胶体金免疫层析技术检测犬细小病毒抗体方法的建立

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1、华中农业大学2007届硕士研究生毕业论文2犬细小病毒流行病学研究夏咸柱(1993)认为，CPV-2主要感染犬，偶尔可感染其他犬科和鼬科动物，各种年龄品种的犬均易感，幼龄犬和纯种犬易感性和病死率高。本病一年四季均可发生，但以寒冷季节多发，各种应激均可诱使本病发生。有报道从狐狸、猎豹、西伯利亚虎、狼以及貉中检测或分离到了CIW-2，可见CPV-2的宿主范围有不断扩大的趋势，能在种间传播流行，不断进化。最初，犬细小病毒病的暴发是以高发病率和高死亡率为特征的。现在这样的暴发已经很少出现了，绝大部分成年犬是获得疫苗免疫或自

2、然感染获得免疫的，疫病主要发生在6周到6月龄的幼犬，它们出生后一月龄内依靠母源抗体保护，母源抗体的半衰期是9．7d，当抗体效价降低后，幼犬变得对病毒易感。病犬是主要的传染源，犬在感染的第3d首次通过粪便向外界排毒，早期散播的病毒散在，传染性强。后期由于肠粘膜]gA的产生和随出血进入肠道的IgM等CPV-2抗体的增多，病毒被凝集成团，血凝效价降低甚至消失，感染性也降低。犬自然感染主要通过消化道感染病毒，人工感染可通过皮下、肌肉和静脉接种病毒引起发病。最小感染剂量尚不清楚，但似乎小至100个TCID50，而感染动物排

3、泄的病毒量相当高，可达100亿TClD50／g，以及病毒在环境中的高耐受性，都说明了CPV-2在世界范围内流行的原因了。3犬细小病毒抗原检测研究3．1病毒分离CPV-2能在原代猫胎肾细胞，原代犬胎小肠、肾、脾和胸腺细胞，浣熊唾液腺细胞，牛胎脾细胞，水貂肺细胞系(CC=L-64)以及犬猫的肾传代细胞系(MI)CK、CRVK)中增殖和传代。现常用F81、MDCK等传代细胞系分离培养病毒，CPV-2增殖可引起FSl细胞拉网、脱落、崩解和破碎等明显的细胞病变，但在MDCK细胞中增殖，常无明显细胞病变，需用接种后3巧d的单

4、层细胞作免疫荧光抗体染色，或取细胞培养液与猪红细胞作凝集试验来鉴别。Eugster等(1980)指出，只有在电镜下病毒呈单个散在的粪便病料才适合进行病毒分离。粪便病料要用PBS10倍稀释，然后加入1／10量的氯仿4℃处理15min，低速离心，上清同步接种细胞，因为CPV-2虽然无需辅助病毒即可在细胞核中自行复制，但需要宿主细胞有丝分裂过程中的某些功能的辅助。实验研究证明，CPV-2的2胶体金免疫层析技术检&《犬细小病毒抗体方法的建立基因组是在感染细胞的染色体开始复制以后才在细胞核内合成的，说明本属病毒的复制能力有

5、缺陷，必须在细胞培养的同时或最迟24h内接种病毒，这样才能使病毒良好增殖。细小病毒具有潜伏存在于组织细胞中的特点，当进行病毒初代分离时，除了按常规方法用易感细胞进行分离培养外，还可用病料组织进行自体细胞培养，这种方法不仅能提高病毒的分离率，又能避免外来病毒的污染。病毒分离方法虽然在理论上可以检出一个感染性的病毒粒子，确诊ClW'-2的感染。但是也存在很多限制，分离病毒的操作繁琐，代价高，需要较多的实验设备，某些病毒增殖缓慢，常需要数周才能出现结果，这些都不利于细小病毒爆发时的早期诊断和控制。3．2电镜检查取疑似犬

6、细小病毒感染犬的粪便，加等量PBS，混匀，3000rpm离心15rain，取上清加等量氯仿，振荡10rain，再重复上述离心处理，取上清，以2％磷钨酸(pH6．2)进行负染后镜检。如进行免疫电镜检查，可见大块凝集的病毒粒子。电镜检查敏感性不高，需要大量病毒粒子存在才能检出，限制了该方法的应用。3．3血凝试验在pH6．O刁．2，温度扣25℃的条件下，CPV-2能牢固地凝集猪、猴、马和猫的红细胞，经福尔马林灭活后，其血凝活性几乎不变。由于猪红细胞容易获得，且血凝模式稳定，所以通常选用猪红细胞来测定细小病毒的血凝性，朱

7、君(2005)等摸索犬细小病毒的最佳血凝特性发现，0．5％醛化猪红细胞在0．01M，pH6．8含有0．I％BSA的PBS缓冲液中，敏感性明显提高，且试验结果重复性好，反应时间为1h。用PBS稀释待检粪便或细胞培养物，5009离心15rain，取上清，在96孔V型微量血凝板上作倍比稀释，加l％新鲜或醛化的猪红细胞，混匀，4"C静置，阴性对照孔沉降为点时判读结果，出现50％红细胞凝集的病毒最高稀释倍数即为病毒的血凝效价。出现粪便带血时，进入肠道的IgM等抗体可凝集CPV-2抗原，使其失去血凝活性，加入2-巯基乙醇处理

8、，可恢复部分病毒的血凝活性。血凝试验灵敏，操作简单，经济，但需要常备敏感性高的新鲜或醛化的猪红细胞，试验时间需要lh以上，如果血凝效价低，则需用血凝抑制试验补充，所需时间更长。华中农业大学2007届硕士研究生毕业论文3．4酶联免疫吸附试验目前，国内外已经研制出多种可供临床使用的试剂盒。Mildbrand(1984)等研制针对CPV-2上两个抗原决定簇的单克隆抗体，这两种抗