Vm孙CLint值)，分析CYP3A4不同位点突变对ATV代谢的影响。5、数据处理与统计分析。所有数据均以平均数士标准差(mean土SD)表示，通过米曼氏方程模型、Lineweave卜Burk作图法计算ATV在不同OATPlBl质粒模型中摄取动力学参数，以及ATV在野生型和突变体重组酶系药物代谢动力学参数。采用SPSS12．0软件进行统计分析，组问差异采用t检验，统计结果以P>0．05表示差异无统计学意义，P

6、01表示显著性差异。结果：1、建立的LC．MS检测方法完全能够符合ATV生物样本分析测试的要求，建立的HPLC检测方法符合ATV及其代谢产物分析测试的要求，两种检测方法均具有较高的灵敏度和特异性；成功建立ATV的重组蛋白酶样品及HEK293T细胞样品处理方法，为本课题实施奠定了可靠基础。2、获得OATPlBl木15慢病毒融合质粒，其病毒滴度为2x109TU／m1，感染HEIQ93T后，通过荧光检测，观察到GFP的表达，荧光表达随着时间延长及感染复数(Multiplic时ofinfection，MOI)值增加而增强、增多，最佳MOI值为50，此时Lenti．0ATPlBl木15感染HEK2

7、93T的感染率可达80％；通过WestemBlot检测感染的293T样品，可以观察到95ma附近有特征带表达，其大小和oATPlBl木15融合蛋白(104kDa)相吻合。表明稳定感染Lenti．oATPlBl木15的HEK293T细胞模型构建成功。3、OATPlBl木1a．HEK293T对ATV的摄取动力学参数Km与Vmax及CLi。t分别为摘要21．17士3．96uM、9．13士1．42pmol·min～·mg叫proteill、