舌癌耐药的相关新基因(tcrp1)多克隆抗体的制备及其相互作用蛋白的筛选和鉴定

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1、分类号VDC博士学位论文密级舌癌耐药相关新基因(TCRPl)多克隆抗体的制备及其相互作用蛋白的筛选和鉴定Tonguecancerresistance—associatedprotein1(TCRPl)polyclonal：-antibodydevelopmentandidentificationofitsinteractingproteins研究生姓名：彭波学科专业：病理学与病理生理学研究方向：肿瘤耐药及其机制研究学院(系、所)：中南大学肿瘤研究所论文答辩日期．丝丝，』：么答辩委员会主翻＼中南大学二O一二年五月原创性声明本人声明，所呈

2、交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：薹薹．么煎日期：丝年￡r_月兰三日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩

3、印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。博士学位论文中文摘要摘要背景和目的：在前期的研究中，我们通过基因芯片技术从舌癌耐平阳霉素细胞株(Tca／PYM)中筛选到一个全新的耐药相关新基因TCRPI，初步的功能研究发现，转TCRPl基因的舌癌细胞对顺铂的耐受性显著提高，提示TCRPI可能与顺铂耐药有着密切的关系，但TCRPI在组织细胞中的表达及分布特性、介导顺铂耐药的作用机制等均不明晰。因此，本研究拟通过生物信息学分析对TCRPl蛋白的理化性质

4、及其功能等进行预测，制备抗TCRPl多克隆抗体，寻找能与TCRPl相互作用的蛋白并检测其功能，最终达到从分子水平阐明该基因在舌癌耐药中的作用机制，为实现舌癌化疗敏感性预测及耐药逆转提供实验基础和理论依据。方法：1．通过生物信息学的方法对TCRPl全长序列进行预测分析，以获得蛋白质的理化性质、抗原表位、亚细胞定位特性；2．构建pGEX-BP／TCRPl原核表达载体，表达、纯化获得具有生物学活性的TCRPl蛋白；免疫Balb／c小鼠获得抗TCRPl多克隆抗体；用该抗体通过wB、IFA、IHC检测TCRPl在各种肿瘤细胞株和舌癌组织中的表达

5、及其亚细胞定位情况：3．构建TCRPI稳定干扰细胞株，采用人毒理学和药物抗性基因芯片(OHS一401)获得耐药基因TCRPI相关差异表达基因谱；实时定量PCR与wB法对基因芯片结果进行验证；对差异基因进行G0聚类分析；4．免疫共沉淀法寻找能与TCRPl直接结合的靶蛋白，再通过设计合成相应siRNA干扰片段将其与TCRPl进行沉默，MTS法、软琼脂集本研究受如下基金资助：妻里曼耋÷餐差拿：(30873088’I教育部博士点基金：(200805330009)博士学位论文中文摘要落形成和平板集落形成实验检测沉默后顺铂对舌癌耐药细胞的影响，流

6、式细胞术检测沉默对耐药细胞凋亡的影响，WB法检测凋亡相关信号通路。结果：1．生物信息学分析提示舌癌耐药相关基因(TCRPl)，为一略偏碱性蛋白质，定位于11号染色体q13．4，包含有8个外显子，其等电点P工为9．327，理论分子量约为25kDa，具有较强的抗原性，为胞内表达蛋白，不存在跨膜区域同时也不会被细胞分泌出细胞外。2．成功构建pGEX-6P／TCRPl原核表达载体，通过正交设计得到TCRPl表达的最佳诱导条件并获得有活性的重组TCRPl蛋白，该蛋白具有DNA保护作用，能拮抗由顺铂所导致的舌癌细胞DNA损伤，使其出现顺铂耐受现象

7、；WB检测发现TCRPl的表达并非肿瘤细胞特异性，而是顺铂耐药特异性，即在耐顺铂的细胞中表达明显高于其他细胞；IFA和IHC均显示TCRPl主要表达于细胞胞浆。3．成功建立TCRPl稳定干扰细胞株，功能组基因芯片共发现了30个与耐药细胞表达具有显著差异的基因，其中上调基因9个，下调21个；采用G0功能分类分析发现，在上调的基因中最多的是伴侣／热休克蛋白类基因。而下调基因基因中，最多的为转录因子和调控分子类。4．免疫沉淀结果提示MTlX和Akt能与TCRPl相结合，MTlX与TCRPl的表达水平呈正相关，TCRPl能调控MTIX的表达。

8、MTS、软琼脂集落形成实验和平板克隆实验发现沉默TCRPl和／或MTlX的表达能够逆转舌癌耐药细胞对顺铂的耐受，流式细胞术分析发现与对照组相比随着TCRPl和MTlX被抑制后肿瘤细胞凋亡率逐渐升高，由对照组的8．04％分