安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠细胞凋亡的影响

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学校代码：10600学号：092029学位类型：科学学位广西中医药大学硕士学位论文安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠细胞凋亡的影响研究生：余翥导师：林寿宁教授院系（部所）：瑞康临床医学院专业：中医内科学研究方向：脾胃病治疗研究完成日期：2012年5月27日 目录中英文缩略词汇表…………………….…………………………………1中文摘要……………………………………………………………………2英文摘要……………………………………………………………………5引言……………………………………………………………………10正文…………………………………………………………………121实验材料和方法……………………………………………………………121.1实验材料…………………………………………………………………121.1.1实验条件…………………………………………………………………121.1.2实验动物…………………………………………………………………121.1.3药物与试剂…….…………………………………………………………121.1.4主要仪器设备…………………………………………………………141.1.4.1一般实验器材…………………………………………………………141.1.4.2主要仪器………………………………..………………………………141.2实验方法…………..……………………………..…………………………151.2.1实验动物分组………………………………………………………..…151.2.2实验性大鼠慢性萎缩性胃炎模型的制备…………………………..…151.2.3造模成功标准….……………………..……………………………..…151.2.4给药方法……….………………………..……………………………..…151.2.5标本采集及处理…………………………………………………..……...161.3观察指标及方法...…………………………………………………..……...171.3.1大鼠一般状态…....………………………………………………..……...171.3.2胃粘膜大体形态观察……………………………………………..……...171.3.3胃黏膜光学显微镜观察…………………………………………..……...171.3.4胃黏膜与血液Bcl-2及NF-κB含量的测定……………………..……...181.3.4.1血细胞分离…....………………………………………………..……....18I 1.3.4.2胃粘膜组织…....………………………………………………..……....181.3.4.3RNA提取…....………………………………………………..….........181.3.4.4引物设计…....………………………………….…………..…..….........181.3.4.5RT-PCR.……....………………………………….…………..…..….......191.3.4.6结果分析..……………………………………………..…..…................201.3.5TUNEL法检测测定各组大鼠胃粘膜细胞凋亡的改变…..….......201.3.6统计学处理………………………………………………………………212技术路线图…....…………...………………………………..…..…..............223实验结果……………………………………………………………………233.1动物外观观察………………………………………………………………233.2胃黏膜大体形态观察………………………………………………………233.3胃黏膜光学显微镜观察……………………………………………………233.4胃黏膜和血液中Bcl-2及NF-κB含量的测定结果………………………253.4.1胃黏膜和血液中Bcl-2表达的影响………………………………….…253.4.2胃黏膜和血液中NF-kB表达的影响………………...………………….273.5细胞凋亡检测（TUNEL法）………………………….................………294讨论………………………………………………………………………….304.1现代医学对慢性萎缩性胃炎的认识…………………………………….304.2中医对慢性萎缩性胃炎的认识……...…………………………………….324.2.1标本论……………….……………………………………………………324.2.2脾虚论……………….……………………………………………………334.2.3瘀毒论……………….……………………………………………………334.2.4血瘀论……………….……………………………………………………344.2.5正虚邪实…….………………………………………………………..…344.3中医药治疗现状……….…………………………………………………354.3.1治疗原则…………….……………………………………………………354.3.2辨证施治…………….……………………………………………………36II 4.3.2.1中药治疗………….……………………………………………………364.3.2.2针灸或针灸配合中药内服疗法………………………………………394.4物实验模型研究…….……………………………………………………394.4.1运用各种理化因素反复刺激胃黏膜形成慢性胃炎……………………394.4.2免疫因素制模法…….……………………………………………………404.4.3有中医特色的病症结合模型……………………………………………414.4.4生物制模法…….…………………………………………………………414.5关于细胞凋亡的讨论………………………………………………………424.6安胃汤理法方药的研究……………………………………………………444.7安胃汤促进胃黏膜逆转机制的探讨………………………………………505存在的问题和展望….………………………………………………………50结论…………………………………………………………………………52参考文献……………………………………………………………………53附录…….……………………………………………………………………59综述……………………………………………………………………65致谢……………………………………………………………………73攻读学位期间发表的学术论文目录…………………………………74作者声明…………………………………………………………………75个人简介…………………………………………………………………76III 主要缩略词英文缩写英文全称中文全称CAGchronicatrophicgastritis慢性萎缩性胃炎Bcl-2Bcelllymphoma/lewkmia-2B细胞淋巴瘤/白血病-2NF-κBnucleartranscriptionfactorkappaBk基因结合核因子MNNGN-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidineN-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍ReversetranscriptionPolymerase反转录聚合酶链式反应和实RT-PCRChainReaction/RealtimePolymerase时聚合酶链式反应共同的缩ChainReaction写terminal-deoxynucleotidyltransferase脱氧核糖核苷酸末端转移酶TUNELmediatednickendlabeling介导的缺口末端标记法HE染色法hematoxylin-eosinstaining苏木精—伊红染色法ACDacidcitratedextrose酸性枸橼酸葡萄糖PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯glyceraldehyde-3-phosphateGAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶dehydrogenaseMMLVMoloneyMurineLeukemiaVirus莫洛尼氏鼠白血病病毒dNTPdeoxy-ribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸PODperoxidase过氧化物酶AIApoptoticindex凋亡指数HPHelicobacterPylori幽门螺旋杆菌IMintestinalmetaplasia肠上皮化生ATPatypicalhyperplasia不典型增生1 中文摘要目的：观察安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜组织凋亡细胞、胃黏膜组织及血液中Bcl-2及NF-κB含量的影响，从而探讨安胃汤治疗慢性萎缩性胃炎疗效的分子机制，从基因水平上阐释名老中医治疗慢性胃炎学术理论。方法：健康清洁级wistar大鼠84只，雄性，体重140－170克，完全随机分为空白对照组、病理模型组、安胃汤大剂量组、安胃汤中剂量组、安胃汤小剂量组、维酶素对照组、胃复春对照组，每组12只。除正常对照组外，其它各组均采用MNNG制作慢性萎缩性胃炎大鼠模型，造模成功后，从第9周开始，除正常组与模型组外，其他各组分别每天每只取安胃汤大、中、小剂量、维酶素混悬液、胃复春悬浊液灌胃治疗4周。各组大鼠禁食12ｈ，股动脉取血后，立即剖腹取胃，臵于10%甲醛固定，作常规石腊包埋切片，采用TUNEL法检测测定各组治疗后CAG大鼠胃粘膜细胞凋亡的改变，PCR测定各组治疗前后CAG大鼠胃粘膜及血液中Bcl-2、NF-κB基因含量表达的改变，并做胃黏膜大体观察、胃黏膜组织病理观察。结果：1.胃黏膜大体形态观察：通过观察皱襞多少、走向，黏膜色泽，是否有出血等情况，发现模型组皱襞减少或消失，走向紊乱，表面黏液少，黏膜色泽淡白或灰白，且部分伴有散在出血点。经维酶素、胃复春，低剂量、中剂量、高剂量安胃汤治疗后，胃黏膜损害均有不同程度的改善，以高剂量组效果最为明显；2.胃黏膜光学显微镜观察：通过观察胃黏膜上皮细胞排列状况、固有腺体数量，有无炎性细胞浸润等情况，发现模型组固有腺体数量明显减少，排列紊乱，有炎性细胞浸润。经维酶素，胃复春，低剂量、中剂量、高剂量安胃汤治疗后，胃黏膜萎缩有不同程度的逆转，以高剂量组效果最为明显；3.①安胃汤大、中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比2 较有显著差异（P<0.01），说明安胃汤、维酶素、胃复春均能有效调控Bcl-2含量。安胃汤大剂量组与维酶素组、胃复春组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤中剂量组与维酶素组比较有显著差异（P<0.01），与胃复春对照组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较有统计学意义（P<0.05）；说明安胃汤大、中剂量组调控Bcl-2含量的效果较维霉素与胃复春对照组效优。安胃汤大、小剂量组与中剂量组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤大剂量组与小剂量组比较有显著差异（P<0.01）；说明安胃汤不同浓度组对Bcl-2含量的调控呈量效关系。②安胃汤大、中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01），说明安胃汤、维酶素、胃复春均能有效调控NF-κB含量。安胃汤大剂量组与维酶素组、胃复春组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤中剂量组与维酶素组比较有显著差异（P<0.01），与胃复春对照组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较有统计学意义（P<0.05）；说明安胃汤大、中剂量组调控NF-κB含量的效果较维霉素与胃复春对照组效优。安胃汤大、小剂量组与中剂量组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤大剂量组与小剂量组比较有显著差异（P<0.01）；说明安胃汤不同浓度组对NF-κB含量的调控呈量效关系。③与空白组相比，病理模型组大鼠TUNEL阳性细胞数目较少且散在分布，AI明显降低（P<0.01）；安胃汤大剂量组和安胃汤中剂量组见较多的TUNEL阳性细胞，AI明显上升，两者之间比较，有统计学意义（P<0.05），与模型组比较有极显著性差异（P<0.01），与维霉素组比较有极显著性差异（P<0.01）；安胃汤大剂量组与胃复春组比较有极显著性差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组、胃复春对照组TUNEL阳性细胞也有一定增多，AI有一定的上升，两者之间比较无显著性差异（P>0.05）；安胃汤小剂量组、胃复春对照组与中剂量3 组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；安胃汤小剂量组与模型组比较，有极显著性差异（P<0.01），与维霉素组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1.安胃汤改善了实验性慢性萎缩性胃炎大鼠组织病理学形态。具有保护胃黏膜、修复胃黏膜的作用。2.安胃汤在降低降低Bcl-2及NF-kB基因含量表达水平方面，安胃汤大剂量组作用明显强于中、小剂量组，中剂量组作用强于小剂量组，体现出一定的量效关系。3.安胃汤在降低Bcl-2及NF-kB基因含量表达水平方面，安胃汤大、中剂量组作用明显强于维霉素对照组及胃复春对照组。4.安胃汤降低慢性萎缩性胃炎大鼠Bcl-2及NF-kB基因含量表达水平，促进细胞凋亡，这可能是安胃汤减缓胃黏膜细胞向异型增生和胃癌方向转变进程的重要机制。关键词：安胃汤；慢性萎缩性胃炎；Bcl-2；NF-kB；细胞凋亡4 Areal-timefluorescencequantitativePCRStudyofAnweitangonExpressionofBcl-2andNF-κBofGastricMucosaandbloodinRatswithChronicAtrophicgastritisandstudyofTUNELtestonGastricMucosaCellApoptosisinratsAbstractObjective:ToobservetheeffectofAnWeiTangonchronicatrophicgastritisandgastricmucosaapoptoticcells,gastricmucosatissueandBcl-2andNF-κBofbloodofratsmodelofChronicAtrophicGastritis.ExplorethemolecularmechanismofAnWeiTangtreatmentofchronicatrophicgastritis.FromthegenelevelacademictoexplaintheoldChinesemedicinetreatmentofchronicgastritis.Methods:84malecleanWistarrats，rangefrom140to170gramme,weredividedinto7groupsatcompletelyrandom:blankcontrolgroup(n=12),modelgroup(n=12),high-doseAnWeiTangtreatmentgroup(n=12),middle-doseAnWeiTangtreatmentgroup(n=12),low-doseAnWeiTangtreatmentgroup(n=12),Vitacoenzymecontrolgroup(n=12)andWeiFuChuncontrolgroup(n=12).Excepttheblankcontrolgroup,ratmodelsofCAGwereinducedbyMNNGinother6groups.Aftersuccessfullymakingtheratmodels,Excepttheblankcontrolgroupandthemodelgrouprats,respectively,eachratinothersratswereadministeredintragastricallywithhigh-doseAnWeiTang,middle-doseAnWeiTang,low-doseAnWeiTang,VitacoenzymesuspensionandWeifuChunsuspensionfor4weeks.Theneachgroupwasfasting12hours.Caesareansectiontakegastrictissueimmediatelyafterfemoralartery5 bloodwascollected.Thegastrictissuewasplacedin10%formaldehydeforroutineparaffin-embeddedsections.ChangesinCAGratgastricmucosalcellapoptosisbyTUNELmethodforthedeterminationoftreatmentineachgroup.AlteredexpressioningenecontentofCAGratgastricmucosaandbloodofBcl-2,NF-κBinthePCRbeforeandaftertreatmentineachgroup,andperformthegeneralobservationofgastricmucosa,andthegastricmucosalhistopathologicexamination.Results:⑴Gastricgeneralobservation:byobservingfolds,mucousmembranecolor,andbleeding,wefoundthatthemodelgroupplicareducedordisappeared,lessmucus,mucousmembranecolorwhitishorgray,andsomeareaccompaniedbyscatteredbleedingpoints.AfterVictoriaSu-enzyme，WeiFuChun，low-dose,middle-doseandhigh-doseofAnWeiTangtherapy,gastricmucosaldamageareinvaryingdegreesofimprovementtothemostobvioushigh-dosegroup.⑵Gastricmucosaopticalmicroscopeobservation:byobservingstatusofgastricepithelialcellarrangement、thequantityofgastricmucosaIntrinsicglands,exitinflammatorycellinfiltrationornotetc.,inthemodelgroupsignificantlyreducedthenumberofinherentglands,withdisorder,andinflammatorycellinfiltration.AfterVitacoenzymeGroup，WeiFuChun,low-doseherb、middle-doseandhigh-doseherbtherapyofAnWeiTanggroups,gastricatrophyarevaryingdegreesofreversaltothemostobvioushigh-dosegroup.⑶①DosegroupinAnWeiTanghigh-dosegroup,AnWeiTangmid-dosegroup,AnWeiTanglow-dosegroup,Vitacoenzymegroup,WeifuchungroupandmodelgroupcansignificantlyreducetheexpressionofBcl-2contentinthegastricmucosaandblood,andmodelgroupweresignifycantlydifference(P<0.01).ShowthatAnWeiTang,Vitacoenzyme,WeifuchuncaneffectivelyregulateBcl-2content.AnWei6 TanghighdosegroupandVitacoenzymegroupandWeifuchungroupdifferencesweresignificantdifferences(P<0.01).AnWeiTangmiddledosegroupandVitacoenzymegroupweresignifycantlydifferent(P<0.01).AnWeiTangmiddledosegroupandWeifuchungroupweresignifycant(P<0.05).AnWeiTanglow-dosegroupcomparetotheWeifuchuncontrolgroupwasnosignificantdifference(P>0.05).AnWeiTanglow-dosegroupandtheVitacoenzymegroupcomparecontrolgrouphavethedifferencewassignificant(P<0.05).TheeffectoftheAnWeiTanghighdosegroupandtheAnWeiTangmiddledosegroupregulationofBcl-2contentefficiencybetterthanthegroupsofWeifuchunandVitacoenzyme.AnWeiTanghighdosegroupandtheAnWeiTanglow-dosegroupcomparetotheAnWeiTangmiddle-dosegrouphavethesignificantdifference(P<0.05).AnWeiTanghigh-dosegroupandAnWeiTanglow-dosegroupweresignifycantlydifferent(P<0.01).Differe-ntconcentrationsoftheAnWeiTangcontentregulationofBcl-2showedadose-effectrelationship.②DosegroupinAnWeiTanghigh-dosegroup,AnWeiTangmid-dosegroup,AnWeiTanglow-dosegroup,Vitacoenzymegroup,WeifuchungroupandmodelgroupcansignificantlyreducetheexpressionofNF-kBcontentinthegastricmucosaandblood,andmodelgroupweresignifycantlydifference(P<0.01).ShowthatAnWeiTang,Vitacoenzyme,WeifuchuncaneffectivelyregulateNF-kBcontent.AnWeiTanghigh-dosegroupandVitacoenzymegroupandWeifuchungroupdifferencesweresignificantdifferences(P<0.01).AnWeiTangmiddledosegroupandVitacoenzymegroupweresignifycantlydifferent(P<0.01).AnWeiTangmiddledosegroupandWeifuchungroupweresignifycant7 (P<0.05).AnWeiTanglow-dosegroupcomparetotheWeifuchuncontrolgroupwasnosignificantdifference(P>0.05).AnWeiTanglow-dosegroupandtheVitacoenzymegroupcomparecontrolgrouphavethedifferencewassignificant(P<0.05).TheeffectoftheAnWeiTanghighdosegroupandtheAnWeiTangmiddledosegroupregulationofNF-kBcontentefficiencybetterthanthegroupsofWeifuchunandVitacoenzyme.AnWeiTanghighdosegroupandtheAnWeiTanglow-dosegroupcomparetotheAnWeiTangmiddle-dosegrouphavethesignificantdifference(P<0.05).AnWeiTanghigh-dosegroupandAnWeiTanglow-dosegroupweresignifycantlydifferent(P<0.01).DifferentconcentrationsoftheAnWeiTangcontentregulationofNF-kBshowedadose-effectrelationship.③ThenumberofTUNEL-positivecellsofpathologicalmodelratscomparetotheblankgroup,theresultissmallnumberandscatteredandthenumberofapoptosisissignificantlyreduce(P<0.01).TherearemoreTUNEL-positivecellsinTheAnWeiTanghighdosegroupandTheAnWeiTangdosegroup,thenumberofapoptosisincreasedsignificantlybetweenthetwoaredifferences(P<0.05).AnWeiTanghigh-dosegroupandAnWeiTangmiddledosegroupcompareedwithmodelgroupandVitacoenzymegroupseparately,therearesignificantdifference(P<0.01).AnWeiTanghigh-dosegroupcompareedwithWeifuchungrouparesignificantdifference(P<0.01).TUNELpositivecellsoftheAnWeiTanglow-dosegroupandWeifuchungroupalsoincreasedandthenumberofapoptoticrise.ThecomparebetweenAnWeiTanglowdosegroupandWeifuchungroupwasnosignificantdifference(P>0.05).TheAnWeiTanglowdosegroupandWeifuchungroupcomparewithAnWeiTangmiddledosegroupwassignificantdifference(P<0.05).8 Conclusions:⑴AnWeiTangimprovethepathologicalformofexperimentalchronicatrophicgastritisrattissues,withtheroleoftheprotectionofgastricmucosa,repairofgastricmucosa.⑵InlowertoreducetheexpressionlevelofBcl-2andNF-kBgenecontent，AnWeiTanghigh-dosegroupwerestrongerthanthemediumandsmalldosegroup,andthemediumwerestrongerthanthesmalldosegroupshowingsomedoseeffectrelationship.⑶TheAnWeiTanginreducingthecontentofBcl-2andNF-kBgeneexpressionlevelsAnWeiTanghigh-dosegroupwerestrongerthanVitacoenzymegroup,andWeifuchungroup.⑷AnWeiTangreducethecontentofBcl-2andNF-kBgeneexpressionlevelsofratswithchronicatrophicgastritis,andpromoteapoptosisitcouldbeasignificantmechanismofgastricmucosalcellstodysplasiaandgastriccancerthedirectionofthechangeprocessbyreductionofAnWeiTang.Keywords:Anweitang；chronicatrophicgastritis；Bcl-2；NF-kB；CellApoptosis9 引言慢性萎缩性胃炎（CAG）是临床上常见的胃部疾患，是以胃黏膜萎缩变薄、腺体减少或消失为特征的疾病，常伴有肠上皮化生（IM）和不典型增生（ATP），由于其与胃癌尤其是肠型胃癌的发生密切相[1]关，WHO已将CAG定为胃癌前期状态。如何阻断和逆转CAG的发生、发展及其向胃癌演变，已成为目前国内外胃癌研究领域的焦点。慢性萎缩性胃炎（CAG）其癌变率为21.55%～71.46%。萎缩性胃炎伴肠化被认为是胃癌的一种癌前病变，经过一个漫长的,多阶段、多[2]基因的变异积累过程可发展成胃癌。慢性萎缩性胃炎可进一步发生肠上皮化生、不典型增生而癌变。细胞凋亡（Apoptosis）是由自稳机制促发的细胞程序化死亡,受基因调控。细胞凋亡与增殖失衡是肿瘤发生的生物学基础。近年来研究发现,胃粘膜病变和细胞增殖及凋亡关系密切,胃癌病人细胞凋亡受抑已是共识,而慢性萎缩性胃炎为胃癌前变化的最初阶段,国内临床报道中[3]药可以阻断或逆转胃癌的癌前病变,但其分子机制尚待阐明。因此,从细胞凋亡的角度阐明中药治疗CAG,干预胃癌的发生是我们研究的内容之一。Bcl-2是从B淋巴细胞瘤中分离出来的原癌基因,是至今为止研究得最多的抑凋亡基因。Bcl-2可以抑制多种因素诱导的细胞凋亡。研[4]究表明，Bcl-2抑制细胞凋亡可能与细胞催抗氧化作用、抑制钙离子[5][6]跨膜流动、离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白有关，目前Bcl-2是凋亡分子机制研究的主要靶分子。NF-κB属于真核转录因子家族,共有5个成员。研究表明,胃粘膜上皮细胞的凋亡调节与NF-κB有关。一方面,NF-κB可促进细胞凋亡,如引起促凋亡蛋白p53、Bcl家族中部分成员（Bax、Bad、Bcl-Xs）表达增[7][8]加。另一方面,NF-κB还可抑制细胞凋亡,如引起肿瘤坏死因子受10 体相关因子如TRAF1和TRAF2、凋亡抑制蛋白如c-IAP1和c-IAP2等表[8]达增加,从而延长细胞生存期。NF-κB是促进细胞凋亡还是抑制凋亡目前尚不清楚,可能与微环境状况、不同细胞因子相互作用、刺激物的毒性及宿主的免疫功能有关。中医药在治疗本病时，具有辨证论治、灵活加减、毒副作用小等特点，而显示出独特优势，与单纯西药相比更体现了它的优越性及组方的合理性。安胃汤是根据已故全国名老中医林沛湘教授治疗慢性胃病经验方基础上组方而成，在临床应用多年，疗效显著。由半夏泻心汤、芍药甘草汤、丹参饮及百合汤等方化裁组合而成。项目组的前期实验研究表明，安胃汤对大鼠慢性萎缩性胃炎血清胃泌素、胃动素及胃粘膜生长抑素的调节，达到改善胃粘膜的炎症反应，促进腺体的再生，增[9]加微循环血流，促进局部胃粘膜的修复。临床研究也证实了安胃汤对慢性萎缩性胃炎患者的血清胃泌素、胃动素及胃粘膜生长抑素的调节作用，并在胃镜及病理组织学上证实了安胃汤对胃粘膜的修复作用[10]。为了进一步研究安胃汤治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制，本研究从动物实验方面，探讨安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠细胞凋亡的影响，探讨细胞凋亡与慢性萎缩性胃炎发病及发展以及疗效的相关性，为安胃汤在临床上进一步应用提供可靠的实验研究的依据。11 正文1实验材料和方法1.1实验材料1.1.1实验条件本实验在广西中医药大学实验室进行。整个实验过程中，动物自由摄食和饮水。室温控制在18℃—22℃，日照充足，相对湿度维持在60%—70%。饲鼠所用颗粒饲料和垫料均由广西中医药大学实验动物中心提供。1.1.2实验动物健康清洁级wistar大鼠84只，雄性，体重140－170克。由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供（动物合格证号HNACSDC20100554）。适应性饲养3天，示正常生长后用于实验。1.1.3药物与试剂安胃汤药物组成：黄连5g、干姜5g、制半夏10g、百合15g、白芍15g、乌药5g、丹参15g、薏苡仁15g、木香7g、甘草3g等。采用免煎中药颗粒剂配方，由广西中医药大学附属瑞康医院提供。安胃汤按[11]标准动物的等效剂量折算系数法计算，大鼠的等效剂量为等效剂量人日用量95gx0.018x5=8.55g，大鼠灌喂安胃汤大、中、小剂量为8.55g的4:2:1倍，即34.2g、17.1g、8.55g安胃汤分别溶于2mL蒸馏水为大、中、小剂量大鼠每天的用量。胃复春片（杭州胡庆余堂药业有限公司产品，生产批号：国药准字Z20040003，广西中医药大学附属瑞康医院药剂科提供）。按人等效剂量的2倍量，即0.359gx12x0.018x5溶解于2m1，19.38g胃复春片溶于100m1蒸馏水，冰箱4℃保存。维酶素片（北京海淀区兴事堂药店，生产批号国药准字H13023904，广西中医药大学附属瑞康医院药剂科提供）。按人等效12 剂量的2倍量，即0.2gx12x0.018x5溶解于2m1，10.8g维酶素片溶于100m1蒸馏水，冰箱4℃保存。N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，简称MNNG(日本东京化学工业株式会社)。产品批号：M0527。购自上海国药化学试剂有限公司。实验时用水稀释为所需浓度，锡纸包裹容器避光冷藏保存备用。总RNA提取试剂盒（离心柱型）（目录号：DP419）（北京天根）购自南宁天地扬生物试剂公司；逆转录试剂盒（RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit）(Ferments)（#K1621#K1622）及引物均由上海生工生物工程有限公司提供；FSUniversalSYBRGrennMas（4913914001-1）由广州聚研生物公司提供；DNAMTarkerB马克、5xTBEbuffer缓冲液、GoldViewI型核酸染色剂、axygen0.2ml薄壁管、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（SK8141-N）由上海生工生物工程有限公司提供；鼠淋巴细胞分离液（产品编号P8620）：北京索莱宝科技有限公司产品；Trizol（产品编号15596-026，货物批号24401）:美国invitrogen生命技术公司产品；dNTP（目录号PC2403）：北京艾德莱生物科技有限公司产品；0.01MPBS(PH7.2)（粉剂）：福州迈新生物技术开发公司产品；DNase/RNase-FreeddH2o去离子水（DEPC水）（批号211648AX）：北京艾德莱生物科技有限公司产品。氯仿、琼脂糖购自南宁天地扬生物试剂公司。原位细胞凋亡检测试剂盒（型号ZK-8005），购自北京中山生物技术公司，组成：酶浓缩溶液（EnzymeSolution）、标记溶液（LableSolution）和转化剂-POD（Converter-POD），按照试剂盒说明书制备和使用；液体DAB酶底物显色试剂盒（20t.No.90708031c）：美国MatimBiotech.Inc公司产品，组成：DAB-SolutionA(20x)和DAB-SolutionB(20x)，按照试剂盒说明书制备和使用。枸橼酸缓冲液、蛋白酶K、异丙醇、ACD抗凝剂、1％乌拉坦液，10%甲醛溶液，冰生理盐水，医用无水乙醇，苏木素，伊红，二甲苯，13 浓盐酸，氨水，石蜡，蒸馏水等常规试剂由广西中医药大学实验室提供。1.1.4主要仪器设备1.1.4.1一般实验器材电子天平、大鼠台架、厚棉手套、量筒、烧杯、滤纸、电磁炉、玻璃棒、剪毛弯剪、消毒棉签、一次性1ml及5ml注射器、台灯、手术器械(无菌洞巾、止血钳、无菌手套、组织剪、有齿及无齿镊、持针钳、缝合针、无菌棉球、０号缝合丝线、手术刀等)、大鼠灌胃器等若干。1.1.4.2主要仪器7500荧光PCR仪；多通道PCR扩增仪(PTC-220美国MJ公司)SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）BIO-RAD电泳仪(Power/Pac300美国BIO-RAD公司)美国Bio-RadGeldoc2000凝胶成像分析系统低速大容量离心机（LXJ-IIB上海安亭仪器厂）德国EppendorfCentrifuge高速低温离心机（5810R）Eppendorf移液器（南宁市博仁生物科技有限公司）荧光定量八联管(PCR-0208-C南宁天地扬生物试剂公司)AAE140(AR2140)电子分析天平，上海奥豪斯公司HH-S-Ni-1-4型电热恒温水浴锅:北京华恒万仪仪器厂ZMN-9802全电脑组织自动脱水机:常州华利电子公司ZMN-7803全自动组织包埋机:常州华利电子公司RM2135旋转式显微镜用薄片切片机:德国美康公司TEC2500型恒温摊片烤片机:常州赫思琳医用仪器有限公司GZX-9246MBE电热鼓风恒温干燥箱:上海博迅实业有限公司SW-CJ-1F净化工作台:苏州安泰空气技术有限公司14 Thermo-80℃冰箱:美国Thermo公司(广州三元科技有限公司)LDZX-50KA立式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂CH30RF200奥林巴斯光学显微镜，OLYMPUS公司BX60数码摄影显微高清晰度彩色病理图文分析系统，OLYMPUS公司。1.2实验方法1.2.1实验动物分组健康清洁级wistar大鼠84只，雄性，体重140－170克，称量，标记，完全随机分为空白对照组（A组）、病理模型组（B组）、安胃汤大剂量组（C组）、安胃汤中剂量组（D组）、安胃汤小剂量组（E组）、维酶素对照组（F组）、胃复春对照组（G组）共七组，每组12只。1.2.2实验性大鼠慢性萎缩性胃炎模型的制备[12]造模方法依据张秋霞等方法进行，大鼠饮食不限，适应性饲养3天后，除空白组自由饮用自来水外，其它六组将配好的造模试剂MNNG储备液装入避光饮水瓶内给大鼠自由饮用，每24h更换1次药液，造模期间不再给予其它饮水，七组均普通块料饲养。8周后各组随机抽取模型组动物2只处死、开腹、取胃，在胃窦和胃体部各取一块组织，用10%甲醛溶液固定做光镜观察。1.2.3造模成功标准经病理确诊，慢性萎缩性胃炎的病理诊断标准参见《中药新药临［13］床研究指导原则》(2002年版)。⑴固有腺体萎缩；⑵黏膜肌层增厚；⑶可有肠上皮化生或假幽门腺上化生；⑷固有膜炎症；⑸可有淋巴滤泡形成。1.2.4给药方法A组：空白对照组：10只，正常喂饲料，4ml纯净水灌胃，1次/日。与其余各组同时至第12周结束。15 B组：病理模型组：10只，正常喂饲料，4ml纯净水灌胃，1次/日。与其余各组同时至第12周结束。C组：安胃汤大剂量组：10只，从第9周开始灌喂安胃汤混悬液，用安胃汤免煎剂配成浓度为17.1g/ml的药液，按1ml/100g灌胃，1次/日，连续灌胃给药至第12周结束。D组：安胃汤中剂量组：10只，从第9周开始灌喂安胃汤混悬液，用安胃汤免煎剂配成浓度为8.55g/ml的药液，按1ml/100g灌胃，1次/日，连续灌胃给药至第12周结束。E组：安胃汤大剂量组：10只，从第9周开始灌喂安胃汤混悬液，用安胃汤免煎剂配成浓度为4.26g/ml的药液，按1ml/100g灌胃，1次/日，连续灌胃给药至第12周结束。F组：维酶素对照组：10只，从第9周开始灌喂维酶素混悬液，浓度为0.1g/ml，按1ml/100g灌胃，1次/日，连续灌胃给药至第12周结束。G组：胃复春对照组：10只，从第9周开始灌喂胃复春悬浊液，5/6片配成液4ml，连续灌胃给药至第12周结束。各给药组以临床常用量按体表面积换算，安胃汤大剂量组实验灌胃剂量约相当于60千克成人临床日用量的4倍（每千克体重）；中剂量组实验灌胃剂量约相当于60千克成人临床日用量的2倍（每千克体重）；小剂量组实验灌胃剂量约相当于60千克成人临床日用量的1倍（每千克体重）。1.2.5标本采集及处理各组用药治疗4W后禁食24ｈ，股动脉取血后，立即剖腹取胃，距贲门和幽门1.5cm离断取出全胃，沿胃大弯侧剖开，冰生理盐水冲洗后，滤纸吸干铺开，并向胃窦近幽门口至胃大弯方向取0.5㎝×0.5㎝胃黏膜组织4块，除一块新鲜组织留作PCR外，其余组织迅速臵于10%中性甲醛中固定，按照常规脱水，石蜡包埋，5um厚度。16 行HE染色观察胃黏膜组织病理学改变，RT-PCR测定各组治疗前后CAG大鼠胃粘膜及血液中Bcl-2、NF-κB基因表达的改变，采用TUNEL法检测测定各组治疗后CAG大鼠胃粘膜细胞凋亡的改变。1.3观察指标及方法1.3.1大鼠一般状态观察各组实验性大鼠的体重、食欲、精神状态、活动情况、毛发光泽度及大、小便情况。一周测一次体重。1.3.2胃黏膜大体形态观察用药治疗4W后，禁食24小时，股动脉取血后，立即剖腹取胃，距贲门和幽门1.5cm离断取出全胃。沿胃大弯侧剖开，冰生理盐水冲洗后，滤纸吸干铺开后观察。1.3.3胃黏膜光学显微镜观察大鼠取血结束后，用75%乙醇消毒大鼠皮肤，开腹迅速切除胃，沿胃大弯侧剖开，取病变组织粘膜100mg左右，臵10%中性甲醛固定120min，后经梯度酒精（A）脱水，即(80%A～95%A×2～100%A×2)45min/次，二甲苯透明lh/次，浸泡石蜡3次，每次45min，常规石蜡包埋，连续切片，切片厚度5um，裱于干净载玻片上臵60℃度恒温箱中烤片6小时后，常规HE染色，臵光镜下观察，并进行显微摄影。HE染色程序⑴脱蜡至水:二甲苯10minx2→梯度酒精(100%→100%→95%→95%→90%→80%→70%)2min/次。⑵流动的自来水冲洗数min。⑶浸入苏木素染液浸染5min。⑷盐酸酒精分化5s→流水冲洗切片5min。⑸伊红染液染3min→自来水洗3min。⑹脱水:梯度酒精(95%→95%→100%→100%)2min/次→二甲苯30s。⑺晾干，中性树胶封片，结果观察。HE染色结果判定：细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。17 1.3.4胃黏膜与血液Bcl-2及NF-κB含量的测定1.3.4.1血细胞分离⑴大鼠股动脉取血，每只大鼠可取血10ml左右，将血放入预臵1mlACD抗凝剂的50ml塑料离心管中，将血液与抗凝剂充分混匀；⑵15ml玻璃离心管中加入3-5ml鼠淋巴细胞分离液，用玻璃滴管缓慢将约5ml抗凝血加在淋巴细胞分离液上，2500rpm离心15分钟；⑶用玻璃滴管吸取中间淋巴细胞层至另一15ml玻璃离心管中,0.01M的PBS洗细胞3次，1500rpm离心5分钟，将细胞转移至1.5mlep管中，离心去上清，加入500ulTrizol中，裂解备用。1.3.4.2胃粘膜组织大鼠取血结束后，用75%乙醇消毒大鼠皮肤，开腹迅速切除胃，沿胃大弯侧剖开，取病变组织粘膜100mg左右，直接放入1mlTrizol中，剪刀剪碎，研磨棒研磨后，放臵备用。1.3.4.3RNA提取⑴组织提取RNA样品，10000rpm离心5分钟，取上清液至于新的1.5mlEP管，加入200ul氯仿，颠倒混匀，室温放臵10分钟，10000rpm4℃离心10分钟，取上层水相至一新的1.5mlEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放臵5分钟，12000rpm4℃离心10分钟，弃上清液，加入500ul70%乙醇，旋起沉淀，10000rpm4℃离心5分钟，弃上清液，倒臵离心管，室温晾干后，加入100ulDEPC处理过的无菌水；⑵血液细胞提取RNA样品（过程同⑴）；⑶紫外分光光度计测A260、A280的OD值，计算RNA含量。1.3.4.4引物设计RatGAPDHFCCATGGAGAAGGCTGGGRatGAPDHRCAAAGTTGTCATGGATGACC扩增长度：195bpRatBcl-2FCGACTTTGCAGAGATGTCCARatBcl-2RCATGCTGGGGCCATATAGTT扩增长度：289bp18 RatNF-kBFAGCAACCGAAACAGAGAGGARatNF-kBRTGACCTGCGGGTAAGATTTC扩增长度：111bp注：F代表上游引物，R代表下游引物，每个因子有2条引物。1.3.4.5RT-PCRRNA1-3ug5*MMLVbuffer6ulOligo-dT1uldNTP2ulRnaseinhibeter1ul加DEPC水至30ul60℃反应，1小时95℃灭活5分钟Real-timePCR体系：SYBRgreenmix10ul上游引物1ul下游引物1ulcDNA2ul加灭菌水至20ulReal-timePCR反应过程：（40个循环）95℃预变性5分钟95℃变性30秒55℃退火30秒72℃延伸30秒最后溶解曲线30分钟19 1.3.4.6结果分析反应结束后保存检测数据文件，调节baseline的start值，stop值以及Threshold值，使Stdcurve窗口下的标准曲线图达到最佳（|r|介于0.97—1），在Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值B(Qty)。（图片见附录四）考虑到各个样本总RNA浓度的差异，最终计算结果按下列公式换算:目的基因蛋白相对含量=目的基因蛋白含量÷内参基因（GAPDH）蛋白含量×5/6。1.3.5TUNEL法检测测定各组大鼠胃粘膜细胞凋亡的改变⑴原理细胞发生凋亡的过程中，内源性的核酸内切酶会被激活使DNA发生裂解产生双链、低分子量DNA片段和高分子量单链DNA缺口端，这些链的缺口可以用酶标记核昔酸3’—H0末端做上标记。而本次检测的原理就是在非模板依赖的方式下使末端脱氧核糖核酸转移酶催化3’—H0末端核昔酸聚合反应，从而达到标记DNA裂解链断端缺口的目的。标记的荧光素由羊的结合辣根过氧化物酶(POD)的Fab段抗体识别。酶底物显色反应后，用光镜检查已染色的细胞。⑵方法①石蜡切片：常规脱蜡入水，石蜡务必脱蜡干净；②蛋白酶K：(20ug/m1溶于Tris/HCL中，Ph7.4—8.0)室温孵育15—30分钟。PBS洗2次。③标记:PBS洗2次，擦干样品周围的水，滴加50ul的TUNEL反应混合溶液，加盖盖玻片，在湿盒中37℃孵育60分钟。PBS洗3次。在荧光镜下分析样品结果。④信号转化和分析:擦干样品周围的水，加人50ulPOD转化剂，加盖盖玻片在湿盒中37℃孵育30分钟，PBS洗3次；加人50~100u1DAB底物溶液在室温下孵育10分钟，PBS洗3次；封片后荧光镜下20 分析样品结果。⑤阴性对照：经过固定通透后的细胞样品，加入含有核普酸混合液的反应液50ul代替TUNEL反应混合溶液，余下相同。⑥阳性对照：经过固定通透后的细胞样品，加入细球菌的核酸酶使之产生DNA链缺口，余下相同。⑶结果判断TUNEL阳性细胞（即凋亡细胞）在光镜下的特征是:细胞收缩变小，呈圆形，与周围细胞分离，凋亡细胞胞核被染成蓝黑色。凋亡指数(AI)计算方法:数5个高倍镜>1000个细胞，分开计凋亡细胞数目和总的细胞数。Al=凋亡细胞数/总细胞数×100%。1.3.6统计学方法所有数据均以均数±标准差(x±S)表示。用SPSS统计软件(Spss17.0forwindows统计学软件包)进行组间方差分析，多组均数比较采用ANOVA检验，以P<0.05为差异有显著性。21 2技术路线图Wistar大鼠随机分组造模观察造模成功与否药物干预处死动物PCR检测Bcl-2和1取血液样本观察胃粘膜NF-κB基因表达的2剖腹取胃粘组织形态改变膜组织组织石蜡包埋切片1行HE染色观察胃黏膜组织病理改变2TUNEL法检测检测胃粘膜细胞凋亡探讨安胃汤治疗CAG疗效及作用机制22 3实验结果3.1动物外观观察空白组大鼠：精神状态较好，食物摄取量稳定，体重增加，动作敏捷，毛色光泽，尾色淡红，大、小便正常；病理模型组大鼠：神态萎靡，食物摄取量渐减，形体偏小，反应迟钝，眼睛无神，毛发杂乱无光泽，喜换抱堆取暖，尾巴颜色淡白，大便时干湿稀。大鼠经过治疗后：上述症状和体征逐渐改善，治疗期间体重增长。安胃汤大剂量的改善情况比较明显；维酶素对照组、胃复春对照组、安胃汤低剂量组大鼠也有所恢复，但不及安胃汤大、中剂量组明显；低剂量组、胃复春对照组大鼠的一般表现略优于维酶素对照组。3.2胃黏膜大体形态观察正常组的胃黏膜粉红色，表面较多粘液，光滑有光泽，皱襞表面光滑、规则，胃壁的弹性较好；模型组胃黏膜厚度变薄，表面粘液少，色灰或偏白，皱襞稀少、较低甚至消失，排列紊乱，胃壁的弹力低；安胃汤大、中、小剂量组、维酶素对照组及胃复春对照组部分胃黏膜恢复情况良好，以高、中剂量组为明显。（见附录一）3.3胃黏膜光学显微镜观察空白组：胃黏膜厚，各层结构正常，胃黏膜上皮细胞排列整齐，固有腺体形状规则，细胞呈单层柱状，胞浆透明或呈小空泡状，腺上皮和腺管分界清楚。未见萎缩、脱落或缺损，可见少许嗜酸性粒细胞。（见附录二，图8）模型组：胃黏膜全层明显变薄，黏膜表面充血、黏膜下层充血，局灶上皮细胞脱落、糜烂，黏膜固有层淋巴细胞浸润、部分有淋巴滤泡形成、淋巴管扩张，胃黏膜固有腺体破坏，数量明显减少，排列稀疏紊乱，体积缩小，个别呈囊状扩张。（见附录二，图9）大剂量组：胃黏膜结构较清晰，各层结构基本正常，小灶性出血，23 未见炎症坏死，胃黏膜固有腺体丰富排列较规则，无明显数量减少，固有层见少许炎细胞浸润。（见附录二，图10）中剂量组：黏膜上皮变薄，可见黏膜表层有变性坏死(缺损)，小条状淋巴细胞浸润，腺体形状规则，未见萎缩脱落。（见附录二，图11）小剂量组：胃黏膜各层结构基本正常，黏膜表层多见小血管充血，黏液多，有变性，多灶性中性粒细胞浸润。（见附录二，图12）维霉素组：胃黏膜各层结构基本正常，黏膜可见灶性炎症坏死，腺体排列稍有紊乱，体积缩小，黏膜底层有小灶性中性粒细胞浸润。（见附录二，图13）胃复春组：胃黏膜上皮稍变薄，黏膜上皮排列整齐，黏膜灶性出血，未见明显萎缩、脱落或缺损，黏膜固有腺体排列稍有紊乱，多灶性中性粒细胞浸润。（见附录二，图14）说明胃复春、维霉素与安胃汤各组均能改善胃黏膜的病理形态，但以安胃汤高、中剂量组效果为佳。24 3.4胃黏膜和血液中Bcl-2及NF-κB含量的测定结果2曲线方程：△Ct=－263022Qty＋21.168900，R=0.971028（图片见附录四）3.4.1胃黏膜和血液中Bcl-2表达的影响⑴RT-PCR检测各组大鼠胃粘膜Bcl-2相对含量各组分别与空白对照组相比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组及维酶素、胃复春对照组与安胃汤大剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、小剂量组及胃复春对照组与安胃汤中剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）,维霉素对照组与安胃汤中剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。详见表1。表1各组大鼠胃粘膜Bcl-2相对含量的分析结果比较（x±s，n=10）组别nBcl-21）空白对照组(A)1073.8140±4.31142病理模型组(B)10201.0890±23.713611）2）4）安胃汤大剂量组(C)10123.1090±23.261811）2）5）安胃汤中剂量组(D)10138.1750±11.156701）3）6）安胃汤小剂量组(E)10152.2630±5.233251)维酶素对照组(F)10165.4540±5.649541)胃复春对照组(G)10151.7410±8.77014注：原始数据经正态性检验，属于正态资料，方差齐。与病理模型组比较1）P<0.01；与维霉素对照组比较2）P<0.01或3）P<0.05；与胃复春组比较4）P<0.01或5）P<0.05或6）P>0.05⑵RT-PCR检测各组大鼠血液Bcl-2相对含量各组分别与空白对照组相比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、25 中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组及维酶素、胃复春对照组与安胃汤大剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、小剂量组及胃复春对照组与安胃汤中剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）,维霉素对照组与安胃汤中剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。详见表2。表2各组大鼠血液Bcl-2相对含量的分析结果比较（x±s，n=10）组别nBcl-21）空白对照组(A)1071.9300±11.77925病理模型组(B)10180.7940±10.051361）2）4）安胃汤大剂量组(C)10104.4590±28.823641）2）5）安胃汤中剂量组(D)10123.3820±22.381401）3）6）安胃汤小剂量组(E)10142.5990±8.710211）维酶素对照组(F)10157.9330±10.814291）胃复春对照组(G)10140.0390±11.83980注：原始数据经正态性检验，属于正态资料，方差齐。与病理模型组比较1）P<0.01；与维霉素对照组比较2）P<0.01或3）P<0.05；与胃复春组比较4）P<0.01或5）P<0.05或6）P>0.05。表1及表2结果说明：⑴安胃汤大、中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01），说明安胃汤、维酶素、胃复春均能有效调控Bcl-2含量。⑵安胃汤大剂量组与维酶素组、胃复春组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤中剂量组与维酶素组比较有显著差异（P<0.01），与胃复春对照组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较有统计学意义（P<0.05）；说明安胃汤大、中剂量组调控Bcl-2含量的效果较维霉素与胃复春对照组效优。26 ⑶安胃汤大、小剂量组与中剂量组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤大剂量组与小剂量组比较有显著差异（P<0.01）；说明安胃汤不同浓度组对Bcl-2含量的调控呈量效关系。3.4.2胃黏膜和血液中NF-kB表达的影响⑴RT-PCR检测各组大鼠胃粘膜NF-kB相对含量各组分别与空白对照组相比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组及维酶素、胃复春对照组与安胃汤大剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、小剂量组及胃复春对照组与安胃汤中剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）,维霉素对照组与安胃汤中剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。详见表3。表3各组大鼠胃粘膜NF-kB相对含量的分析结果比较（x±s，n=10）组别nNF-kB1）空白对照组(A)10122.1460±7.32868病理模型组(B)10330.4660±15.860871）2）4）安胃汤大剂量组(C)10166.8490±7.466381）2）5）安胃汤中剂量组(D)10180.1700±12.605791）3）6）安胃汤小剂量组(E)10193.2670±13.804751）维酶素对照组(F)10205.6170±15.042951）胃复春对照组(G)10192.5920±6.89466注：原始数据经正态性检验，属于正态资料，方差齐。与病理模型组比较1）P<0.01；与维霉素对照组比较2）P<0.01或3）P<0.05；与胃复春组比较4）P<0.01或5）P<0.05或6）P>0.05。⑵RT-PCR检测各组大鼠血液NF-kB相对含量各组分别与空白对照组相比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、27 中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组及维酶素、胃复春对照组与安胃汤大剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、小剂量组及胃复春对照组与安胃汤中剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）,维霉素对照组与安胃汤中剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。详见表4。表4各组大鼠血液NF-kB相对含量的分析结果比较（x±s，n=10）组别nNF-kB1）空白对照组(A)10121.7180±12.50532病理模型组(B)10311.4400±14.295231）2）4）安胃汤大剂量组(C)10154.9240±7.681851）2）5）安胃汤中剂量组(D)10167.1640±8.757131）3）6）安胃汤小剂量组(E)10179.7460±13.159101）维酶素对照组(F)10192.0120±13.794211）胃复春对照组(G)10179.5370±12.22419注：原始数据经正态性检验，属于正态资料，方差齐。与病理模型组比较1）P<0.01；与维霉素对照组比较2）P<0.01或3）P<0.05；与胃复春组比较4）P<0.01或5）P<0.05或6）P>0.05。表3及表4结果说明：⑴安胃汤大、中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01），说明安胃汤、维酶素、胃复春均能有效调控NF-kB含量。⑵安胃汤大剂量组与维酶素组、胃复春组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤中剂量组与维酶素组比较有显著差异（P<0.01），与胃复春对照组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），与维酶素对照组比较有统计学意义（P<0.05）；说明安胃汤大、中剂量组调控NF-kB含量的效果较维霉素、胃复春对照组效28 优。⑶安胃汤大、小剂量组与中剂量组比较有统计学意义（P<0.05）；安胃汤大剂量组与小剂量组比较有显著差异（P<0.01）；说明安胃汤不同剂量组对NF-kB含量的调控呈量效关系。3.5细胞凋亡检测（TUNEL法）测定治疗后各组CAG大鼠胃粘膜细胞凋亡的改变情况。安胃汤大剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），其余各组分别与空白对照组相比较有显著差异（P<0.01）。安胃汤大、中、小剂量组及维酶素、胃复春对照组与病理模型组比较有显著差异（P<0.01），说明安胃汤、维酶素、胃复春均能促进细胞凋亡。安胃汤小剂量组及维酶素、胃复春对照组与安胃汤大剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤大、小剂量组及胃复春对照组与安胃汤中剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05），维霉素对照组与安胃汤中剂量组比较有显著差异（P<0.01）；安胃汤小剂量组与胃复春对照组比较无显著差异（P>0.05），安胃汤小剂量组与维酶素对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；说明安胃汤大、中剂量组促进细胞凋亡的效果较维霉素、胃复春对照组效优，安胃汤不同剂量组对细胞凋亡的调控呈量效关系。详见表5。表5各组大鼠胃粘膜细胞凋亡的改变情况分析结果比较（x±s，n=10）组别n细胞凋亡指数AI1）空白对照组(A)1020.8010±1.23695病理模型组(B)104.3740±0.804161）2）4）安胃汤大剂量组(C)1018.2240±1.250001）2）5）安胃汤中剂量组(D)1015.7250±1.741491）3）6）安胃汤小剂量组(E)1013.2530±2.223011）维酶素对照组(F)1010.8300±5.189111）胃复春对照组(G)1013.1050±2.42455注：原始数据经正态性检验，属于正态资料，方差齐。与病理模型组比较1）P<0.01；29 维霉素对照组比较2）P<0.01或3）P<0.05;与胃复春组比较4）P<0.01或5）P<0.05或6）P>0.05图片说明（图片见附录三）：与空白组相比，病理模型组大鼠TUNEL阳性细胞数目较少且散在分布，AI明显降低；安胃汤大剂量组和安胃汤中剂量组见较多的TUNEL阳性细胞，AI明显上升；安胃汤小剂量组、胃复春、维霉素对照组TUNEL阳性细胞也有一定增多。4讨论4.1现代医学对慢性萎缩性胃炎的认识[14-15]CAG和胃癌密切相关，已被WHO定为癌前疾病范围，肠上皮化生和胃粘膜异型增生都是胃癌前病变范围，经过比较长时间的[16]积累和变异过程后CAG有可能发展为胃癌。胃粘膜的异型与增生是指没分化成熟的细胞在胃内分化、增殖时偏出正常的生长，大多发生在胃上皮和肠化生上皮，当发生胃癌相关疾病时往往都会经过这样一个增生的阶段。该阶段在深层中原有的腺管会囊状扩张，从而导致异型增生出现局灶状，表面隆起，胞核发生增大和畸形，胞体形状变柱状，腺管排布密集。内镜下观察到的病灶大多在2cm以下，类似于表浅的隆起型的早期胃癌，有的有小息肉状、结节状或扁平花坛状（Ⅱa）；少数增生隆起的中央会有糜烂（Ⅱa+Ⅱc），或灶处平坦仅剩下粘膜粗糙、苍白等改变（Ⅱb）。跟据细胞的异形程度的不同，增生可分为轻、中和重度。轻、中度大部分为良性再生，临床可以多见轻度的、可逆转的炎症病变；中度会变为长时期的稳定阶段；约10%的患者可能由于时间的变化而发生进展，5到15年有可能变为重度的异型增生。当进入重度阶段则病变发展会变得加速，是癌前相对比较短的一阶段，可能在被确诊为重度异型增生同时或在此之后的几个月内会有一半以上的概率发现胃癌存在。可以认为CAG发生在先，胃癌在后，是胃癌发生的先决条件。CAG主要的发生部位在胃窦与胃体部，可以分为胃体胃炎（A型）与胃窦胃炎（B型），两者都有30 可能恶化成为胃癌。A型因为有内因子等分泌的参与可能会发生恶性贫血，所以WHO把恶性贫血也当作胃癌前的疾病。我国比较常见有B型。CAG的病变特点是以腺体发生萎缩（低酸和无酸）、粘膜的慢性炎症以及胃粘膜发生化生（主要是肠上皮化生）为主。病变较重者其胃粘膜的肠化生程度也会较广泛，且常见异型增生，还可能甚至癌变。CAG的病因学因为有待完善，一般认为与环境因素和自身的体质相关联。凡是有可能导致胃黏膜损伤的，如咖啡、酒、茶、过冷、粗糙、过热的食物刺激；各种导致反流的原因都可以破坏黏膜屏障，比如尼古丁，会影响胃黏膜血液循环从而导致幽门括约肌的功能紊乱造成胆汁返流；还有长期服用非皮质激素类消炎药等据有抑制胃黏膜前列腺素的合成作用药物，破坏黏膜屏障等的都可以视为损伤因素；HP的感染和CAG的发生也密切相关，临床统计有90%以上的CAG患者伴有HP感染。随体制下降、年龄增加，表皮生长因子和胃泌素等的缺少，或胃黏膜的神经终器对这些因子刺激不敏感，都可能会引发黏膜萎缩，从而累积为CAG的发病，概率增高。除此之外，营养不良、肝硬化合并门脉高压、心衰等都可能会引起CAG的发生。临床上的慢性肾上腺皮质功能减退、糖尿病、干燥综合征和甲状腺病患者也都多伴有CAG。胃部其他疾病（如胃液过多、胃溃疡、胃息肉等）也常合并发生在CAG中。此外还有遗传因素等等。目前现代医学关于慢性萎缩性胃炎尚无特效疗法，能找到病因者应进行病因治疗。①饮食少食用过甜过酸的饮料或食物，宜无刺激性的容易消化的食物，忌咖啡、烟酒和浓茶，进食的时候要细嚼慢咽等。②对症治疗以对症治疗为主，恶心、腹胀、呕吐可口服胃肠动力药，如多潘立酮、甲氧氯普胺或西沙必利；消化不良者予胃黏膜保护剂如硫糖铝；有胆汁返流的可以予硫糖铝配合胃肠动力药，中和胆盐防止返流症；有肠腺化生者可给予胃复春，猴菇菌片及维生素等；31 伴恶性贫血者可给予维生素B12和叶酸。对有不典型增生和肠腺化生者应该密切随访，最好6到12个月复查胃镜。③抗菌HP感受阳性者可给予H2受体拮抗剂或质子泵抑制剂加两种抗菌药为主的三联疗法，也可给予以铋剂为主的三联疗法，如甲硝唑、阿莫西林、枸橼酸铋钾。青霉素过敏者可用四环素、呋喃唑酮、庆大霉素、克拉霉素[17]等，甲硝唑胃肠反应不能耐受者，可改用替硝唑。李兆申强调根除HP的重要性，根除HP有可能提高逆转机率，调整动力同时要注意抑酸、抗酸，加强与改善胃黏膜保护机制等措施。④外科手术适用于同时伴有重度肠腺化生或重度不典型增生，尤其是不完全性的大肠腺化生。4.2中医对慢性萎缩性胃炎的认识传统中医学里面没有慢性萎缩性胃炎这一病名。根据文献对“胃痞”、“胃脘痛”等的记载，从临床表现上判断可纳入这些范围。《诸病源候论•卷二十二》中对脾胃病的病因何病机论有以下论述观点：“脾者，脏也。胃者，腑也，脾胃二气，相为表里。胃受谷而脾磨之，二气平调，则谷化而能食。若虚实不等，水谷不消，故令腹内虚胀，或泄，不能饮食，所以谓之脾胃气不和不能饮食也。”4.2.1标本论在中医观点里认为本病的基本病机应该是本虚标实：脾胃虚弱、[18]气血阴阳亏损等为病本，寒热错杂、气滞血瘀是病标。周信有教授认为病因病机有虚实两个方面：虚者表现为久病不愈、素体不足，脾阳不足，脾胃虚弱，寒从中生，或胃络失养，胃阴不足而痛；实者表现为情志失调、饮食不节、寒邪客胃而导致胃气阻滞，痞满疼痛，食滞不化，和降失司，这些多在脾胃气虚的基础上形成血瘀、寒凝、气[19]滞，因而形成了本病本虚标实、虚实夹杂的病理特点。邓铁涛教授认为CAG为本虚标实的虚损病：发病的前提和本质为本病之虚，主要为脾胃亏虚，胃亏虚于阴液，脾亏虚于阳气；本病之实，多为虚损32 之后所继发，脾气亏虚血失鼓动，血滞成瘀因而阻络，或者脾失健运，湿浊不化痰湿停聚，阴液亏损加之痰阻湿郁，引起虚火妄动。4.2.2脾虚论[20]黄明河教授认为，本病的基本病机是脾胃气虚，气滞血瘀，往往兼有肝胃不和、湿热中阻或阴虚，总属虚实夹杂，本虚标实，以活[21]血化瘀、益气健脾为治疗大法。陈福如认为劳倦所伤、七情所伤、饮食不节、络脉瘀阻、气血不和是导致该病发生的最常见病因，运化无权、脾胃虚弱是决定性因素，此外慢性浅表性胃炎失治也可演变成该病，药物因素也可导致诱发CAG的复发或发生，因此，应从CAG的转归、脏腑功能相关论、脾胃的生理功能及病程来认识本病的病机。[22]单兆伟教授认为“久病多虚”，本病病程较长，是一种慢性疾病，乃本虚标实之证，治疗应标本兼顾才能够取得较好疗效，健脾益气是基本的治疗方法，脾胃虚弱为本病的基本病机。4.2.3瘀毒论[23]田德禄教授认为本病病机特点是虚实夹杂，实，主要是湿阻、气滞、血瘀等；虚，重在脾胃阴虚、气（阳）虚；病变以脾胃为中心，可影响到肝肾，缠绵难愈与邪毒未尽有关：一方面，胃为阳土，易从阳化火，热盛火盛成毒；另一方面病程迁延正虚邪恋，湿性秽浊久蕴成毒；结合西医学认为本病与HP感染有关，提出本病发病与虫毒密切相关，毒可致瘀生热，若毒痰瘀三者互结往往可导致变症发生。蔡[24]春江等认为CAG发展形成过程中“毒”和“浊”既是病理产物，也是一种致病因素，CAG患者气机壅滞，胃腑损伤，日久则浊聚、气滞、食积、血瘀、痰结、郁火、湿阻诸症蜂起，而最重要的莫过于浊、毒之邪，浊毒相干难解难分，如油入面终使胃热阴伤，胃络瘀滞，气滞络阻，胃液减少，胃失滋润荣养，黏膜变薄，腺体萎缩，日久成萎。33 4.2.4血瘀论[25]侯冬梅等通过研究发现除肝胃不和型外，CAG患者均有显著的全血黏度异常，呈明显高黏状态，有微循环障碍，胃黏膜存在瘀血的病理改变，指出其与热邪、阴虚、气虚、瘀阻所致血瘀证有内在联[26]系。李秀仙认为，瘀血与CAG有密切关系，气滞则血行不畅，阴虚胃热则液枯津亏，气虚则血运无力血脉不充、血行不畅均可致瘀。结合胃镜下观察见黏膜下血管透见、胃黏膜萎缩变薄，认为血管壁增厚、管腔狭窄、黏膜血管的扭曲等一系列病理改变亦属血瘀的范畴；并提出适当合理选用活血化瘀之品，具有抑制组织异常增生、消除炎症、镇痛、调节免疫、改善胃黏膜血液循环等作用，从而可以达到改善临床症状，逆转不典型增生（ATP）、胃黏膜萎缩及肠上皮化生（IM）的目的。4.2.5正虚邪实[27]杨容青认为CAG致病机理与气血营运密切相关，发病往往由于饮食、劳倦、情志诸因伤胃，胃气不降的同时又影响并阻碍了脾土的运化，日久产生湿阻、气滞、血瘀、热蕴等邪，且耗伤阴津，损伤中气，脾胃虚弱，人体脏腑的升降出入运动维持脏腑间及外界环境间的阴阳平衡，而中焦脾胃是血液的生化之源，气血营运赖其所主，其升降又是全身气机之枢纽，同时胃乃多气多血之腑，胃内气血状况直接影响着胃的强盛衰落；血运如何每因胃的通降功能障碍程度而改变，而气血营运失常又每多先伤胃气。凡胃腑气血失于调畅多见胃气虚弱、气机痞阻，或胃气壅滞，久而终致血瘀，化热伤阴影响血行成气血营运障碍为患，如《临证指南医案》所云:“久病入络，气血皆空”“凡气久阻，血亦应病”。初病在气分，气机遏阻胃痛且痞，有碍化生水谷之精微，继之则兼瘀，见血行迟滞，瘀阻血络，迁延不愈，瘀血凝聚于胃，瘀血不散则气血升降功能则伤之更甚，久之则胃气衰败，形成恶变。故CAG有实证、虚证之分。实证以胃脘胀痛为主，34 包括胸背痛、胁痛、热痛、刺痛、等，疼痛拒按，便燥，喜冷饮，口干苦，苔薄黄脉弦紧为多见。在实证中常见证型有血瘀痰阻、胃火郁热、肝郁气滞、食滞伤胃。虚证以胃脘部疼痛为主，包括冷、胀、灼痛，喜热饮喜温喜按，多见苔白脉沉。在虚证中常见证型有气阴两虚、脾胃虚热、脾胃虚寒。另外，尚有肝郁脾虚者，属虚实夹杂证型。可通过电子胃镜、病理分析等现代医学分析解剖手段进行虚实辨证，通过观察胃黏膜病变与证的关系能更有效地增强辨证分型的准确性。如CAG胃镜病理，胃黏膜红白相间以红为主，甚至充血、水肿、胆汁返流，多为气滞证；胃黏膜红白相间，以白为主，甚至黏膜苍白，组织缺损，多为虚寒证；胃黏膜萎缩、粗糙，具有细小颗粒或有较大结节，形似息肉，血管显露或局部见有瘀血，多为血瘀或血瘀痰阻证；胃黏膜糜烂，颜色变白，腺体萎缩，血管显露，多为气阴两虚证或伴有瘀血所致。大致可以得出目前中医学界对CAG病因病机比较一致的看法是：本病脾胃亏损较为突出，是主要的病理表现，脾阳虚弱、胃阴亏损加上血脉瘀阻导致胃失于濡养，是胃腺体萎缩的重要病机。正虚为本，邪实为标，虚实错杂；病位在胃，病变涉及肝、脾、肾等脏器。在共同认识下稍微不同的是：有学者强调“虚损为本”，有学者强调“邪实为主”，也有学者强调“虚实错杂为主”。4.3中医药治疗现状我国胃癌死亡率居各类肿瘤死亡率之首，中药阻断胃癌前病变有着重大的意义，中医中药在CAG的现代治疗中发挥了较多优势。4.3.1治疗原则[28]⑴调气活血:肝脾胃功能的紊乱，胃为多气多血之府，胃病之初期尚在气分，日久入血，发展至萎缩性胃炎时，瘀血之象渐现。“久病多瘀”，一方面慢性萎缩性胃炎患者一般病情迁延，渐致脾胃气虚，气为血之帅，气虚无力助血行，而致血瘀；另一方面慢性萎缩性胃炎35 患者因肝脾胃功能的失和，导致气机不畅，必然引起血行壅滞，产生血瘀征象；血瘀既是病理因素又是病理产物，血为气之母，血瘀又加重气滞和气虚。瘀血不去，新血不生，最终气血两虚。因此，在治疗慢性萎缩性胃炎过程中，要辨清补气行血、行气活血和气血双补，且[27]重视活血化瘀在治疗本病中的地位，并贯彻整个治疗始终。杨容青认为本病临证治疗以气血营运为主导，以流通健运主证主方，将条达气血、生化气血，使气血升降功能恢复正常作为治疗重点，融于方药运用之中，是CAG处方用药的主要思路和思维方法。⑵健脾和胃:胃是水谷之海，腑以通为用以降为和。慢性萎缩性胃炎由于诸种病因所致脾胃功能的紊乱，升降失司，日久脾胃虚弱，则诸症皆显。腐熟水谷的功能有赖于脾的升清和胃之降浊，脾胃同处中州互为表里，生理相连，病理也相为影响。因此，治疗上要注重调胃健脾、升降相因。如《临证指南医案》所述：“脾宜升则健，胃宜降则和”。⑶补虚泄实:慢性萎缩性胃炎性质属虚实夹杂，病程较长，“久病多虚”因虚致实。因此，治疗上要掌握攻补轻重、攻补兼施、补虚泻实之妙。⑷疏肝和胃:肝喜调达而主疏泄为刚脏。若气机不畅肝失疏泄则横逆于胃，致胃胀痛不适；胃主受纳腐熟水谷，其功能的正常与否与肝的调畅和疏泄气血之运行密不可分。《沈氏尊生书》中曰：“胃痛，邪干胃脘病也……唯肝气相乘为尤甚，以木性暴，且正克也。”治疗应调畅气机疏肝和胃，以达胃之安和目的。4.3.2辨证施治4.3.2.1中药治疗[29]高富贵将本病中医辨证分为胃阳虚、胃阴虚和胃阴阳两虚3型。胃阳虚型用香砂六君子汤合理中汤加减；胃阴虚型用自拟三酸汤加味；胃阴阳两虚型以自拟益胃汤加减，结果治疗CAG108例统计36 [30]总有效率93.5%。张子理对68例合并肠化或异型增生的CAG进行辨证分型治疗:脾虚气郁用香橼枳术汤治疗，脾胃虚寒用黄芪建中汤治疗，肝胃不和用四逆散治疗，异型增生逆转率为58.14%，肠化[31]逆转率为64.00%，总有效率为94.12%。董建华等分为脾胃气虚、虚火灼胃和气阴两虚三个证型，分别用甘温建胃方（党参、木香、三七粉、黄芪、茯苓、白术等）、甘平养胃方（太子参、鸡内金、香椽皮、炙百合、乌药）和酸甘益胃方（石斛、乌梅、佛手、沙参、麦冬、丹参）。其中癌前病变征象改善率为95.76%，消失率为52.12%，主[32]症痊愈率达65.45%，改善临床症状率达98.78%。邢士杰等观察本病60例，分为四个证型，以香砂六君子合黄芪建中汤加减健脾温中和胃治疗脾胃虚寒证；以化肝煎加减疏肝清热和胃治疗肝胃郁热证；以沙参麦冬汤加减滋养胃阴治疗胃阴不足证；以柴胡疏肝散加减疏肝和胃治疗肝胃不和证。结果:有效32例（53%），显效24例（40%），无效4例（7%）。[33]孟氏针对CAG血瘀、气阴两虚的基本病机，治以“活血通络、益气养阴”，以丹参饮加减合叶氏养胃汤，若脘腹胀满者加炒莱菔子、砂仁；胃痛寒甚加川椒；消化不良者加炒鸡内金；便溏加白扁豆、炒山药。同时还可参照胃镜下黏膜的表现进行微观辨证，如黏膜光滑、薄脆，分泌物少，颜色以红为主，治以养阴益胃，以麦门冬、石斛、太子参、知母等滋阴之品为主；如黏膜苍白、变薄，胃壁蠕动减弱，黏膜下血管清晰可见，治以健脾益气，以白术党参、黄芪等为主；若伴有不同程度的不典型增生或肠上皮化生，酌加薏苡仁、白花蛇舌草等以活血、清热解毒并有一定的抗癌作用，利于恢复癌前病变；若见到胃镜下水肿、黏膜粗糙不平、暗红或有结节隆起呈鹅卵石样或颗粒状，或有幽门变形、瘀点瘀斑、瘢痕形成等，治以活血化瘀，加用三[34]七、丹参等。白氏自拟三参调胃汤加减[茯苓、石斛、沙参、枳壳乌梅、三七粉（冲服）、白术、丹参、党参、白及、蒲公英]加减治疗37 慢性萎缩性胃炎85例，有效27例，显效54例，有效率95.3%，明[35]显优于口服维酶素片、维胃合剂及复方胃友片的对照组。孙氏自拟丹参泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎45例，用干姜、半夏、丹参、黄芩、黄连、蒲公英、党参等为基本方，若HP阳性，偏湿热者，加连翘、白花蛇舌草；伴不典型增生、肠上皮化生者加土茯苓、莪术；偏虚寒者减黄连、黄芩用量，加高良姜、白术、桂枝；总有效率88.9%。李[36]氏以温、清、和、补、消5法合用为基础制定消痞汤（半夏、莪术、苦参、丹参、党参、白术、枳实、黄连），湿盛型去枳实、白术，加炒白芍、炮干姜、茯苓；气滞型加桂枝、黄芪；虚火型去莪术、半夏、党参易太子参，加乌梅、石斛。共治疗慢性萎缩性胃炎105例，[37]总有效率97.14%。袁氏用半夏泻心汤随症加减治疗36例，总有效率为94.44%。[38]赵氏用益胃化瘀汤（白芍15g、百合15g、佛手12g、莪术10g、丹参18g、乌梅9g、山楂20g、当归9g、太子参15g、麦门冬10g、三七粉5g、香橼12g）治疗CAG45例，有效率达88.89%，随证加减：上腹痛者，加延胡索、川楝子；吐酸者，加瓦楞子、乌贼骨；胃阴虚者，加玉竹、石斛；腹胀者加莱菔子、木香、炒麦芽、厚朴；恶心欲[27]呕者，加姜竹茹、藿香。杨容青治疗胃阴虚热者，治以养胃生津、调中养阴，选用麦门冬汤为主方；胃火郁热者，治以通下存津、清热和胃，选用大柴胡汤为主方；肝郁气滞者，治以理气和胃、舒肝解郁，选用四逆散为主方；气阴两虚者，治以调中和胃、益气养阴，以益气养阴汤为主方；脾胃虚寒者，以温中散寒、甘温补虚，选用黄芪建中汤为主方；血瘀痰阻者，治以活血化瘀、益气通络，选用丹泽汤为主方；食滞伤胃者，治以和胃止痛、消食导滞，选用平胃散为主方；属虚实夹杂之肝郁脾虚者，治以健脾化湿、舒肝和胃，选用柴平汤为主方；吞酸嘈杂者加吴茱萸、黄连；心悸不寐者加五味子、炒枣仁；干哕者加竹茹、白豆蔻；胃冷者加高良姜、丁香；腰膝软者加杜仲、牛38 膝；刺痛甚者加五灵脂、蒲黄；背痛重者加葛根、细辛；胀重者加佛手、枳壳、厚朴；胁痛重者加郁金、香橼；胃脘胀痛甚者加香附、延胡索；腹痛重者加香橼、香附；腹泄便溏者加五味子、诃子、黄连等。诸药与主证主方配合，随证加减常获良好效果。4.3.2.2针灸或针灸配合中药内服疗法不少学者研究发现，针灸在CAG的治疗中也有较好的疗效。王[39]氏等采用针刺配合中药内服治疗CAG48例，取穴足三里、胃俞、中脘、内关，脾胃湿热加三阴交、阴陵泉，气滞血瘀加血海；肝胃不和加太冲、肝俞；用平补平泻法，另服中药汤剂（炒白术、麦门冬、茯苓、炙黄芪、太子参、黄芩、百合、白花蛇舌草等）随证化裁。结果显示，临床显效15例，治愈9例，有效16例，无效8例，总有效[40]率83.3%。孙氏等采用针灸取中脘、曲泽、内关、胃俞、足三里等穴治疗CAG30例，结果治疗组与对照组（甲硝唑、克拉霉素及维生素）总有效率分别为90%、75%，治疗组疗效明显优于对照组[41]（P<0.05）。黄氏等运用艾灸与中药口服相结合的方法，将84例CAG患者随机分为治疗组与对照组各42例，治疗组用艾条悬灸足三里、中脘、天枢加口服健脾泻心汤（白术、广木香、半夏、砂仁、陈皮、茯苓、太子参、黄芪等），每日2次，1个月为1疗程。对照组服用叶酸5mg，每日2次；有Hp感染加用甲硝唑0.4g，每日2次，阿莫西林0.5g，每日3次，口服2周；腹胀、消化不良加用丽珠得乐220mg，每日2次，西沙比利5-10mg，每日3次。结果显示：治疗组有效21例，显效18例，无效3例，总有效率92.86%；对照组有效16例，显效14例，无效12例，总有效率71.43%，治疗组总有效率高于对照组，统计学有明显差异（P<0.05）。4.4动物实验模型研究4.4.1运用各种理化因素反复刺激胃黏膜形成慢性胃炎[42]张淑芹等用Wistar大鼠20只，雌雄各半，用2%水杨酸钠溶39 [43]液灌胃共6周，6周后光镜检查造模成功。张沥等用55℃150g/L氯化钠灌胃，每次2.5mL，每日2次，10周后建立大鼠模型。陶梅等[44]运用55℃蒸馏水，2.5mL/d，共灌胃24周，建立大鼠萎缩性胃炎[45]动物模型。北京中医药大学赵凤志模仿此法并且做改进，以10%NaCl和60~70℃热糊，结合幽门环处金属弹簧植入法，灌胃2次/周，4个月后成功复制出大鼠慢性萎缩性胃炎模型，并伴有不同程度IM及异型上皮增生，为胃癌的前期科研实验创造了有利的条件。杨[46]鸿等建立胆汁反流导致的CAG动物模型，采用大鼠十二指肠横断加胃空肠吻合术，引起胃黏膜萎缩并初步分析其损伤机制：发现术后第14和20周大鼠的胃黏膜就出现萎缩性改变，病理形态学积分显著增高。上述两种方法由于其造成的模型病变都比较局限，均是由手术[47]方法建立的，所以没有太多报道。苏剑东等采用体积分数为60%乙醇、50℃脱氧胆酸钠（20mmol/L）空腹灌胃及氨水自由饮用法来刺激胃黏膜，给予模型组（20只）6个月，对照组（10只）正常饲养，造模结束时有4只出现伴不典型增生，8只出现伴明显肠上皮化[48]生，造模成功率答90%。姒健敏等应用0.05%吲哚美辛，20mmol/L去氧胆酸钠，60%酒精，0.05%~0.1%氨水，对SD大鼠给药6个月，[49]成功地建立CAG模型，且稳定性良好。危北海等采用寒凉胆汁灌胃、主动免疫、饥饱失常、去氧胆酸钠自由饮用的综合法，90天后成功造出大鼠CAG模型。4.4.2免疫因素制模法[42]张淑芹等采用主动免疫法建立慢性萎缩性胃炎模型，以Wistar大鼠雌雄各半共20只，每只大鼠皮下注射佐剂抗原（用同品系大鼠胃黏膜的生理盐水组织匀浆与Freund佐剂1∶1配成乳剂）0.3mL，3周后重复注射1次，并且双日自由进食，单日禁食，6周后病理证实造模成功。40 4.4.3有中医特色的病症结合模型[50]陈小野等观察大鼠CAG病与证相结合的模型实验，发现第四十五周胃黏膜病理改变，该模型复制用的是脱氧胆酸钠加主动免疫和阿斯匹林溶液的交替饮用方法。其中肾虚证的模型采用的是阿斯匹林溶液或者以0.08%浓度加入脱氧胆酸钠溶液中自饮肝郁证的模型采用的是肾上腺素注射加夹尾法；脾虚证的模型制备采用的是破气、耗[51]气加上饥饱失常法；造模时间总共是40周。徐珊等用MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)，用电子分析天平称取MNNG2g，用蒸馏水以2000mL稀释配成浓度1mg/mL的保存液，每3天配制一次，4℃的冰箱中避光保存，每天取保存液将其稀释浓度为100/mL作为各慢性萎缩性胃炎模型组大鼠的饮用水，共10周；同时用浓度40%的乙醉灌胃，2mL/只，每逢周一、四各灌胃1次，共10周。其中，湿热证的模型组第7周起撤除普通饲料，换成高脂高糖饲料（2%胆固醇、20%蔗糖、67%普通饲料、1%胆酸钠、10%猪油、）喂养，同时每天将大鼠放进人造模箱，恒温干燥箱内放有湿温度表和超声雾化器，箱内相对湿度（95±3）%，温度在（33±2）℃，2h/（次·d），造模4周；肝郁组第7周起用钳子夹大鼠尾部，使老师处于激怒、打斗状态，30min/（次·d），并且每7天0.15%肾上腺素腹侧皮下注射1次，每次每只用量是0.1mL（含肾上腺素0.1mg），共4次，造模4周；脾虚证的CAG模型组，从第7周起用饥饱失常加上苦寒泻下法建立脾虚证候模型：大鼠每天灌胃生大黄煎剂，浓度为1g/mL，20mL/（kg·d），1次/d，并且采取双日足量喂食，单日禁食，连续6周。4.4.4生物制模法[52]Li等用小老鼠的适应性H.pylori（cagA2，vacA2）来接种大鼠，结果两个月后大鼠全部成功感染，其主要发生部位在胃窦，有些大鼠还发现溃疡。溃疡边缘与胃窦部位能观察到轻至中度的炎症，溃疡愈合时间延长，细胞凋亡数目明显增加。41 4.5关于细胞凋亡的讨论细胞凋亡（Apoptosis）是由自稳机制促发的细胞程序化死亡，受基因调控。1972年英国科学家Kerr等人首先提出了生物学中的[53]Apoptosis的概念。细胞凋亡作为细胞的一种基本生命现象，不仅在个体形成、器官细胞量的平衡、机体衰老方面发挥重要作用，而且它与肿瘤的发生也密切相关。细胞凋亡与增殖失衡是肿瘤发生的生物学基础。细胞凋亡是胃粘膜上皮细胞死亡的主要形式，与其生长发育、衰老、炎症及肿瘤等生理病理状态密切相关。粘膜凭借凋亡与增殖之间的平衡维持其完整性，细胞凋亡的抑制与细胞增殖的增强两者都是肿瘤发生和生物学基础。近年来研究发现，胃粘膜病变和细胞增殖及凋亡关系密切，细胞增殖和凋亡的相互消长决定了许多胃粘膜病变的发[54，55]生、发展及转归。研究发现CAG胃粘膜细胞凋亡增加，并认为[56，57]此种变化与粘膜萎缩、肠化乃至癌变都有密切关系，有学者据[58]此推测细胞调亡是胃癌演化进程中的早期事件。研究还发现细胞凋[59]亡与细胞增殖呈负相关。胃癌病人细胞凋亡受抑已是共识，而慢性萎缩性胃炎为胃癌前变化的最初阶段，国内临床报道中药可以阻断或[3]逆转胃癌的癌前病变，但其分子机制尚待阐明。因此，从细胞凋亡的角度阐明中药治疗CAG，干预胃癌的发生是我们研究的内容之一。Bcl-2是从B淋巴细胞瘤中分离出来的原癌基因，是至今为止研究得最多的抑凋亡基因。该基因含有3个外显子，其编码的蛋白质主[60]要分布于细胞膜、核膜和线粒体膜。Bcl-2可以抑制多种因素诱导的细胞凋亡。研究表明，Bcl-2抑制细胞凋亡可能与其以下几种作用[4]有关。1.细胞催抗氧化作用：在去除生长因子所诱发的凋亡中，活性氧损伤（ROS）是促发细胞死亡的主要诱因，Bcl-2的过度表达可减少氧自由基产生和脂质过氧化物的形成。Bcl-2可以抑制细胞色素c的释放，从而抑制了超氧阴离子的产生。此外，Bcl-2还可以增加42 胞内的谷胱甘肽（GSH）等抗氧化剂，升高NAD+/NADH的比值，抑制和凋亡相联系的GSH降低，促进GSH进入核内，从而影响细胞的氧化还原状态。但也有证据表明，在没有自由基的情况下Bcl-2也能抑制凋亡。因此，Bcl-2的性质远非仅仅是一种抗氧化剂。2.抑制[5]钙离子跨膜流动：Wei等曾报道钙泵特异性抑制剂Thapsigargen（TG）诱导的WEH17.2等细胞的凋亡可被Bcl-2所抑制，其原因是Bcl-2抑制了Ca2+的跨膜流动，提示Bcl-2可通过调节胞内钙离子浓[6]度来调节凋亡。3.离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白最近Reed提出Bcl-2蛋白可能具有双重功能：离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白，提出Bcl-2抑制凋亡的部分新机制。目前Bcl-2是凋亡分子机制研究的主要靶分子。NF-κB属于真核转录因子家族，共有5个成员，根据它们的Rel同源结构域（RHD）C末端不同分为两类:一类是NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52），分别由前体蛋白p105和p100水解而来，C端不含转录活化域；另一类由RelA（p65）、RelB和RelC组成，C端含有转录活化域。NF-κB成员相互形成同源或异源二聚体后才具有转录活[61]性，通常所说的NF-κB是特指p50-RelA异二聚体。一般通过NIK→IKK→IκB→NF-κB信号通路活化NF-κB，即各种细胞外刺激激活NF-κB诱导激酶（NIK），NIK又激活IκB激酶（IKK），后者引起IκB磷酸化。磷酸化的IκB和泛素结合后被降解，NF-κB游离出来并转位至核，作用于目的基因的转录调控区，调控基因表达。NF-κB活化的反馈调节有正反馈和负反馈两种方式，即NF-κB调控的基因表达产物中既有能促进其活化的产物如TNF-α等，也有能抑制其活化的产物如IκBα。大约100余种基因可被NF-κB调控，多种细胞因子和粘附分子的基因启动子或增强子中都具有NF-κB结合位点。研究表明，胃粘膜上皮细胞的凋亡调节与NF-κB有关。一方面，NF-κB可促进细胞凋亡，如引起促凋亡蛋白p53、Bcl家族中部分成43 [7]员（Bax、Bad、Bcl-Xs）表达增加。p53亦可诱导Bax活化、刺激[8]细胞色素C释放、激活Caspase级联反应而促使细胞凋亡。Ryan等[62]新近研究结果也证实NF-κB在p53基因的上游对其进行调节，抑制NF-κB活性，明显降低p53对肿瘤的监视作用。另一方面，NF-κB[8]还可抑制细胞凋亡，如引起肿瘤坏死因子受体相关因子如TRAF1和TRAF2、凋亡抑制蛋白如c-IAP1和c-IAP2等表达增加，从而延长细胞生存期。抑癌基因PTEN具有促进细胞凋亡的作用，Vasudevan[63]等研究发现NF-κB（p65）通过阻断CBP/p300和PTEN的启动子结合，抑制PTEN基因表达，产生抗凋亡作用。NF-κB是促进细胞凋亡还是抑制凋亡目前尚不清楚，可能与微环境状况、不同细胞因子相[8]互作用、刺激物如H.pylori的毒性及宿主的免疫功能有关。胃粘膜上皮恶性转化过程中细胞增殖和凋亡活跃，使得细胞群不稳定性增加，随着病情进展，细胞增殖增加而凋亡逐渐减少。有学者推测在胃粘膜癌变过程中，可能有“细胞选择性增殖”现象，导致一些增殖能力低下的细胞经过凋亡被“淘汰”，而增殖能力强的细胞则通过不断异常增殖而逐渐形成肿瘤。H.pylori感染后通过活化NF-κB导致一系列炎性因子产生，早期表现为粘膜充血、水肿、糜烂，后期慢性炎性反应中，粘膜上皮逐渐萎缩，并出现肠上皮化生或不典型增生等癌前病变。由于炎性细胞呼吸爆发释放氧自由基可对DNA造成损伤，引起上皮细胞突变，细胞频繁增殖亦增加了DNA复制错配的机会，加之“细胞选择性增殖”现象，结果异常增殖能力强的细胞不断增殖，最终导致胃癌形成。4.6安胃汤理法方药的研究中医的“痞满”“胃脘痛”“嘈杂”在临床上与CAG的症状表现类似。安胃汤是已故全国名老中医林沛湘教授的经验方，林教授认为：胃气以降为顺，胃腑以通为用。胃病从胃本身来说其主要病机仍是胃失和降、胃腑失通。其二是胃为润土，脾为燥土。胃气以降为用，而44 脾气以升为顺，两者关系相辅相成，相互为用，相互影响。CAG的病机在于禀赋不足、后天失调、或饥饱失常、劳倦过度、以及久病正虚不复等多种原因造成“脾不能升，胃不能降”。其病因病机复杂，涉及脏腑颇多。诸多医家较一致认为脾胃虚弱为本，气虚、阴虚、血瘀、气滞和热毒并见，兼见痰浊和湿邪，是一种虚实相兼，寒热错杂之病症，病变主要涉及脾胃肝。安胃汤在林沛湘教授治疗慢性胃病验方基础上组方而成，由半夏泻心汤、芍药甘草汤、丹参饮及百合汤等方化裁组合而成。具有消痞和胃、理气化湿之功，在临床应用多年，疗效显著。黄连，苦寒，入心、胃、肝、小肠、大肠经。功用泻火解毒、清热燥湿，主要用于湿热中阻、胃热脘痞呕吐、泻痢腹痛，亦可用于湿温高热、肝胃失和、呕吐泛酸等症。《本草本义》：“黄连大苦大寒，苦燥湿，寒胜热，能泄降一切有余之湿火，而心、脾、肝、肾之热，胆、胃、大小肠之火，无不治之。上以清风火之目病，中以平肝胃之呕吐，下以通腹痛之滞下，皆燥湿清热之效也。……连之苦寒，尤以苦胜，故燥湿之功独显，凡诸证之必需于连者，类皆湿热郁蒸，恃以为苦燥泄降之资，不仅以清热见长，凡非舌厚苔黄、腻浊满布者，亦不任此大苦大燥之品”。《本草纲目》：“去心窍恶血，解服药过剂烦闷及巴豆、轻粉毒”。《神农本草经》：“主热气目痛，眦伤泣出，明目，肠癖腹痛下痢，妇人阴中肿痛”。《珍珠囊》：“其用有六：泄心脏火，一也；去中焦湿热，二也；诸疮必用，三也；去风湿，四也；治赤眼暴发，五也；止中部见血，六也”。《别录》：“主五脏冷热，久下泄癖脓血，止消渴，大惊……调胃厚肠，益胆，疗口疮”。半夏辛温，小毒，归胃、脾、肺经。具有消痞散结、降逆止呕、燥湿化痰之功。功治脏腑湿痰，为治湿痰、寒痰之要药；又和胃降逆，为呕家要药，不分寒热皆可配伍用之；还可用于消胸痹、结胸、心下痞、梅核气及瘰疬瘿瘤之气血痰聚。《神农本草经》：“味辛，平，有45 毒。治伤寒寒热，心下坚，下气，喉咽肿痛，头眩，胸胀，咳逆肠鸣，止汗”。《汤液本草》：“半夏俗用为肺药，非也。止吐为足阳明，除痰为足太阴，小柴胡中虽为止呕，亦助柴胡能主恶寒，是又为足少阳也，又助黄芩能去热，是又为足阳明胃也。往来寒热，在表里之中，故用此有各半之意，本以治伤寒之寒热，所以名半夏”。《药性论》：“消痰涎，开胃健脾，止呕吐，去胸中痰满，下肺气，主咳结”。《本草经疏》认为“半夏为足阳明胃经之药，而非肺经之药”。《别录》：“消心腹胸膈，痰热满结，咳嗽上气，心下急痛坚痞，时气呕逆”。《局方》：“言其除积冷，暖元藏，温脾胃，进饮食，治心腹一切痃癖冷气及年高风秘、冷秘或泄泻”。《医学起源》也认为：“治寒痰及形寒饮冷伤肺而咳，大和胃气，除胃寒，进饮食”。干姜：辛热，归脾、胃、心、肺经。功用温肺化饮、温中散寒、回阳通脉，能散脾胃寒饮，又助运脾阳，为温中散寒之要药。主用于脾胃寒证，亡阳证，寒饮伏肺喘咳等症，虚实皆可。《本草求真》：“干姜大热无毒，守而不走，凡胃中虚冷，元阳欲脱，合以附子同投，则能回阳立效，……且同五味则能通肺气而治寒嗽。同白术能燥湿而补脾，同归芍则能入气而生血。故凡因寒内入，而见脏腑痼蔽，关节不通，经络阻塞，冷痹寒痢，反胃隔绝者，无不借此以为拯救除寒”。《神农本草经》：“主胸闷咳逆上气，温中，止血，出汗，逐风湿痹，肠癖下痢，生者尤良”。《珍珠囊》：“干姜其用有四：通心助阳，一也；去脏腑沉寒痼冷，二也；发诸经之寒气，三也；治感寒腹痛，四也”。乌药：辛温，归肺、脾、肾、膀胱经。功用温肾散寒、行气止痛，上可走脾肺，疏理胸腹之气，下可温肾散寒以温散膀胱冷气，胸腹之胀痛、疝气、痛经、尿频遗尿等凡属于气滞虚寒皆可用之。《药品化义》：“乌药气雄性温，故快气宣通，疏散凝滞。甚于香附，外解表而理肌，内宽中而顺气，以之散寒气，则客寒冷痛自除；驱邪气则天行疫瘴即却；开郁气，中恶腹痛，胸膈胀满，顿然可减；疏经气，中风46 四肢不遂，初产血气凝滞，渐次能通，皆藉其气雄之功也”。《本草纲目》：“治脚气、疝气，气厥头痛，肿胀喘急，止小便频数及白浊”。《本草纲目拾遗》：“主中恶心腹痛，……宿食不消，天行疫瘴，膀胱痛间冷气攻冲背膂，妇人血气，小儿腹中诸虫”。白芍：苦酸微寒，入肝、脾经，功用敛阴止汗、养血调经、平肝止痛。苦可泻热、酸能收敛，用于血虚淤血或阴虚有热的月经病，肝阴不足、肝郁气滞或肝阳上亢的头痛、眩晕、胁肋疼痛、脘腹四肢拘挛虚痛、阴虚盗汗或自汗等证。《本草纲目》：“止下痢腹痛后重”。《珍珠囊》：“白补赤散，泻肝补脾胃……其用有六：安脾经，一也；治腹痛，二也；收胃气，三也；止泻痢，四也；和血脉，五也；固腠理，六也”。《神农本草经》：“主邪气腹痛，……止痛，利小便，益气”。《本草备要》：“补血，泻肝，益脾，敛肝阴，治血虚之腹痛”。《本草求真》：“赤芍药与白芍药主治略同，但白则有敛阴益营之力，赤则只有散邪气行血之意；白则能于土中泻木，赤则能于血中活滞”。百合：甘微寒，归肺、心经。功用养阴润肺、养阴安神，性润治肺脏燥或阴虚久咳之痰血，尤以治热病后期之虚热心烦导致的失眠。《本草纲目拾遗》：“清痰火，补虚损”。《神农本草经》：“主邪气腹胀，心痛。利大小便，补中益气”。《日华子本草》：“安心，定胆，益智，养五脏。治癫邪啼泣、狂叫，惊悸”。丹参：苦微寒，入心、肝经。功用活血调经、清心安神、凉血消痈。苦寒降泄，又可入于血分，为活血化瘀要药，广泛用于各种瘀血证，为妇科调经止痛佳品，适用于经产诸证，又善治癥瘕积聚的心腹刺痛；还善凉血清心而除烦安神，治温病热入营血之内热心悸失眠及痈肿疮毒。《日华子本草》：“养神定志，通利关脉。治冷热劳，骨节疼痛，四肢不遂。排脓止痛，生肌长肉……止血崩带下，调妇人经脉不匀。血邪心烦，恶疮疥癣，瘿赘肿毒，丹毒。头痛，赤眼……”。《神农本草经》：“主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚，破癥除47 瘕，止烦满，益气”。《吴普本草》：“治心腹痛”。《别录》：“养血，去心腹痼疾结气”。《滇南本草》：“补心定志，安神宁心。治健忘怔忡，惊悸不寐”。《本草纲目》：“活血，通心络。治疝痛”。薏苡仁：甘淡微寒，入脾、胃、肺经。功用健脾利水、渗湿止泻，清热排脓除痹、舒筋缓急。甘淡渗利泻而不伤正，补脾而不滋腻，凡脾虚湿滞、水湿滞留均可用之，常用于脾虚泄泻、水肿小便不利等证。渗湿而缓筋脉挛急，善治痹痛拘挛、脚气浮肿。并可清热排脓，用于肺痈、肠痈。《本草纲目》：“薏苡仁，阳明药也，能健脾益胃。虚则补其母，故肺痿、肺痈用之。筋骨之病，以治阳明为本，故拘挛筋急、风痹者用之。土能胜水除湿，故泄泻、水肿用之”。《别录》：“除筋骨邪气不仁，利肠胃，消水肿，令人能食”。《食疗本草》：“去干湿脚气”。《本草新编》：“薏仁最善利水，不至耗损真阴之气，凡湿盛在下身者，最宜用之。视病之轻重，准用药之多寡，则阴阳不伤，而湿病易去。故凡遇水湿之症，用薏仁一、二两为君，而佐之健脾祛湿之味，未有不速于奏效者也，倘薄其气味之平和而轻用之，无益也”。《神农本草经》：“主筋急拘挛，不可屈伸，风湿痹，下气”。甘草：甘平，归心、肺、脾、胃经。功用清热解毒、缓急止痛、益气补中、祛痰止咳，调和诸药，应用广泛。量大可用于心气不足之心悸怔忡，补益心脾以复脉；脾胃虚弱中气不足者，能补脾而益气；润肺祛痰而治咳喘；解百毒而治疮疡肿毒、食物和药物中毒；能缓解拘挛而止虚痛，治腹痛挛急或四肢挛急。又善和百药，寒热通调，与热药同用能缓和其热，以防燥烈伤阴；与寒药同用能缓和其寒，以防伤及脾胃阳气；与寒热药同用，能调和药性以得其平；与峻烈药同用，又能缓和药物的作用等，故有“国老”之美称。《本草图经》：“甘草能解百毒，为众药之要，孙思邈论云：有人中乌头、巴豆毒，甘草入腹即定。方称大豆解百药毒，尝试不效，乃加甘草为甘豆汤，其验更速”。《汤液本草》：“甘者令人中满，中满者勿食甘，甘缓而雍气，非48 中满所宜也”。《神农本草经》：“主五脏六腑寒热邪气，坚筋骨，长肌肉，倍气力，金疮肿，解毒”。《用药法象》：“甘草，阳不足者，补之以甘，甘温能除大热……腹中急痛，腹皮急缩者，宜倍用之。其性能缓急，而又协和诸药，使之不争，故热药得之缓其热，寒药得之缓其寒，寒热相杂，用之得其平”。《本草纲目》：“解小儿胎毒惊痫，降火止痛”。木香：辛苦温，入脾、胃、大肠、胆经。功用行气调中止痛。辛苦温泻通滞，为行气止痛之要药，行气宽肠。凡脾胃或大肠气滞诸证，皆可应用，又能疏肝理气助脾运化，肝失疏泄而致湿热郁蒸、气机阻滞之胁痛、脘腹胀痛，或黄疸皆可用之。在滋补剂中稍稍加之，则补而不腻。《药性论》：“治女人血气刺心心痛不可忍，末，酒服之。治九种心痛，积年冷气，痃癖癥块胀痛，逐诸雍气上冲烦闷。治霍乱吐泻，心腹疚刺”。《本草纲目》：“木香乃三焦气分之药，能升降诸气”。《日华子本草》：“治心腹一切气，膀胱冷痛，呕逆反胃，霍乱，泄泻，痢疾，健脾消食，安胎”。安胃汤中半夏入胃为君，和胃降逆，燥湿开结，消痞除满；黄连泻火解毒，干姜温中逐寒，二药同用，寒热并施，辛开苦降；百合味甘而性凉能清泻胃腑之邪热，养护胃气；乌药顺气开郁，散寒止痛，配合百合，则养津护胃而无滋腻之虑，行气散寒而无温燥之虞；白芍、炙甘草酸甘化阴以生津液，柔肝缓急而止疼痛；丹参、木香行气滞而[64]化血瘀；薏苡仁，健脾清热。本方取半夏泻心汤调和脾胃治痞满，芍药、甘草汤缓急止痛，丹参饮、百合汤调和胃之气血津液，使胃气复于通降，药物组成，大多配对而用，其功用相反相成，相得益彰，是和与降的统一，燥与润的结合，体现了调理胃气为主，兼顾脾肝的治疗原则。[65]现代药理研究认为：干姜的有效成分姜烯酮、干姜醚具有明显的抗炎作用，干姜浸剂能抑制应激性溃疡与抑制胃液分泌和降低胃液49 酸度；黄连的有效成分小檗碱低浓度时兴奋胃肠平滑肌，高浓度时则呈现解痉作用，黄连素和黄连甲醇对胃黏膜具有保护作用；白芍的有效成份白芍总苷具有增强人体免疫功能和镇痛作用并具有解痉作用；半夏能调节胃肠道功能，半夏中的直链淀粉有抗炎、抗肿瘤作用，有显著的抑制胃液分泌和胃液酸性成分的变化；丹参具有增加胃窦部和体部黏膜的血流量，具有保护黏膜屏障完整性，增强其防御机能的作用；乌药对胃肠平滑肌具有双重作用，能增加消化液的分泌；百合具有抗癌作用，从百合鳞茎中提出的一种生物碱，是有丝分裂毒素的一种典型代表，能抑制癌细胞的增殖，临床上用以治疗癌症；甘草的有效成分甘草甲醇、甘草素、异甘草素对胃肠道平滑肌有明显解痉作用，能调节机体免疫功能，具有抗炎、抗肿瘤作用；甘草锌有一定的抗应激和抗炎的作用，甘草总甙尚具有抗氧化作用；白芍甘草单用及合用对离体兔肠管运动有明显的抑制作用；木香可升高血浆MLT水平，具有抗溃疡、抗炎作用，对肠痉挛有对抗作用；薏苡仁的有效成分苡仁提物和苡仁丙酮提物均有抗癌作用。4.7安胃汤促进胃黏膜逆转机制的探讨⑴本实验表明安胃汤对慢性萎缩性胃炎有很好的治疗效果，具有如下作用：①改善胃黏膜组织病理形态；②调控基因Bcl-2与NF-kB的表达水平，改善胃黏膜状态，促使胃黏膜修复；③安胃汤可能通过降低Bcl-2及NF-kB在胃黏膜及血液中的表达，调节促进细胞凋亡，增强黏膜屏障的防御和修复的功能，从而达到治疗慢性萎缩性胃炎的目的。⑵本实验为临床上应用安胃汤治疗CAG患者提供了科学的依据。5存在的问题和展望⑴动物模型缺乏统一标准，实验结果难以比较：由于慢性胃炎动物模型种类繁多，形成机制各异，科研选择模型各有不同，缺乏公认的统一标准，致使中药复方的实验研究结果无法横向比较，对综合法50 制备的动物模型，各作用因素之间的关系和各因素在制模过程中所起作用的大小也较模糊，故建立统一有效慢性胃炎的动物模型是当务之急。⑵动物模型的中医辨证分型无法分别，就安胃汤对何种类型的慢性萎缩性胃炎的治疗效果较好，还无法有更好的实验来证明。⑶慢性萎缩性胃炎的发生往往是多因素相互作用的结果，其作用机制比较复杂。从以往及本次实验结果分析，安胃汤可能通过降低Bcl-2及NF-kB在胃黏膜的表达，促进细胞凋亡，增强黏膜屏障的防御和修复的功能，从而达到治疗慢性萎缩性胃炎的目的。其作用也是多靶点、多途径、多效应的。因为经费等条件限制，未能从更广泛的角度去探讨其作用机理，比较在CAG发生发展过程中各因素间的相互关系。结合现代医学发展，我们希望进一步深入探讨化浊解毒方治疗慢性萎缩性胃炎的作用机理。51 结论1.安胃汤改善了实验性慢性萎缩性胃炎大鼠组织病理学形态。具有保护胃黏膜、修复胃黏膜的作用。2.安胃汤在降低降低Bcl-2及NF-kB基因含量表达水平方面，安胃汤大剂量组作用明显强于中、小剂量组，中剂量组作用强于小剂量组，体现出一定的量效关系。3.安胃汤在降低Bcl-2及NF-kB基因含量表达水平方面，安胃汤大、中剂量组作用明显强于维霉素对照组及胃复春对照组。4.安胃汤降低慢性萎缩性胃炎大鼠Bcl-2及NF-kB基因含量表达水平，促进细胞凋亡，这可能是安胃汤减缓胃黏膜细胞向异型增生和胃癌方向转变进程的重要机制。52 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综述中药抗胃癌机制的基因分子水平实验研究现状123余翥，林寿宁，张学宁（1.广西中医药大学2009研究生2班，广西南宁530001；2.广西中医药大学附属瑞康医院消化内科，广西南宁530001；3.广西中医药大学2011研究生2班，广西南宁530001）[关键词]中医药；胃癌；基因分子；实验研究现代分子生物学的不断发展和检测技术的提高为中医科研实验创造了十分有利的条件。现就近几年中医科研从基因分子水平上对中药治疗胃癌作用机质的研究作一综述。1中药提取制剂类的研究[1]Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡过程中重要的调控因子，分布于核膜和胞浆内质网，可稳定细胞内质膜系统、抑制线粒体内离子及细胞色素C的释放，从而抑制细胞凋亡的发生，过度表达是肿瘤发生及[2]产生耐药性的重要原因之一。高泽立等报道猴菇多糖口服治疗后，20例CAG伴IM组12例肠上皮化生消失，20例CAG伴DYS组8例异型增生消失；Bcl-2表达量(荧光指数FI)减少，治疗前后FI阳性率有显著差异(P<0.05)，猴菇多糖可降低胃黏膜癌前病变Bcl-2蛋白[3]表达。姚保泰等报道盐酸小檗碱对大鼠胃癌前病变模型干预后，可增加胃癌前病变细胞的凋亡率，降低Bcl-2蛋白表达水平，下调Bcl-2mRNA的表达水平。[4]P53是一类重要的抑癌基因,参与细胞周期调控,促进细胞凋亡,维持基因组的稳定性，很可能起到控制Bax、Bcl-2之间比率的作用，[5]是迄今发现的突变频率最高的抑瘤基因。PCNA是一种细胞核蛋白质，是细胞DNA合成所必需的，对细胞由G1期向S期过渡起着重[6]要的调节作用，与胃癌的细胞增殖、浸润及转移密切相关。Bax则65 具有对抗Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡的作用，可促进线粒体内细胞色素C的释放，其高表达可促进细胞凋亡。Bcl-2与Bax二者的比值决定[7]细胞接受刺激信号是凋亡还是存活。向廷秀等报道，槲皮素对胃癌细胞增殖有抑制作用，可改变胃癌细胞的周期分布和诱导细胞凋亡，其可能的分子机制之一是可下调P53和PCNA的表达，降低Bcl-2／[8]Bax比值。余惠昊等报道，反左金丸水提物（黄连:吴茱萸=1:6）对人胃癌细胞SGC-7901有诱导细胞凋亡作用，机制可能是抑制凋亡基[9]因Bcl-2表达下调和促进凋亡的基因Bax表达上调。陆兴热等报道三七总苷能通过各种细胞信号通路导致胃癌细胞BGC-823中Bcl-2蛋白表达受抑制，而Bax蛋白表达受到激活，Bcl-2/Bax比值大幅度[10]降低从而促进胃癌细胞凋亡。张伟等报道小归芍超临界提取物（当归，白芍，白术，瓜蒌）能明显抑制人胃癌BGc-823细胞中Bcl-2及PCNA基因的表达，从离体实验的基础上证实其对胃癌的形成有明显的抑制作用。[11]caspase-3在细胞凋亡的信号传导中处于核心位臵，许多凋亡的信号最终会汇集到此蛋白，caspase-3在多种组织细胞中有表达。Fas[12]抗原是I型跨膜蛋白，也是细胞表面重要的死亡受体，属肿瘤坏死[13]因子超家族成员,是最重要的死亡分子之一。张珂等发现槲皮素具有下调Bcl-2的表达和上调caspase-3表达的作用，其机制可能使caspase-3无活性的32kDapro-caspase-3经自裂解或其它蛋白酶的切割作用使N端去掉3kDa的前肽裂解成有活性的caspase-3诱导细胞[14]凋亡。郑国华等研究报道，大蒜油和自藜芦醇联合用药作用后可促进胃癌细胞Fas抗原表达增高是其诱导细胞凋亡的机制之一；同时该药组能明显降低胃癌细胞中Bcl-2基因mRNA的表达及促进Bax基因mRNA的表达增加,是其诱导细胞凋亡的另一途径。2中成药及复方类的研究[15]H-ras原癌基因属于G蛋白类，突变阻断了GAP激活rasGTP66 [16]酶的作用,而使ras处于持续激活状态，从而导致肿瘤的发生。EGFR是原癌基因C-erbB-1的表达产物，它与相应的配体结合后发挥其调[17]节细胞生长的作用。EGF是一种重要的生物活性肽，近年发现该因子广泛存在消化道内，是参与胃黏膜损伤修复过程中最重要的肽类物[18]质，且与表皮生长因子受体上调密切相关。沈舒文等报道金果胃康颗粒可抑制大鼠胃粘膜H-ras，EGFR基因蛋白的表达,从而抑制胃黏膜H-ras、EGFR蛋白表达的异常改变，逆转或阻止胃癌的发生。袁[19]红霞等报道善胃方治疗慢性萎缩性胃炎伴胃黏膜异型增生且符合中医气阴两虚型的患者后，多数患者病理情况的萎缩、肠化、不典型增生均有改善，治疗前后EGF、EGFR表达显著降低，在一定程度上[20]使胃黏膜病理逆转。石雪迎等报道三七有可能通过降低EGFR、C-erbB-2、H-ras、Bcl-2癌基因的异常表达,发挥治疗胃癌前病变的作用。[21]P21^ras是原癌基因，参与细胞生长与分化的调节，起着生物[22]开头的作用，在肿瘤中表达增高。VEGF是促进血管增生和形成的[23]最重要的因子之一，是一种晚期肿瘤生物学行为。张运贵等报道胃复春片对胃黏膜中、重度异型增生有促进病变胃黏膜的逆转，可降低P21^ras、P53蛋白在中、重度异型增生组织中过度表达的水平。胡运[24]莲等报道加味左金丸各剂量组能不同程度地降低EGFR、VEGF、Bcl-2蛋白的表达，以中剂量为优，可能是通过对抗C-erbB-l、VEGF、Bcl-2基因的激活、抑制EGFR、VEGF、Bcl-2蛋白的表达，以恢复平衡而发挥治疗胃癌前病变的作用，这种多基因调控作用可能与中药[25]多成分、中医整体调节优势有关。席时燕等报道半夏泻心方中的辛苦组、辛开组及苦降组含药血清对BGC-823细胞增殖有明显的抑制作用，其作用机理与下调Bcl-2的表达有关；但辛甘组、苦甘组抑制较弱，全方和甘补组无明显影响，提示这些配伍形式可能存在拮抗作用；提示辛开苦降法可能是中医药防治胃癌的主要治则治法之一。郭67 [26]喜军等报道胃痞颗粒一号对胃黏膜癌前病变有逆转治疗作用，通过抑制Bcl-2、P53(突变型)蛋白表达，促进Fas蛋白表达和细胞凋亡指[27]数增加，从而有利于胃黏膜异型增生的上皮细胞发生凋亡。胡玲等报道胃炎消治疗后胃粘膜AI明显高于治疗前，Bcl-2蛋白表达明显下[28]降，通过抑制Bcl-2蛋白表达诱导胃癌癌前病变细胞凋亡。孟捷等报道消痞颗粒剂以百合乌药汤化裁而成,治疗后胃黏膜病变病理形态明显改善,胃黏膜Bcl-2阳性表达明显减弱，Bax表达有一定增强，可能是其通过降低Bcl-2／Bax比值、调节细胞增殖凋亡而起作用。赵[29]占考等报道胃萎I号冲剂治疗CAG后，细胞凋亡率和Bax表达率分别从21.81%、41.18%升高至40.52%、61.76%；而Bcl-2表达率从85.71%下降至22.86%(P<0.05)，其机理可能是通过降低患者Bcl-2/Bax比值加速诱导胃黏膜细胞凋亡从而能有效治疗慢性萎缩性[30]胃炎。蔡朔等报道中药胃复康对人SGC-7901胃癌细胞株药物血清处理后，P53表达明显增强，Bcl-2表达明显减弱，随着作用时间的延长表达变化更明显，说明可能是通过影响癌基因Bcl-2和抑癌基因[31]P53的表达而实现导人SGC-7901胃癌细胞凋亡的。田劭丹等报道新加良附方在治疗移植性人胃癌动物模型实验中发现，高剂量组能上调肿瘤组织Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达；中剂量组能下调[32]Bcl-2蛋白表达，从而诱导胃癌细胞发生凋亡。杜斌等用益气活血清热方治疗观察CAG患者，发现对CAG癌前病变的临床症状、胃镜征象、病理变化有显著改善作用，治疗组总有效率为93．3％，胃黏膜萎缩与肠上皮化生的变化具有显著性差异，P53、Bcl-2蛋白表达变化明显，其机理可能与抑制癌基因的激活和抑癌基因的失活，促进[33]胃癌前细胞凋亡有关。曲婷婷等报道活血行气方（三棱、莪术、桃仁、红花、赤芍、甘草等）对于改善胃癌中晚期肿胀、腹满、疼痛等症状有一定的作用，药物血清处理人胃癌SGC-7901细胞株后P53表达明显增强而Bcl-2表达明显减弱，可能是其诱导人胃癌细胞凋亡的68 机制。3总结和展望目前，Bcl-2基因家族和Bax基因已成为中医实验研究选取的热点观察基因，说明该对基因家族的重要性；而其它肿瘤相关基因也被越来越多地采纳为观察指标，这对中医科研开拓新思路、揭示新的作用机理有重大意义。当中药复方实验出现观察结果与临床效果的对比存在显著差异性，进一步研究后可能发现其中的主要配伍以避免拮抗冲突（比如席[25]时燕等研究报道半夏泻心方实验）——这样的思路一方面可以为进一步筛选处方中的主要配伍组合而提供理论依据，节约中药资源；另一方面也为对比选择更优质的抗肿瘤复方做出贡献。虽然中医科研从基因分子水平研究中药治疗胃癌作用机制的起步相对较晚，但是临床疗效观察及各种实验均表明中医药物有很好的应用前景，这是不可否认的事实！随着对蛋白靶点研究的不断深入以及活性测试手段和筛选技术水平的不断提高，相信会有更多更优质的中药类抗胃癌制剂涌现出来，其中的作用机制也会被更多的发现和鉴定！[参考文献][1]KangMH,ReynoldsCP.Bcl-2Inhibitors:TargetingMitochondrialApoptoticPa-thwaysinCancerTherapy[J].ClinCancerRes,2009,15(4):1126-1132.[2]高泽立,安淑华,吴敏生,等.猴菇多糖对胃癌癌前病变的逆转治疗研究[J].中成药,2000,22(8):555-558.[3]姚保泰,吴敏,王博.盐酸小檗碱抑制实验性大鼠胃癌前病变细胞Bcl-2表达作用的研究[J].中华中医药杂志,2005,20(3):186-187.[4]PintodeSousaJ,SilvaF,DavidL,etal.ClinicopathologicalsignificanceandsurvivalinfluenceofP53proteinexpressionin69 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致谢本课题是在导师林寿宁教授的悉心指导下完成的，在论文完成之际，特向我的导师致以崇高的敬意和诚挚的感谢！感谢导师三年来对我的精心培养与深切关怀。导师学识渊博，治学严谨，医技精湛，医德高尚，学术上精益求精，我感怀至深，终生难忘！导师崇高的品德风范和严格的做人准则使我感受至深，获益良多，激励我未来在中医药事业上勇往直前。感谢广西中医药大学附属瑞康医院消化内科朱永苹、雷力民等各位老师对我学业上的鼓励和教诲！感谢广西中医药大学实验动物中心主任黄正团老师对本实验的大力协助和支持！感谢韦唯师兄、杨伟兴师兄，王想丽、朱岳耕、余紫静、曾纪媛等同门及师弟师妹们对我实验和生活的各个方面给予的帮助和关心！感谢三年来为我成长付出艰辛与汗水的研究生处各位老师!感谢在百忙中参加我毕业论文评阅、答辩的各位专家、老师、同学!衷心地感谢养育和支持我的父母和家人，是他们帮助我圆满完成学业！感谢所有关心和帮助过我的老师和同学！感谢所有关心和帮助过我的人！73 攻读学位期间发表的学术论文目录[1]林寿宁,朱永苹,廖冬燕,黄建明,刘容,余翥.广西少数民族地区农村卫生适宜技术现状与需求调查方法初探.第二十二届全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨消化疾病诊治进展学习班论文汇编[C].2010:716-718.[2]林寿宁;朱永苹;廖冬燕;黄建明;刘容;杨伟兴;余翥.广西少数民族地区农村脾胃疾病诊疗适宜技术现状与需求调查方法初探.中华中医药学会第二十二届全国脾胃病学术交流会暨2010年脾胃病诊疗新进展学习班论文汇编[C].2010:827-830.[3]余翥,林寿宁,张学宁.中药抗胃癌机制的基因分子水平实验研究现状[J].医学综述,已录用。74 广西中医药大学研究生学位论文作者声明本人声明：本人呈交的学位论文是本人在导师指导下取得的研究成果。对前人及其他人员对本文的启发和贡献已在论文中作出了明确的声明，并表示了谢意。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人和其它机构已经发表或者撰写过的研究成果。导师和本人同意学校保留本人学位论文并向国家有关部门或资料库送交论文的复印件或者电子版，允许论文被查阅和借阅；并授权广西中医药大学可以将本人学位论文的全部或者部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其它复制手段和汇编学位论文（保密论文在解密后应遵守此规定）。（四号楷体）学生签名：导师签名：日期：年月日75 个人简历姓名：余翥性别：男出生年月：1984年9民族：汉族籍贯：海南政治面貌：中共党员求学经历:2000年9月-2004年6月三亚市第一中学2004年9月-2009年6月湖南中医药大学（医学学士）2009年9月至今广西中医药大学中医内科学（硕士）科研及工作情况:2010年-2012年:广西中医药大学附属瑞康医院临床轮转实习承担或主研科研课题:参与广西自然科学基金项目：安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠细胞凋亡及NF-κB、Bcl-2因子的影响76