nep对aβ1-42诱导视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用及机制研究

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1、章纳：NEP对ABl-42诱导视网膜色素上皮细胞损伤的保护作刚及机制研究NEP对A131-42诱导视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用及机制研究研究生：章纳导师：章金刚研究员焦新安教授中文摘要老年相关性黄斑变性(age—relatedmaculardegeration，AMD)是中老年人群中视力丧失和视力障碍的主要原因，在我国50岁以上人群中的发病率约为6．8％～7．7％。AMD可分为干性和湿性两种类型：干性AMD是在眼睛中央光感受器(视网膜下方的色素上皮细胞层中的视杆和视锥细胞)部分缺失、萎缩而导致的视

2、力丧失：湿性AMD是Bruch膜受损后脉络膜毛细血管经由Bruch膜损害处向视网膜色素上皮及视网膜神经上皮处生长，由于新生血管的结构不完善，必将引起渗出、出血、瘢痕等一系列病理改变，最终导致视网膜不可治疗性的损伤和视力不可逆性丧失。两种类型AMD在临床上的共同特征是玻璃膜疣(drusen)和RPE的色素改变，玻璃膜疣是一种沉积在RPE细胞和Bruch膜内胶原带之间区域出现无定型物质，它既是AMD的重要特征，又是AMD的诱发因素。B．淀粉样蛋白(amyloid．beta，Ap)是玻璃膜疣的一种组成成分。

3、细胞外Ap沉积是AD主要病理学特征之一，并可能是促发AD发病的关键因素。AD患者视力减退与AMD患者视力减退的病理过程十分相似，所以我们推测AB的沉积在AMD的发生与发展的过程中也起着非常重要的作用。AB是参与神经损伤及致细胞凋亡的非常重要的因子．它是淀粉样fi{『体蛋Et(amyloidprecursorprotein，APP)的一种降解产物。APP可被Q、B、’，三种分泌酶降解，p和7的降解产物为Apl-40、Apl_42、Apl-43。这三种形式p一淀粉样蛋白均具有细胞毒性，可导致细胞凋亡。所以

4、减少Ap沉积或清除己形成的淀粉样蛋白斑块是有效预防和治疗Afj沉淀相关性疾病的重要途径。Neprilysin(NEP)，也称中性内肽酶，是体内天然有降解Ap活性的主要肽酶。国内外有关Ap与AMD的研究较少，本研究假设AB在AMD发生和发展过程中发挥了如同在中枢神经系统中相似的作用，分析了ABl-42对视网膜色素上皮细胞正常生长状态的影响，成功扬州大学硕士学位论文构建了融合表达HA标签；fIINEP的UFll真核表达载体，验证TNEP对A13的降解活性，并探究了NEP对Ap，4z诱导的视网膜色素上皮细胞

5、损伤保护作用及作用机制。

6、JIIIIIIIillI1110111III1．Ap¨：对视网膜色素上皮细胞的损伤Y2632989采J羽MTT法检测不同浓度ADl．42刺激视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelialcells，砌)E)后不同时间点的细胞存活率，观察其对视网膜色素上皮细胞的损伤情况。结果表明，Apl42对RPE细胞的正常生长有着～定的损伤作用，说明A01-42在视网膜上的积累会对视网膜细胞的活性造成影响，从而影响视网膜的正常功能，暗示AB的沉积可能是AMD的诱因之一。

7、根据后期实验需要确定了1州Apl42处理6h为最佳A毋1-42诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的造模条件。2．NEP对A13l-42诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用及机制研究我们成功构建出融合表达HA标签和NEP的UFll真核表达载体，并通过HA．Tag亲和层析法纯化了目的蛋白。SDS．PAGE和Westernblot的结果表明目的蛋白能够成功表达。将纯化的目的蛋白与纤维化的A13142模拟生物体内的条件在体外孵育一定时间后，Westernblot检测剩余ABI-42，同时设置添加NEP的抑制剂Th

8、iorphan的对照组来确认NEP的作用，结果显示NEP确实对ABI-42有降解作用。为了进‘步验证NEP基因对A13142诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用，我们在第一部分实验基础上，使用Apl_42在1“M，作用6h为Apl42损伤细胞模型的制造条件。利用含有NEP基因的UFll载体转染ADl-42损伤细胞模型，Westernblot检测细胞水平的Apl．42蛋白量和NEP蛋白量的关系，并通过MTT法分析NEP基因对损伤细胞生长状况的影响，并用RT-PCR检测促凋亡基因Bax的mRNA表达量的

9、变化。结果显示在细胞水平上NEP同样具有降解ABl42的活性；实验组(转染NEP基因的UFll载体)细胞凋亡率显著降低，促凋亡基因Bax的表达量减低，说明通过外源基因的转入过表达NEP能减少A131_42的毒性，对ABl-42诱导的RPE细胞损伤具有保护作用。本研究初步探究了AMD的发病机制，成功建立了ABl-42诱导的视网膜色素上皮细胞损伤模型，并验证了NEP对A$142的降解活性，为在接近生理条件下从分子水平研究AMD的基因治疗研究奠定了基础。关键词