浆细胞肿瘤教学ppt课件

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1、免疫胶体金技术ImmunogoldTechnique一.概述(一)发展历史1971年Faulk和Taylon用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合,制备成金标抗体,检测细菌表面抗原的分布1975年Horisberger等把胶体金技术推广应用于扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究1978年Geoghegan发表了胶体金标记物在光镜水平的应用1981年Danscher建立了银显影液增强，光镜下金颗粒可见性的方法1983年Moeremans等在蛋白质转移电泳中应用了免疫金银染色法1986年Fritz等在免疫金银法基础上成功进行了彩色免疫金银染色免疫胶体金技术以胶体金为标记物应用在

2、免疫组织化学研究中，对细胞表面或细胞内的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位研究（二）胶体金的基本概念胶体金，一般指金的水溶液，又称金溶胶。---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。其中分散的金颗粒直径在1~100nm之间。二.胶体金的制备(一)可用多种方法制备胶体金分散法:包括机械分散法、超声波法、电分散法和胶溶法等凝聚法:包括物理凝聚法、化学凝聚法（氧化法、水解法和还原法）其中应用最多的是化学还原法化学还原法【基本原理】在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。在适当条件下，还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒，形成金溶胶。【常用

3、还原剂】柠檬酸钠、鞣酸、白磷等柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，15~150nm白磷还原制备的金颗粒直径较小，3~12nm【具体制备方法】（二）影响溶胶稳定性的因素电解质胶体金浓度温度大分子物质（三）胶体金的鉴定【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小及金颗粒的均匀程度【鉴定方法】将胶体金滴在覆有Formvar膜或碳-Formvar膜的镍网上，空气干燥，透射电镜下观察，拍照，测量金颗粒的直径，并计算100个以上胶体金颗粒直径的平均值及标准差（四）制备胶体金的注意事项1.玻璃器皿的清洁2.试剂配制3.影响胶体金颗粒大小的因素玻璃器皿清洗→清洁液浸泡24h→流水冲→蒸馏水反复洗涤→

4、晾干应尽量使用分析纯试剂各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制加入还原剂的速度搅拌是否均匀制备胶体金所用的烧瓶大小三.胶体金探针的制备(一)胶体金与蛋白质结合的原理胶体金标记蛋白质的过程,实际上是蛋白质在等电点或稍偏碱时,被吸附于胶体金颗粒表面.（二）胶体金的预处理标记之前将胶体金的PH值调至待标蛋白质的等电点或略偏碱调节PH的方法：当需要提高胶体金的PH值时，用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LKOH当需要降低胶体金的PH值时,用0.1MHCL或醋酸(三)待标记蛋白质的处理1.透析除盐:将蛋白质溶液装入透析袋中,放在蒸馏水中透析,4℃过夜2.离心:10000r/m

5、in,4℃,1h,去除蛋白质聚合物等沉淀(四)胶体金蛋白质最佳结合率测定不同直径的金颗粒,及不同分子量大小的蛋白质,其结合的比例是不同的常用的检测二者结合量的方法有目测法和光电比色法1.目测法先将待标记蛋白质逐级稀释取一批小试管，编号，每管内加已调好PH的胶体金100ul按从低→高的浓度，将已稀释好的蛋白溶液，分别加入已编号的试管中，对照管只加不含蛋白的稀释液，混匀，静置5~10min各管分别加10%NaCl10μl，混匀，静置2hr，观察结果1234576胶体金(ml)1111111蛋白质(ug)510152025303510%NaCl0.10.10.10.10.10.1

6、0.1结果判断:对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变2.光电比色法利用分光光度计测各管580nm的OD值,然后以OD值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标作一曲线,取曲线最先与横轴相接近的那一点的蛋白质浓度,即为最适稳定量.(五）标记1.计算所需待标记蛋白质的总量根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量2.调节PH：根据所标记蛋白质的等电点来调节胶体金的PH常用几种蛋白质标记时胶体金的PH蛋白质PH抗体9.0SPA6.0过氧化物酶8.0低密度脂蛋白5.53.磁力搅拌下，

7、逐滴加入蛋白质溶液，作用5～15min4.继续磁力搅拌，加入5％牛血清白蛋白，使其终浓度为1％，搅拌10min；也可加3％聚乙二醇，使其终浓度为0.05％（六）标记探针的纯化纯化的目的去除溶液中未标记的蛋白质，未充分稳定的胶体金，以及在标记过程中可能产生的各种聚合物纯化的方法超速离心法和凝胶过滤法1.超速离心法速度快，适合大样品的制备离心1500rmin，20min弃沉淀超速离心4℃1h弃上清沉淀用PBS或TBS缓冲液（含0.1％牛血清白蛋白重新悬浮至原体积的110～120离心1500rmin，20min弃沉淀分装