mir-134真核质粒表达载体和慢病毒载体的构建及其初步验证

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万方数据UDC：密级：重庆医科大学硕士学位论文论文题目作者姓名miR．134真核质粒表达载体和慢病毒载体的构建及其初步验证王明菊指导教师姓名(职称、单位名称)谢鹏教授重庆医科大学附属第一医院申请学位级别硕士学科、专业名称神经病学论文答辩年月2014年5月 万方数据重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。学位论文作者签名：王潮两日期：上D喙午．I’学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定。即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，并编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用本授权书。论文作者签名：指导教师签名：日期：工。乍 万方数据目录英汉缩略语名词对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6论文正文：miR．134真核质粒表达载体和慢病毒载体的构建及其初步鉴定⋯⋯。9前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第一部分miR-134真核表达载体pEGFP-miR-134的构建及其在OL细胞的表达研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．112结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。203讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯224结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．23第二部分Lenti．miRl34-EX慢病毒载体的构建、验证及其在SD大鼠海马神经元的表达情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。241材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯404结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．46蚕j[谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54攻读硕士学位期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 万方数据一一——．．重壅垦型查兰堡主堡塞生兰垒堡壅英文缩写BSAcDNADN妇巳MdNlPFBSEGFPPBSddH20LBRNArpm1’risMAP．2SDrattusOLSPSSLSDCREBHIv-1EMTWWOX英汉缩略语名词对照英文全称BovinesertlmalbuminComplementarydeoxynucleicacidDuibecco'smodifiedEagle’SmediumDeoxyribonucleosidetriphosphateFetalBovineSerumEnhancedGreenFluorescentProteinPhosphatebufferedsalineDoubledistilledH20Luria．BertaniRibonucleicacidRevolutionsperminuteTrishydroxymethylaminomethaneMicrotubule-associatedprotein·2SpragueDawleyrattusoligodendrogliaStatisticalProductandServiceSolutionsLeastsignificantdifferencecAMP—responseelementbindingprotemhumanimmunodeficiencyvirus1epithelial--to--mesenchymaltransitionWWdomaincontaining中文全称牛血清白蛋白互补脱氧核糖核酸Dulbecco改良的Eagle培养基脱氧核糖核苷三磷酸胎牛血清增强型绿色荧光蛋白磷酸缓冲液双蒸水LB培养基核糖核酸每分钟转速三羟甲基氨基甲烷微管相关蛋白一2SD大鼠人类少突胶质瘤统计产品与服务解决方案最小显著差值法cAMP应答元件结合蛋白人类免疫缺陷病毒一1上皮问质转化包含氧化还原酶的WW结 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文TGF一13MOISEBDMTLECNSAmpPLLESCsoxidoreductasetransforminggrowthfactor-lBmultiplicityofinfectionstatusepilepticusBipolardisorderMesialTemporalLobeEpilepsyCentralnervoussystemAmpicillinPoly·-L·-lysineembryonicstemcell2构域转化生长因子一B感染复数癫痫持续状态双向情感障碍内侧颞叶癫痫中枢神经系统氨苄青霉素多聚-L-赖氨酸胚胎干细胞 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文miR-134真核质粒表达载体和慢病毒载体的构建及其初步验证摘要背景与目的：抑郁症是一类常见病，临床上主要表现为患者对日常活动和娱乐的兴趣减退、对前途悲观失望、容易焦虑、睡眠质量较差等，迄今，人们对抑郁症的发病原因以及发病机制还不是很清楚，但是可以肯定的是，其发病有生物、心理以及社会环境等内外因素的参与。近年来，有研究提示miRNAs与精神疾病有关联，其可能在精神疾病的发生、发展中起着十分重要的角色。有研究发现miR-134的表达水平在BD躁狂相病人的血液中降低，然而miR-134的表达水平在癫痫持续状态(statusepilepticus，SE)造模成功的大鼠模型中上升，并且在内侧颞叶癫痫(MesialTemporalLobeEpilepsy，MTLE)病人中也同样检测到miR一134表达水平的升高。目前的研究主要是证实了miR-134异常表达与精神疾病有关，但是对精神疾病中miR-134的精细调控机制的研究还十分有限。如果想要更加深入地了解miR-134发挥的作用，我们需要建立细胞或动物模型，在细胞及动物水平检测其引起的病理生理改变。本课题的目的在于构建miR-134真核质粒表达载体和慢病毒载体，并且将构建好的质粒和慢病毒转染至OL(oligodendroglia，人类少突胶质瘤)细胞、sD大鼠海马神经元中，为研究抑郁症的分子机制提供有效气 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文的实验工具。方法：1．用PCR的方法从OL细胞基因组中扩增含有miR-134基因的目的片段，并将miR-134基因的PCR产物和载体pEGFP—N1连接以构建pEGFP-miR-134载体，经酶切、测序证实之后采用Invitrogen公司的LipofectamineLTX和PlusReagents转染试剂盒将质粒瞬时转染至OL细胞中，提取总RNA，在基因水平检测miR-134在OL细胞中的表达变化。2．取出生24h内的清洁级SD乳鼠，断头后分离提取海马神经元，采用无血清培养基培养神经元，为后期在海马神经元中进行的细胞活力实验、细胞凋亡实验及突触可塑性实验奠定良好基础。3．构建Lenti．miRl34．EX慢病毒表达载体，并包装、纯化慢病毒，经鉴定慢病毒包装成功后将其感染SD大鼠海马神经元，提取总RNA，在基因水平检测miR-134在海马神经元中的表达变化。结果：1．从OL细胞基因组中成功扩增出含有miR-134基因的目的片段，并将其连接到载体pEGFP-N1，命名为pEGFP-miR-134，且转染OL细胞效果较好。2．用简单的方法即可分离培养出高纯度(可达90％以上)的海马神经元。3．成功包装了能够表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体，命名为Lenti．miRl34。EX。4 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文结论：本课题成功构建了miR．134真核质粒表达载体和慢病毒载体，并获得瞬时转染的OL细胞以及SD大鼠原代海马神经元，为深入研究miR-134在抑郁症的精细调控机制提供了有效的工具和平台。关键词：miR-134；OL细胞；海马神经元；抑郁症 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文CONSTRUCTIoNOFmiR．134EUKARYOTICEXPRESSl0NPLASMIDVECTORANDLENTIVIRUSVECTORANDVERIFICATIONOFTHEIRPRELIM[INARYVALIDATIoNABSTRACTBackgroundand0bjective：Depressionisaclassofcommondiseasesandthepatientsarepessimisticaboutthefuture，havenointerestindailyactivitiesandentertainment，tendtosufferfromanxietyandsleeppoorly．Sofar,theetiologyandpathogenesisofdepressionwererarelyclear．Butwhatissureisthatbiological，psychologicalandsocialenvironmentfactorsinvolvedinthepathogenesisofdepression．Inrecentyears，certainstudiessuggestedthatmentalillnesswasassociatedwithmiRNAs，whichmayplayaveryimportantroleintheoccurrenceanddevelopmentofmentalillness．StudieshavefoundthattheexpressionlevelofmiR一134wassignificantlyreducedinpatientswithbipolardisordermanicplasma，however,itsexpressionwasobviouslyelevatedintheratmodelofstatusepilepticusandhumantemporallobeepilepsypatients．ThecurrentstudyconfirmedthattheabnormalexpressionofmiR-134wasrelatedtomentalillness，butthestudyofmentalillnessinthefineregulationofmiR一134wasstillveryscarce．TofurtherexplorethefunctionofmiR一134，weneed6 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文tobuildthecelloranimalmodelsanddetectitschangesinthephysiologicalandpathologicalaspectsinvitroandinvivo．ThistopicaimstobuildmiR-134eukaryoticexpressionvectorplasmidandlentivirusvectors，andtransfectthemintoOLcellsandSDrathippocampalneuronstoprovideaneffectivetoolforthesubsequentsmayofmolecularmechanismsofdepressionMethods：1．ThefragmentcontainingthegeneofmiR-134ffomOLcellgenomewasamplificatedbyPCR，andthenthePCRproductandthevectorpEGFP—N1wereligatedtoconstructavectorpEGFP-miR-134．TherecombinantplasmidwastransientlytransfectedintoOLcellsusingInvitrogen’LipofectamineLTXandPlusReagentsplasmidtransfectionkitafterdigestionandgenesequencing．ThetotalRNAwasextractedandtheexpressionofmiR-134inOLcellswasdetectedinthegeneticlevel2．ThehippocampalneuronsofcleangradeSDratsbornwithin24hwereculturedusingtheserumfreemediumtolayafoundationfortheexperimentofcellvitality,cellapoptosisandsynapticplasticityinhippocampalneurons．3．TheLenti—miRl34-EXlentiviralvectorwasconstructedandthelentiviruswaspackagedandpurified．Then，thehippocampalneuronsofSDratswereinfectedwithidentifiedlentivirus．ThetotalRNAwasextractedandtheexpressionofmiR-134inthelfippocampalneuronswas 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文detectedinthegeneticlevelResults：1．ThefragmentcontainingthemiR·134genewassuccessfullyamplifiedfromOLcellgenomeandsuccessfullyconnectedintothevectorpEGFP-N1．TherecombinantplasmidwasnamedpEGFP—miR-134．Thetransfectioneffectwasbetter2．ThehighpuritySDratprimaryhippocampalneuronswereisolatedandculturedusingthesimplemethod．Thepurityofhippocampalneuronswasmorethan90％usingMAP-2immunocytochemistrymethodafterseparatingatleast7days3．Thelentiviralvectorexpressinggreenfluorescentprotein，namedLenti-miRl34一EX，wassuccessfullypackagedConclusion：Thisresearchsuccessfullyestablishedtheeukaryoticexpressionvectorplasmidandlentivirusvectors，gotthetransientlytransfectedhumangliomacellsandprimaryhippocampalneuronsofSDrats，andprovidedeffectivetoolsandplatformsforfurtherresearchofmiR-134indepressionKeywords：miR-134；OLcells；hippocampalneurons；depression8 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文miR-134真核质粒表达载体和慢病毒载体的构建及其初步鉴定前言抑郁症是一类常见病，临床上主要表现为患者对日常活动和娱乐的兴趣减退、对前途悲观失望、容易焦虑、睡眠质量较差等，属于高患病率、低病死率及高致残率的疾病，是目前全球致残的主要原因之一“3。抑郁症是一重要的公共卫生问题，其终生患病率约为5％至19％，其中50％至85％的病人可多次发病眙。抑郁症是自杀行为中主要的症状口3，尽管进行了大量的实验研究，与抑郁症发生有关的分子和细胞机制尚不清楚。在过去的几年里，人们已经很清楚大脑的基因表达受到多个层面的调控。除了传统的基因转录调控机制，大脑的基因表达还受到多种能够产生miRNAs、反义RNA的非编码RNA以及与转录后水平、转录水平、表观遗传学有关的其它小RNA的调控H1。其中，miRNAs是生命科学研究领域中的热点，近年来，神经发育及脑部疾病的研究发现，miRNAs是一类在神经发生方面有重要作用的调节基因表达的小RNA，它在维持神经元有丝分裂后期的生存和最佳状态及调节突触功能，特别是在调控树突的蛋白质合成方面有重要作用Ⅲ，参与了脆性x综合征凸1、精神分裂症哺1及神经变性疾病n1等精神神经系统疾病的发病机制。新的证据表明，miRNAs在应激状态下、行为抑郁的动物大脑组织、抑郁患者死后的大脑组织中均表达异制“。此外，miRNAs还调控胚胎的神经发生嘲。有研究人员发现神经突触可塑性的改变可以引起抑郁症的发生口3，并且miRNAs与突触可塑性的调控有关，这些研究结果均提示miRNAs可能参与了包括重型抑郁在内的精神疾病的发生，然而，相关研究仍处于起步阶段。miR-134作为庞大的miRNAs家族成员之一，其在大脑组织中的表达丰度比较高，定位于人类染色体14q32．31，参与了多种病理和生理过程“⋯。Rong等【61研究人员发现miR-134的表达水平在BD躁狂相病人的血液中降低，David等Ⅲ1研究人员发现miR-134的表达水平在sE大鼠模型和MTLE病人中上升，这都提示miR-134的异常表达可能参与了精神疾病的发生，而miR-134在精神疾病中的精细调控机9 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文制还不是很清楚。为了能够进一步研究其中的机理，本实验室成功构建了能够高效表达外源性miR．134分子的真核质粒表达载体和慢病毒载体，为我们在细胞水平甚至动物水平研究miR-134的作用机制提供依据。10 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分miR一134真核表达载体pEGFP．miR-134的构建及其在OL细胞的表达研究1．材料与方法1．1材料1．1．1质粒、菌株和细胞pEGFP-N1质粒载体为哈尔滨医科大学张凤民教授惠赠，包含CMV启动子、EGFP报告基因、卡那霉素抗性基因；从天根生化公司购得DH5ct菌株；人OL细胞由德国HannsLudwig教授惠赠。1。1。2主要试剂限制性内切酶PstI、BamHI(TaKaRa公司)；T4连接酶(TaKaRa公司)；DNAMarker(TaKaRa公司)；Trizol(美国Invi仃ogen生命技术公司)：TIANprepMiniPlasmidKit(北京天根生化公司)；A型小量DNA片段快速胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒分别购买于北京博大泰克及上海华舜；DMEM／Highglucose(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；LipofectamineLTX和PlusReagents转染试剂盒(美国英俊公司)；Opi-MEM优化培养基(美国Gibco公司)；A11．in—oneqPCRMix(广州复能基因有限公司)。1．1．3主要仪器设备NIKON倒置荧光显微镜SW-CJ．1D超净工作台C02气体培养箱NanoDrop1000分光光度仪PTC-200DNAEnginecyclerPCR仪恒温培养振荡器HeraeusFrescoTM21离心机IMAGICAL图像采集软件日本Nikon公司苏州净化公司美国Thermoscientific公司美国Thermosciemific公司美国伯乐公司上海智城公司美国Thermoscientific公司日本Nikon公司 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文解剖显微镜重庆奥特公司细胞培养板美国Hyclone公司过滤器美国Millipore公司恒温水浴箱江苏荣华公司注射器江西益康医疗器械公司1．2方法1．2．1mLR．134真核表达质粒的构建及鉴定1．2．1．1引物的设计与合成依据SangermiRBase数据库(http：／／www．mirbaseorg)收录的miRNA数据，找到hsa．miR-134的成熟序列(uGuGAcuGGl兀7GACcAGAGl3(Ⅺ)，其前体序列pre-hsa—miR-134(AG(×HyGUGUGACI7GG【HyGACCAGAGGGGCAUGCACUGUGUUCACCCUGUGGGCCACCUAGUCACCAACCCuC)，然后在BLASTdatabase中找到pre-hsa．miR-134的定位，并且向它的两端侧翼序列延伸得到一小段基因序列。最后我们根据pre—miR-134的序列设计上下游引物，上游引物为5’．AA￡!煎△鱼AGClGTGIGl陌CTGT．3’，下游引物为5’．Ca送适巡CGTGTCATCGCA。3’，其中标出的下划线为酶切位点，可以分别被PstI和BamHI切割。1．2．1．2基因组DNA提取按照说明书进行如下操作：取出培养皿，弃去旧液，l用PBS清洗OL细胞2~3次l向清洗后的细胞中加入SolutionA液体6501al，常温放置lminI将液体吸至收集管内I12 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文1L振荡数次，然后静置大约lmin上加入SolutionB溶液400pl，用无菌枪头轻轻地混合均匀上加入SolutionClml，离心参数设置为12000rpm2min上弃去废液，重复上一步骤，再弃废液I将下层溶液吸至FilterCup中，上12000rpm离心2min土丢掉FilterCup，加入DBBuffer溶液4001al，混匀上向吸附柱中加入以上液体，12000rpm离心1min，丢掉滤液土向吸附柱中加入500plRinseA，12000rpm离心30s，丢掉滤液』向吸附柱中加入700plRinseB，12000rpm离心30s，丢掉滤液上再次重复(11)的操作步骤J再次离心12000rpm1minJ加DEPC水洗脱提取的DNA』定量，剩余样品干一80℃冰箱保存13 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文1．2．1．3用PCR的方法从OL细胞基因组中扩增含有mill-134基因的目的片段PCR反应体系(25111)如下所示：名称体积／质量5×PrimeS’IARbufferdN口Mixture上游引物下游引物模板DNAPolymerase(2．5U／91)ddH2059l2uj1LLl1山2山0．259l至259lPCR反应条件：95℃2rain；95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5rain。1．2．1．4目的基因的回收与纯化PCR反应结束之后，吸取59l产物进行跑胶检测，在观察条带是不是同实验前预期的结果一致，如果条带大小正确，则再进行一次电泳，上样量为40肚l，电泳结束后切取目的条带，采用胶回收试剂盒回收目的片段。(1)在365nm的紫外光照射下切取目标DNA条带，并将切取的条带放入1．5mlEP管中；(2)在装有凝胶的EP管中加入溶胶液(5009I／0．19)，置于65。C水浴锅内直至凝胶完全溶解；(3)加入适量的异丙醇，其中胶块与异丙醇的比例为100mg／1509l，混合均匀，等待胶完全溶解：(4)将液体转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，丢弃上清液：(5)重复(4)操作步骤；(6)向吸附柱中加入漂洗液5009l，12000rpm离心30s，上清液则丢弃；(7)重复(6)操作步骤，倒掉废液，再次离心2min，以完全去除加入的漂洗液；(8)加入适量的无菌去酶双蒸水，以便洗脱提取的DNA14 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文1．2．1．5LB培养基的制备(200m1)，配方如下：1．2．1．6采用CaCl2法制备DHSa感受态细胞(1)从37。C培养箱中取出LB平板，小心地挑取大肠杆菌单个茵落，接种于5ml不加氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃条件下振荡培养过夜，转速设置为200rpm／min；(2)第二天，吸取o．5ml菌液加入到含50mlLB液体培养基的三角烧瓶中，恒温振荡器中培养2h左右，转速仍然设置为200rpm／min；(3)将培养液分装到10ml离心管中，每管分装10ml液体，在冰板上放置10min；(4)在4"C条件下，4000rpm／min离心10min，倒掉离心后的上清液，尽可能的完全倒尽管中剩余的培养基；(5)每个离心管中加入2mlCaCl2溶液，其初始浓度为0，1mol／L，重悬管底的沉淀，将重悬后的液体转移到一个新的离心管中；(6)冰上放置10min，在4'C条件下，4000rpm／min离心10min：(7)加入含有15％甘油的CaCl2溶液，CaCl2溶液的初始浓度为0．1mol／L，悬浮沉淀，最后进行小体积分装，一80"C冰箱保存备用。1．2．1．7表达载体的连接、测序及序列分析将回收hsa—miR一134基因的PCR产物和载体pEGFP．N1分别用PstI和BamHI进行切割，37℃2．5h。之后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒说明书回收酶切后的目的片段以及载体大片段。在22℃条件下连接目的片段和载体，3h后将其转化DH5a感受态细胞，因载体中带有卡那霉素抗性基因，根据这一特性初步筛选 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文阳性克隆。挑选阳性单克隆后，将其接种至LB液体培养基中，温度设置为37。C，转速设置为220r／min，震荡培养过夜。第2d提取质粒，送上海英俊公司进行测序鉴定。1．2．1．8质粒转化(1)从．80℃冰箱中取出DH50t感受态细胞放于冰中，等待其完全溶化；(2)将提取的质粒加入到感受态细胞中，所加比例为lml感受态细胞中加入109l质粒，充分地混合均匀，在冰上放置30min；(3)42℃条件下热激90s，然后在冰上放置5min；(4)每个EP管中加入3009lLB液体培养基(未添加任何的抗生素)，37*(2条件下振荡培养lh，于此同时将新配好的选择性培养基置于室温1h，使其逐渐冷却；(5)在选择培养基上均匀的涂布适量的菌液，一般为150I_tl，室温下干燥20min：(6)将培养皿上下颠倒放置于37"C培养箱中，培养过夜。1．2．1．9重组质粒的鉴定(1)质粒小量提取①柱平衡步骤：在进行质粒提取实验前向收集管内放入吸附柱CP4，然后向柱中加入5009l平衡液BL以平衡柱子，在室温离心，离心参数设置为12000rpm×1min，吸附柱不要从收集管中拿出来，丢弃废液；②从摇茵振荡器中取出放入15ml离心管中过夜培养的菌液，其中每个离心管加有10ml菌液，室温条件下离心，离心参数同样设置为12000rpm×lmin，丢弃上清液，向P1溶液中添加RNaseA，取5009l混匀的液体加入到l5ml离心管中，将管底沉淀重悬；③然后依次加入5009lP2溶液、7009lP3溶液，混匀后离心，离心参数设置为12000rpm×10mira④根据实验情况取数个过滤柱cs放于收集管，将步骤③获得的液体吸至柱中进行离心，离心参数设置为12000rpm×2min，再将本步骤获得的液体加入到吸附柱C74中进行离心操作，离心参数为12000rpm×1min，此时所要提取的质粒存在于吸附柱中，丢掉没有质粒的液体；16 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文⑤依次向吸附柱内加入500Bl去蛋白液PD、1200BI已经添加无水乙醇的漂洗液PW(分两次加入，每次6001J)进行离心，离心条件为12000rpm×1min，丢掉无质粒的废液：⑥取数个洁狰的1．5mlEP管，将含有质粒的吸附柱CP4放于EP管中，取200pl洗脱缓冲液TB，朝向吸附柱膜的中间部位滴加脱洗液，室温下离心，静置2rain后离心，离心参数设置为12000rpm×1min，收集液体，．80。C冰箱中保存备用。1．2．2细胞培养与质粒转染按照LipofectamineLTX和PlusReagents细胞转染试剂盒说明书(Invitrogen公司)进行以下细胞转染：(1)实验前准备OL细胞，用含10％FCS的DMEM培养基进行培养，待细胞长满后将其铺于6孔板，其中每孔的细胞数量为2．5x105个，过夜培养，使转染时细胞生长密度能够达到60％．80％；(2)稀释DNA以及PlusReagent；将2．5lxg质粒加入到2509lOpti—MEM中，再加入2．581PlusReagent，混合均匀，作为第一个管；(3)稀释LTX加5山LTX于250I．tlOpti-MEM中，充分混合均匀，室温放置5rain，作为第二个管；(4)第二个管放置5min后，将两管混合，室温下再放置30min，作为第三个管：(5)为了不影响转染效率，在转染之前用优化培养基Opti．MEM冲洗细胞2~3遍，之后，加入第三管内的DNA／脂质体混合物，培养箱中培养4《h：(6)4巧h后，将原有的转染液全部换成无抗有血清的培养基，本实验转染时分为三组，分别为pEGFP—miR一134组、pEGFP．N1空质粒组以及空白对照组，并且每个组均设置3个生物学重复。(7)如果质粒质量较佳，转染48h后细胞中就会有绿色荧光蛋白的表达，此时可以在显微镜下观察并采集相关图像。1．2．3荧光定量PCR(qPCR)检测成熟的hsa-miR-134的表达量17 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文1．2．3．1总RNA提取(1)细胞转染48h后从培养箱中取出六孔板，吸掉旧培养基，用PBS冲洗2~3遍，加入lmlTrizol／孑L，将细胞吹散后将其转移至无RNA酶的1．5mlEP管中，标注编号及日期，冰上放置5min；(2)每1mlTrizol中加入氯仿200pi，用振荡器剧烈振荡15s，冰上静置5min，4。C条件下120009离心15mira(3)离心后液体开始分层，上层为水相，含有大量要提取的RNA，下层为有机相，含有氯仿及蛋白质等，中间薄膜层含有蛋白和DNA等，将含有RNA的上层液体转移至无RNA酶的1．5mlEP管中；加入与上清液同等体积的异丙醇溶液，轻轻混匀后于冰上静置10min，4。C条件下离心，120009×10min；(4)吸弃上清液，剩下RNA沉淀，加入lml75％乙醇／管以清洗沉淀，离心条件为4"C120009×5min，丢弃乙醇液体，将剩下的RNA沉淀在室温下风干5min；(5)RNA沉淀中加入去酶ddH20溶解RNA；(6)轻轻混匀后使用紫外分光光度计测定RNA的浓度，同时测量260nm／280nm下吸光度的比值，剩余的RNA样品小量分装后存放于一80℃冰箱备用。1．2．3．2microRNA加尾及eDNA合成(1)逆转录体系(25LLl)，如下：名称体积／质量总RNA2．5U／glPolyApolymeraseIH-ase嘶X5×RU)门妣Buff．erddH20299lglllal59l至259l 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文2xAll—in-OneqPCRMixAll-in—OneTMmiRNAqPCRPrimer(2p峋UniversalAdaptorPCRPrimer(2¨峋First—strandeDNA(diluted1：51ddH2010U12LLl2u129l4LLl(2)反应条件如下：CyclesStepsTemperatureTimeDerectionl预变性95℃10min否变性95℃10s否40退火60℃20s否延伸72℃10s是本实验中的引物序列如下：hsa．miR-134上游引物为57．ACACTCCAGCTGGGTGTGACTGGTTCCAGA(X}3’，下游引物为通用引物；U6上游引物为5’．GCTTCaWAGCACAlWrACTAAAAIT-37，下游引物为通用引物。本实验采用2．△△Ct法计算miR．134的表达变化。1．3统计学分析使用SPSS19．0软件进行统计分析，实验结果采用均数±标准差表示，对数据进行单因素方差分析，两两比较采用LSD法(Leastsignificantdifference，最小显著差值法)，当P≥O．05认为没有统计差异，当P<0．05认为差异有统计学意义。19 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文2．结果2．1Pre．miR-134对OL细胞基因组DNA片段的PCR结果按照实验流程进行PCR反应，将所得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为1％)，结果如图卜l所示，可见在290bp处有一条清晰、特异的条带，与理论预测值相符。M1500bp250bpM：DNAMarker(DL2000)1：pre-miR-134对应基因组片段PCR产物(290bp)图1-1pre-miR-134目的基因的PCR扩增产物电泳困Fig．1-1ElectrophoreticproffieforPCRproductofpre-miR-134gene2．2重组质粒pEGFP．miR．134的双冀切鉴定pEGFP．miR-134重组质粒经PstI和BamHI进行双酶切，之后跑电泳，得到两条DNA条带，分子量大小分别为4700bp、290bp，与理论值相一致，说明质粒构建这部分实验顺利完成(见图1-2)。M1500bp·250bp—M：DNAmarker(DL2000)；l：PstI和BamBI双酶切片段图1-2pEGFP．miR-134重组质粒双酶切鉴定Fig．1-2RestrictionmapofrecombinantplasmidpEGFP-miR-134 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文2．3重组质粒pEGFP—miR-134的测序鉴定复苏OL细胞，从其基因组DNA中扩增miR-134前体，所得目的片段克隆到载体pEGFP．N1上，miR-134载体构建成功后转化DH50t感受态细胞，用天根质粒小提试剂盒提取重组质粒进行测序，测序结果示重组质粒序列与所设计的基因序列完全相符，没有基因突变、缺失、插入等异常存在，由此说明miR．134前体序列成功的克隆到载体pEGFP-N1(图l一3)，可用于下一步实验。‘：‘■^^一wr1热．m1j：。h^：f掣：‰1≯：二二”?j．．11『¨‘”⋯图1-3miR-134测序图谱Fig．1-3SequencingmapofmiR-1342．4荧光倒量显微镜下观察EGFP的表达情况将三个组的质粒分别转染至正常OL细胞中，常规培养箱中培养48h，然后在倒置显微镜下观察转染效果，可见除空白对照组以外的两组均可在镜下看到较强的绿色荧光蛋白表达。见图1-4。鬻黼麟攀黼A：miR-134(白光)：B：miR-134(荧光)；c：miR-134(拼啥-)；D：miRNA(白光-)；E：miRNA(荧光)；F：miRNA(擀)图1-4倒王显微镜检测重组质粒转染OL细胞48h后的转染效果(100x)Fig．1-4Fluorescenceexpressionat48hafterthetransfectiondetectedbyinvertedfluorescencemicroscopy(100x)21 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文2．5qPCR检测转染OL细胞后miR．134的表达为了进一步检测miR-134的表达情况，收集转染已48h的细胞，提取RNA，进行qPCR检测，结果显示：pEGFP．N1空质粒转染组与空白对照组相比，两者的miR-134的表达水平差异无统计学意义(P=o．882)，而pEGFP．miR-134质粒转染组与pEGFP-N1空质粒转染组相比，pEGFP-miR-134质粒转染组miR-134的表达升高约52倍(P=O．023，见图1．5)，说明质粒转染效果很好。3．讨论l231．OL细胞：2．OL-control；3．OL-miRNA一134··：P《0．05(n=3)Iit1-5ImqPcR检测miR-134在3组细胞中的表达Fig-5ExpressionofmiR-134inthreekindsofcellsdetectedbyRT-qPCRmicroRNAs(miRNAs)广泛的存在于真核生物的基因组当中，是一类小RNA，它们能够识别特定的靶基因并与其互补结合，具有转录后调控功能，调节基因的表达““心。lee等对秀丽线虫进行了研究，首次发现了基因lin．4n“，它是～个miRNA，不编码蛋白质，但能调控靶基因lin．14“4及lin．28n朝的表达，此研究成果发表在1993年的《Cell》杂志中。Reinhart等于2000年发现了第二个miRNA基因，即let-7“⋯，其作用是控制发育过程中的基因表达。这些研究起初并没有得到科学家足够的重视，直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现，并取得突破性进展。最初的研究重要是miRNAs表达检测、功能机制的阐明，近年来研究目标转移到确认miRNAs靶基因。 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文miRNAs的表达具有时间特异性和空间特异性两大特点，可在某些组织或细胞中特异性表达，因此其表达谱可以作为特定疾病的分子标志物。⋯。有研究发现，大脑组织和神经细胞系(例如U87细胞)中有大量miRNAs的表达，且伴随着CNS(Centralnervoussystem，中枢神经系统)不断发育完善，miRNAs的表达则发生不同程度变化，有的表达上调，而有的表达则下调“⋯。越来越多的研究表明，miRNAs发挥的作用非常重要，不但调节了对神经系统发育、神经元分化、突触可塑性等，也涉及到CNS中许多病理改变，包括了脑肿州191、神经系统疾病口1以及精神疾病。0。等。然而miRNAs调控精神神经系统功能的研究尚处于初级阶段，其与精神神经系统疾病发生和发展的关系尚未研究得十分透彻。有研究n町提示miR-134异常表达可以通过抑制其靶基因Nanog的表达来调节人类少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤组织及U87细胞的功能，其可抑制上述细胞的增殖、侵袭以及迁移能力，促进细胞的凋亡过程，这一研究表明miR-134有可能会被用来诊断脑肿瘤。TAY等阳1最新研究结果显示miR-134在促进胚胎干细胞向外胚层细胞谱系分化中起到重要作用。另外，miR-134可以在转录后水平调控其靶基因CREB(cAMP．responseelementbindingprotein，cAMP应答元件结合蛋白)的表达影响记忆功能和神经可塑性n3。但要对miR-134功能进行深入探究，仍需依赖于在特定的细胞或组织中外源性抑制或过表达miR．134后，检测其在生理病理学方面引起的变化，因此，构建microRNA真核表达质粒是非常必要的。本研究合成了pre．miRNA．134核酸片段，并且将其与携带有CMV启动子的真核表达载体相连接，随后进行了测序检测，结果提示目的DNA片段成功插入到pEGFP．N1质粒中。利用脂质体转染法将pEGFP．miR-134质粒转染至人OL细胞，获得瞬时转染重组质粒的细胞系，经qPCR鉴定miR-134的表达水平与正常人OL细胞相比明显高表达，这为进一步研究小分子RNA作为神经精神系统性疾病靶向生物治疗提供实验依据。4．结论，本课题成功构建了pEGFP．miR．134真核质粒表达载体，采用Invitrogen公司的LipofectamineLTX和PlusReagents转染试剂盒成功地将质粒瞬时转染至oL细胞，为深入研究miR-134在抑郁症的精细调控机制提供了有效的工具和平台。 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文第二部分Lenti．miRl34．EX慢病毒载体的构建、验证及其在SD大鼠海马神经元的表达研究1．材料与方法1．1材料1．1．1细胞株及实验动物293T细胞购自美国ATCC细胞库；DH5a菌株购自北京天根公司：出生24h以内的SD(Sprague-Dawley)孚L鼠购自重庆医科大学动物中心。1．1．2主要试剂oligoDNAEagIPCR产物纯化试剂盒BPclonaseIILRclonaseII蛋白酶KpDONR221pLenti6．3N5-DEST氨苄青霉素(Amp)包装质粒pLPl，pLP2，pLP／VSVGD～匝M+10％FBSlipofectamine2000Opti-MEM培养液0．01mol／L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7．4)马血清谷氨酰胺青霉素／链霉素24美国LifeTechnologies公司美国NEB公司美国爱思迸生物技术有限公司美国Invitrogen公司美国LifeTechnologies公司美国LifeTechnologies公司美国LifeTechnologies公司美国Gibco公司美国Hyclone公司美国Gibco公司美国Hyclone公司 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文0125％胰酶DNA酶Triton)(．100牛血清白蛋白(BSA)鸡单克隆抗体MAP．2DyLight594标记山羊抗鸡IgG／Y二抗1．1．3主要仪器及设备同前美国Gibco美国Sigma美国abcam艾美捷公司1．1．4相关试剂的配制(1)种植液的配制10％马血清+10％胎牛血清+1％谷氨酰胺+O．1％双抗+78．9％DMEM高糖溶液，过滤除菌后，于冰箱4"C保存备用。(2)无血清培养基的配制98％Neurobasal+2％B27，其中百分比为体积份数比，配制完成后需要过滤除茵，用完剩余的培养基可存于4"C冰箱。(3)多聚-L-赖氨酸溶液的配制A液：硼砂(四硼酸钠)1．9079溶于100mL三蒸水(终浓度0．05mol／L)B液：硼酸1．2379溶于100mL三蒸水(终浓度0．2mol／L)硼酸缓冲液：4．5mLA液+55mLB液(pH=8．4)多聚-L-赖氨酸溶液：称取多聚赖氨酸溶于硼酸缓冲液中，其质量体积比为溶解于0．05mg／ml，过滤除菌，标注清楚名称及日期，-20。C保存备用。(4)4％多聚甲醛溶液的配制49多聚甲醛+100mLPBS溶液，振荡至完全溶解，调节pH值至7．4，每次使用之前都要现配。(5)0．25％TritonX．100的配制25plTritonX．100原液+10mLPBS溶液，4。C密封避光保存。1．2方法1．2．1miRNA-134载体的构建与验证，S 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文1．2．1．1OligoDNA的设计与合成针对靶基因hsa．miR-134．5pUGUGACUGGUUGACCAGAGGGG设计microRNA的表达序列并合成2对互补的OligoDNA，序列见表2．1。设计合成的oligo结构如下：龇s盟转t茁getEequ盈ce。匝5etargetEequ姐∞0,laatremt．融NASeqlL锄ce)(n曲瞅；de5△9-10)烈绝既￡5'-TGCTG—IIIIIIII。I—_GTTrrGGCCACTGAC——_———————‘·一一3龇sen靶t暂get鞠q：ll蛆髓(nucieot谌es△9．10)s匝；etxgetlequ鼬c已oligo-R：5'-CCTG--●-_-●--_●-__---一GTCAGTOGCCAAAAC__·_··_■■_——____一C．3+表2．1oligoDNA序列Table2．1TheoSgoDNAsequenceoligo名称oligoDNA序列5'-3’hsa-miR-134-5p表达序列TGCTGTGTGACTGGTTGACCAGAGGGoGTTTrGGCCACTGAmiR．134．FCTGACCCCCTCTGCAACCAGTCACACCTGTGTGACTGGTTGCAGAGGGG(订CAGTCAGTl3GCCAAmiR-l34一RACCCCCTCTGGTCAACCAGTCACACNegativecontrolTGCTGAAAT(订1ACT(记(把GTGGAGACGTTTT(托℃CACTGACTNegative-FGACGTCTCCACGCAGTACATTI．CCTGAAATGTACT(℃(汀GGAGACGTCA(H’CAGT(粥℃CANegafive-RCGTCTCCAC(记(记AGTACATTTC1．2．1．2退火用无菌ddH20将2对合成好的寡聚单链DNA稀释，最终浓度为100“M，每条单链各吸取5p．1，两两混合，按表2．2给出体系进行退火。反应条件设置为95。C加热5min，然后室温下放置20rain使液体逐渐冷却。26 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文表2．2oligoDNA退火体系Table2．2TheoligoDNAannealingsystem名称体积t00洲topstrandoligo100州bottomstrandoligo10xoligoannealingbufferddH20Totalvolume5“l5Lll2IJl8ul20p11．2．1．3连接退火完成后，将双链DNA继续稀释，浓度为10nM，在室温条件下，按表2．3给出的酶连接体系连接30min，将序列亚克隆到载体pcDNA6．2TU—GW／EmGFP．miR中。表2．3酶连接体系Table2．3Theenzymeconnectionsystem名称体积5xligationbufferpcDNA6．2一GW／EmGFP-miRdsoligo(10nM)T4DNAligase(1U／u1)ddFl20Totalvolume4ul2“14ul1lal9LLl20pl1．2．1．4转化将连接产物转化DH5a感受态细胞，连接产物与感受态细胞的体积比为10txl：100lal，将混合后的液体涂布在LB平板上，LB平板含有501tg／ml壮观霉素，37"C条件下孵育。1．2．1．5测序与验证第二天，取出平板，每个转化挑取3个克隆，然后摇菌，最后抽提质粒、送上海生工测序。’7 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文1．2．2慢病毒载体的构建1．2．2．1干扰质粒线性化按表2．4配制单酶切体系，每管的终体积为30pl，轻轻混匀，在37。C条件下孵育2h，用AxygenPCR纯化试剂盒纯化酶切产物，最终溶于15plelutionBuffer中。表2．4单酶切体系Table2．4Thesingleenzymesystem名称体积Sterilewater10xbuffer(NEBbuffer3lEagI干扰质粒(“2ug)1-otal10．5u3．0uI1．5uIlOuI25uI1．2．2．2BP重组按表2．5配制BP重组体系，取出2．0pl冰上溶解的BPclonaseII加入到上述的BP重组体系中混匀，室温孵育过夜，取出3pl，剩余的样品．20。C保存。表2．5BP重组体系Table2．5TheBPreorganizationsystem名称体积TEbuffer(elutionbufferfromInvitrogenminiprepkit)LinearizedattBexpressioncloneDoilervectorwithattPsite(pDONR221)5．0u12．0ul1．0ul1．2．2．3LR重组按表2．6配制LR重组反应体系，每管的终体积为lOpl，反应条件为25。c加热5h；加入1pl蛋白酶K，37。C反应10min；按照5pl／100“l的比例将重组反应液28 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文转化DH5也感受态细胞，细胞涂布于含有100pg／ml氨苄青霉素的LB平板，37。C过夜培养；第二天，取出LB平板，挑出单克隆，将其接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37。C摇菌过夜；最后提取质粒并测序。表2．6LR重组体系Table2．6TheLRreorganizationsystem名称体积BP重组质粒3．OulDestinationvectorfpLenti6．掣v5一DEST)1．0utLRclonaseIIenzymemix2．OulddH204．OuI1．2．3包装慢病毒和测定病毒滴度1．2．3．1慢病毒包装及病毒的收获(1)取数个lOom的培养皿，将生长良好293T细胞用胰酶消化后接种在培养皿中，接种数量为6×106个／mr，放于常规培养箱中，培养过夜；(2)第二天，用5mlOpti．MEM培养液替换旧培养液：(3)向1．Sml的Opti．MEM培养液中加入慢病毒包装混合液、慢病毒表达质粒，加入的量分别为9pg和399，轻轻混匀，作为第一管；(4)取36pllipofectamine2000加入至1．5ml的Opti-MEM培养液中，轻轻地混合均匀，静置5min，作为第二管：后将第一管和第二管溶液混合，室温条件下放置20min；：(5)将上述两管液体混合20min后将其加入到培养皿中，置常规培养箱中，孵育6h后把转染用培养液更换成完全培养基，培养基中含有10％FBS、l％双抗、1％谷氨酰胺，88％DMEM高糖溶液：(6)转染293T细胞48h，48h后收集培养皿中的上清液，室温下3000rpm离心10min后过滤；(7)将病毒原液超速离心，离心条件设为500009X2h，尽量去除上层清液，用Opti—MEM优化培养基将管底的沉淀重悬，该慢病毒命名为Lenti．miRl34．EX。1．2．3．2病毒滴度的测定29 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文取一个无菌的96孔板，根据实验需要选取其中数个孔用PLL包被2h，之后，用PBS溶液冲洗2-3遍，超净台中自然晾干。实验前一天，用o。25％胰酶消化生长良好的293T细胞，铺板于包被好的96孔板中，每孔接种细胞数约为8000个，补足培养液2009l／FL，放于恒温培养箱中，培养过夜。第二天，取出96孔板，尽量完全吸去旧培养液，慢病毒原液用慢病毒稀释用培养基(DMEM高糖溶液中加入2％FBS，再添加8pg／ml的Polybrene)10倍比稀释，各取100111感染293T细胞，每个稀释度两次重复，以下为比较详细的病毒液稀释步骤：编号液体1号孔5“l病毒原液245．xl病毒稀释液2号孔25／211号孔混匀后的病毒液225。11病毒稀释液3号孔259l2号孔混匀后的病毒液225．11病毒稀释液4号孔259l3号孔混匀后的病毒液225。11病毒稀释液5号孔25pl4号孔混匀后的病毒液225．．tl病毒稀释液6号孔251115号混匀后的病毒液225．11病毒稀释液轻轻摇晃数次96孔板，使不同稀释梯度的病毒液与细胞充分接触，将培养板放入常规细胞培养箱中培养96h。感染96h后观察细胞并拍照片。病毒滴度计算公式如下：表达荧光的细胞数的平均值／慢病毒液体积。1．2．4SD大鼠海马神经元的分离与培养1．2．4．1SD大鼠海马神经元的分离、培养取出生24h内的清洁级SD乳鼠，用75％酒精浸泡消毒，断头，延头部正中矢状线剪开头皮，用镊子剥开头部皮肤，分层剪开头皮和颅骨，并用镊子向两边分开颅骨暴露两侧的大脑半球，将整个大脑组织取出后放置于预冷的解剖液中，在解剖显微镜下取下分离海马，同时除去海马脑膜及血管，将剥离好的海马组织置于新解剖液中清洗一次后转入小青瓶中，用眼科剪刀剪成细小碎片，用适量不含EDTA的0．125％胰酶消化25min，为了能够提高胰酶的活性，将组织放于37"C培养箱中消化，每隔8分钟摇晃一次；消化时间足够后加适量种植液终止消化，尽量吸出胰酶，多次加入种植液用无菌巴士管吹打组织并收集细胞，待细胞碎片沉积到底部后再将上清液转移至培养瓶中，制成单细胞悬液。计数后接种在实验所30 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文果死细胞或细胞碎片比较多，可用PBS清洗一遍后加入无血清培养液，以后每隔3d半量换液1次。1。2。4．2海马神经元的细胞免疫荧光鉴定PLL包被12孔板』接种海马神经元J冷PBS溶液冲洗2"--3次J配制含4％多聚甲醛的PBs溶液，将其厂调为7’4’室温条件下固定细胞15“n帅8溶了洗细胞2次细胞在含o‘25％n“。I|i(。100的PBs中孵育1。觚nPBs溶液冲鼋细胞3x5min细胞在含1％BsA气PBsT中孵育3。min-一2掷脚‰趴帅醮唏稀r靴吼桃斛蝴脯111丢弃液体'PBs溶r冲洗细胞3×5min在1％88A中室、温条件下避光丁¨’丢弃二抗及88A溶液用PBs溶液避光了洗细胞3×5min 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文观察细胞并拍荧光照片1．2．5miR-134慢病毒感染海马神经元(1)准备细胞：用PLL包被12孔板，每孔接种大约3×105个神经元。(2)准各病毒：从．80。C冰箱中取出待转染的慢病毒，冰土融化，按照MoI值和接种细胞数量准确计算好所需慢病毒量，用培养基稀释，根据实验要求设置不同MOI值的感染组，MOI值分别为5，20，50。(3)感染细胞：病毒稀释好之后，从培养箱中取出海马神经元，首先观察其生长状态，如果细胞生长良好则可以进行后续实验。a取出12孔板，吸去旧培养基；b实验分为miR-134过表达组及其对照组，在两组细胞中分别加入已经稀释好的慢病毒；c轻轻混匀，使病毒在培养板中分散均匀；d细胞在培养箱中孵育12h。(4)更换培养液：感染12h后将旧培养液去掉同时除去没有感染细胞的病毒，完全更换成新鲜的含2％B27添加剂的Neurobasal培养基；(5)检测感染效率：慢病毒复制比较慢，需要感染3d左右才能进行检测，3d后观察绿色荧光蛋白的表达情况并拍照片，估计感染效率；同时提取细胞总RNA，采用RT-qPCR的方法检测海马神经元感染慢病毒后miRl34表达水平的变化。1．2．6RT-qPCR检测miR-134的表达水平1．2．6．1细胞总RNA提取步骤同前1．2。6．2茎环法RT-qPCR反应32 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文(1)引物序列GenesPrimersequences(5'-3’)MiR-134R，PCTCAACTG(汀GTC(汀oG_AGTCoGCAATTCAGTTGAGCCCCTCTGF—ACACTCCATCTGGGTGTGACTGGTTGACCAGAR．CTCAACTGGTGTCGTGGAU6ImAAAAI'ATG旧AACGCTTCACGAATTGF-CTCC芰TTCGGCAGCAC文I’ATACTR-ACGCTTCACGAAITTGC(汀(、TC(2)逆转录反应：根据配制RT反应液(2091)：名称体积／质量RT-Primer(1心∞dNTPMixture(2．5mMl5×PrimeScriptBufferRNaseinhibitor(400U／gi)MMLV(200U／01)tomIRNAl山4山4LLlO．29lllallggddH20至209l反应条件如下：16℃42℃85℃4℃30min40min5min5mln(3)RealTimePCR反应33 万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文SYBR⑧PremixExTaqII(2x)ForwardPrimer(109M)ReversePrimer(10laM)cDNAddn20101al1“l2ul6ul反应条件如下：预变性95℃变性95。C30s5s退火60℃30s1．3统计学分析40个循环使用SPSS19．0软件进行统计分析，实验结果采用均数±标准差表示，对数据进行单因素方差分析(one—wayANOVA)，两两比较采用LSD法(Leastsignificantdifference，最小显著差值法)，当P≥O．05认为没有统计差异，当P