fsp27基因抑制肝脏纤维化及体外抑制肝星状细胞增殖活化的实验研究

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1、温州医学院博士学位论文Fsp27基因抑制肝脏纤维化及体外抑制肝星状细胞增殖活化的实验研究姓名：俞富祥申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：张启瑜2012-05-24温州医学院博士学位论文中文摘要Fsp27基因抑制肝脏纤维化及体外抑制肝星状细胞增殖活化的实验研究-▲上--J一刖舌肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是各类慢性肝病共同的病理学基础。其中25％一40％最终发展为肝硬化甚至肝癌，是一类世界性的严重危害人们健康的主要疾病。有较多研究显示，肝星状细胞(hepaticstellate

2、cells，HSCs)的活化与增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。HSCs增殖激活后可分泌大量细胞外基质，引起胶原纤维沉积导致纤维化。阻止HSCs的增殖活化有可能阻断肝纤维化肝硬化的进程。针对HSCs的有关肝纤维化机制及对其防治的研究，近年已成为国内外生物学、医学研究的热点之一。国内外较多研究显示，激活过氧化物增殖酶体的受体Y(peroxisomeproliferator—activatedreceptorgamma，PPAPY)能显著抑制HSCs的增殖激活，同时抑制HSCs中肝纤维化相关基因的表达，

3、从而逆转活体肝纤维化进程。但对于PPAPY通过何种途径对HSCs产生作用目前研究尚不十分明确。针对脂肪细胞的研究提示脂肪特异性蛋白27(fat—specificprotein27，Fsp27)是脂肪细胞胞浆内脂滴形成的一个重要基因，并在肝脏中是PPARY的直接目标基因，PPARY对脂肪细胞储脂功能的实现主要通过Fsp27这个下游基因而实现。众所周知，HSCs是肝脏中的储脂细胞，我们的研究是直接探讨Fsp27基因能否对HSCs活化增殖过程产生影响及进一步通过活体实验验证抗纤维化疗效。为了研究Fsp27

4、基因能否对HSCs活化增殖过程产生影响及进一步通过活体实验验证抗纤维化疗效，我们对小鼠原代HSCs的提取方法进行了改良，通过RT—qPCR技术检测FSP27基因分别在原代及活化的HSCs中的表达变化，构建携带Fsp27基因的慢病毒载体，转染活化的HSCs，研究该基因对HSCs增殖、活化的影响，同时进一步病毒感染四氯化碳(CCL4)喂养建立鼠的肝硬化门脉高压症模型，探讨该基因在活体实验中的抗纤维化疗效。第一部分：改良小鼠HSCs的分离、培养及性质鉴定目的：通过改进BALB／c小鼠HSCs的分离、培养方

5、法，提高其分离质量，为进一步研究原代HSCs的性状及影响HSCs的增殖活化的因素奠定实验基础。方法：选用25--309体重小鼠，结扎上、下腔静脉，经下腔静脉D—HanK’s液灌注，6温州医学院博士学位论文冲洗出肝脏血管内的血液；然后采用胶原酶(0．3mg／mE)手工逆灌注肝脏10min，游离并取下肝脏剪碎，用HBSS液20mE(0．3mg／mE1V型胶原酶、20ug／mLDNA酶)消化肝脏组织；使用optiprep密度梯度分离液，离心分离小鼠HSCs。用含血清DMEM培养HSCs，台盼蓝拒染实验鉴定

6、细胞活力；desmin、Q—SMA免疫细胞化学检测进行HSCs性质鉴定。结果：HSCs的得率稳定在2x105个／鼠以上，纯度为93％-97％左右，HSCs存活率存活率为95％-97％。新分离未贴壁的HSCs呈圆形，胞浆折光性很强；培养24h后，大部分细胞已贴壁；48h后绝大部分贴壁，胞浆内可见脂滴，细胞开始伸展，一部分细胞出现多角伪足：培养7d左右，细胞开始呈现典型的星状外形，胞浆内颗粒减少，增殖细胞形态较大，并呈局灶性生长。刚分离的HSCsa—SMA染色阴性，desmin阳性染色90％左右，培养7

7、d的HSCsdesmin、Q—SMA阳性染色均达100％。结论：改良optiprep密度梯度离心方法分离、培养的小鼠HSCs得率高，活性保存好，且操作简单易行，适于广泛开展，有利于原代小鼠HSCs的生物学研究，具有良好的科研应用价值。第二部分：Fsp27基因的慢病毒载体的构建及其在星状细胞株HSC-T6中的表达目的：构建携带鼠Fsp27基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的表达，为进一步研究Fsp27基因对HSCs增殖活化的影响奠定实验基础。方法：从大鼠基因库中提取并用PCR方法

8、扩增Fsp27基因，构建Fsp27重组表达载体pLY—Fsp27，将重组慢病毒载体转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染293T细胞，根据RT—qPCR法测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及Fsp27慢病毒感染组，用Real-TimeqPCR方法检测Fsp27mRNA的表达。结果：PCR扩增检测阳性菌落和测序证实，成功构建大鼠Fsp27基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见，293T细胞呈绿色荧光，并测得病毒滴度为2．OOE+8Y