香豆素类化合物抗鲤春病毒血症病毒活性及作用机制研究

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分类号：S942学校代码：10712UDC：639研究生学号：2015060129密级：公开2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文香豆素类化合物抗鲤春病毒血症病毒活性及作用机制研究学科专业：水生生物学研究方向：水生生物研究方法与技术研究生刘镭指导教师：王高学教授完成时间：2018年03月中国陕西杨凌 Classificationcode:S942Universitycode:10712UDC:639Postgraduatenumber:2015060129Confidentialitylevel:OPENDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018STUDYONANTIVIRALACTIVITYANDMECHANISMOFCOUMARINCOMPOUNDSAGAINSTSPRINGVIRAEMIAOFCARPVIRUSMajor:HydrobiologyResearchfield:ResearchMethodologyandTechnologyofHydrobiologyNameofPostgraduate:LeiLiuAdviser:Prof.WangGao-XueDateofsubmission:March2018YanglingShaanxiChina 资助项目本研究得到陕西省水利科技项目（2016slkj-18）的资助。 香豆素类化合物抗鲤春病毒血症病毒活性及作用机制研究摘要鲤科鱼类是我国传统的养殖品种，养殖产量大，是人们餐桌上的美味佳肴。然而随着养殖规模的扩大，各种类型的传染病不断地发生和流行，对水产业造成了巨大的经济损失。鲤春病毒血症病毒（Springviremiaofcarpvirus，SVCV）引起的鲤春病毒血症（Springviremiaofcarp，SVC）是对鲤科鱼类危害最大的传染病之一。由于病毒宿主范围广，病原极易扩散流行，因此SVC被世界动物卫生组织（OfficeInternationaldesEpizooties，OIE）规定为必须申报的动物疫病之一，而我国在新颁布的动物疫病名录中将其列为一类动物疫病。目前，尚无任何有效控制该病的药物、疫苗或其他方法，国际上通行的防控措施是对SVC进行严密监控，及早发现病鱼并进行隔离、扑杀，从而达到阻断该病暴发流行的趋势。本研究以全新合成的香豆素类化合物为研究对象，利用体外细胞分子水平筛选模型对化合物进行抗病毒活性评价，得到具有良好抗SVCV活性的香豆素。实验通过观察SVCV感染和药物处理后EPC（Epitheliomapapulosumcyprini）细胞的形态学和各项生化指标的变化，以及使用多种细胞凋亡检测技术，对活性香豆素的抗SVCV活性作了进一步深入的研究。与此同时，本研究探索了两种抗病毒香豆素对SVCV感染细胞过程的影响和对宿主抗病毒反应的作用，以期为开发水产抗SVCV专用药物及SVC的防控提供理论基础。本研究取得结果如下：1.香豆素类化合物离体抗SVCV活性研究以49种香豆素类化合物为研究对象，通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测SVCVG蛋白表达情况，体外筛选出的4种香豆素对SVCV增殖的抑制率超过90%，即7-[3-（苯并咪唑）丙氧基]香豆素（B4）、7-[4-（4-甲基咪唑）丁氧基]香豆素（C2）、7-[4-（苯并咪唑）丁氧基]香豆素（C4）和7-[6-（2-甲基咪唑）己氧基]香豆素（D5）。药物构效关系说明：不同取代基的咪唑类香豆素的抗SVCV活性要优于其他种类的化合物，其中，苯并咪唑和甲基咪唑取代基对化合物抗病毒活性贡献最大。细胞形态学和细胞活力检测显示上述4种香豆素显著地减弱了SVCV引起的细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE），并可维持EPC细胞生长活力，有效保护细胞免受病毒损伤。而相比之下，香豆素C4、D5处理感染SVCV的细胞后在72h以内产生的细胞活力保护效应优于另外两种抗病毒香豆素B4和C2，因此，被选为后续实验的研究对象。药物浓度梯度实验进一步发现香豆素C4、D5对SVCV的N、P和M蛋白相对表达的最高抑制率同样超过90%，并在较短时间内快速进入细胞，一定时间内维持较高的胞内药物浓度。2.香豆素C4、D5抗SVCV诱导的细胞凋亡研究通过细胞荧光染色、扫描电镜和透射电镜观察发现SVCV感染诱导EPC细胞出现典型的凋亡特征，包括细胞核皱缩、细胞形态断裂、凋亡小体产生以及细胞骨架崩解等， 我们证实SVCV可诱导EPC细胞发生细胞凋亡现象，而香豆素C4、D5则有效抑制细胞凋亡的发生。进一步的流式细胞术分析结果表明，SVCV感染EPC细胞48h后，导致超过52%的EPC细胞发生细胞凋亡；随着病毒感染时间的增长，细胞凋亡率进一步增加，达到63.2%。而在加入香豆素C4、D5后，药物处理组的细胞凋亡率明显降低，正常细胞的比例超过80%，已接近对照组水平。另外，研究发现随着C4、D5浓度的增加，药物处理组的细胞凋亡率持续下降，药物浓度与细胞凋亡率之间呈负相关关系。Caspase酶活性检测结果反映出香豆素C4、D5可有效控制SVCV诱导Caspase凋亡信号的启动，避免细胞凋亡的发生。3.香豆素C4通过PKC-Nrf2/ARE通路抗SVCV研究通过测定香豆素C4对PKC-Nrf2/ARE通路活化的影响，探究该化合物的抗SVCV作用机制。实验结果显示，C4显著提高胞内SOD和CAT酶活性以及GSH含量，保护细胞免受SVCV造成的氧化损伤。另外，香豆素C4在不同程度上提高了PKCαThr638和PKCβSer660两个位点的磷酸化水平，从而激活Nrf2Ser40位点的磷酸化，导致Nrf2入核蛋白量接近对照组的4倍，最终启动Nrf2/ARE抗SVCV通路。RNA干扰结果显示Nrf2/ARE通路的下游靶基因HO-1能够影响干扰素基因表达；而C4不仅可以显著提高HO-1基因的表达，同样对干扰素基因表达有促进作用。因此，香豆素C4的抗SVCV机制主要是利用PKCα/β两个亚基的磷酸化作用调控Nrf2/ARE通路促进HO-1表达，进而触发干扰素产生抗病毒反应。4.香豆素D5对SVCVG蛋白功能的作用研究通过研究香豆素D5对SVCV增殖的影响，发现该化合物在病毒感染前期干扰SVCV识别EPC细胞，抑制RNA由晚期内吞泡释放进入细胞质，最终发挥药物抗病毒作用。超速离心实验结果显示：在D5与SVCV粒子混合4h后，SVCVG蛋白的扩增效率下降约90%，病毒滴度由106.5±0.1减小到103.4±0.2，这说明D5可能对SVCVG蛋白结构造成一定破坏，从而降低病毒前期感染力和增殖力。通过构建SVCVG蛋白真核表达质粒，经过细胞转染、荧光显微镜和流式细胞术检测发现D5有效地抑制pEGFP-SVCVG质粒在EPC细胞内的表达，这个结果从另一方面证明了D5可以特异性作用于SVCVG蛋白，对G蛋白表达、功能产生影响。此外，香豆素D5显著地抑制Erk1/2的磷酸化作用，以激活Akt-mTor通路，减少EPC细胞内自噬小体的数量，降低SVCV诱导的细胞自噬水平，对SVCV在EPC细胞内的复制和病毒粒子的释放产生抑制作用。5.香豆素C4、D5在体抗SVCV活性研究通过注射方式研究香豆素C4、D5对斑马鱼死亡率和鱼体内病毒含量的影响，结果发现C4处理组斑马鱼的累积死亡率相对病毒组减少17.5%，D5处理组减少20%。斑马鱼脾脏和肾脏内SVCVG蛋白表达结果显示第1天和第4天鱼体内G蛋白的表达低于病毒组，反应了香豆素C4/D5的抗病毒作用。与此同时，这两种香豆素提高了斑马鱼体内的抗氧化酶活性，维持抗氧化-氧化系统平衡，并在SVCV复制前期通过激活鱼体干 扰素表达对病毒增殖产生一定的抑制作用，最终降低SVCV对斑马鱼感染力。由此可见，香豆素C4和D5可以作为抗SVCV感染潜在的备选药物。综上所述，香豆素C4、D5分别通过宿主抗病毒反应和直接作用病毒结构蛋白对SVCV增殖产生强烈的抑制作用，能够在体外和体内显著地降低病毒量，有效地维持宿主细胞生长活力，减少感染病毒斑马鱼的死亡率。因此，香豆素C4、D5对防控SVC具有广阔的应用前景。关键词：鲤春病毒血症病毒；香豆素类化合物；核因子E2相关因子2；细胞融合；细胞自噬 STUDYONANTIVIRALACTIVITYANDMECHANISMOFCOUMARINCOMPOUNDSAGAINSTSPRINGVIRAEMIAOFCARPVIRUSABSTRACTAsthetraditionalandcommonbreedingindustrythatthereisalargefarmingproductioninChina,cyprinidsarekindsofdeliciousfood.However,withtheexpansionofaquaculture,differentpathogenicmicroorganismshaveresultedinfrequentoutbreaksofdiseases,whichbringsubstantialeconomiclossestotheaquacultureindustry.Springviraemiaofcarpvirus(SVCV)isresponsibleforthehighlycontagiousspringviraemiaofcarp(SVC)diseaseassociatedwithoneofthemostseriousdiseasesincyprinids.Sinceviralinfectionshavebeenreportedinmostcyprinidfish,SVCisdesignatedanotifiablediseasebytheOfficeInternationaldesEpizooties(OIE)andalsolistedAinChineseanimalepidemicdiseasesdirectory.Uptonow,thereisnolicensedtreatmentsavailableforthecontrolofSVCVinfection,makingthemseriouspublichealth,andtherebySVCshouldbecloselymonitoredtodestructallaquaticlifewhentheinfectionisestablished.EventuallythetrendoftheSVCoutbreakwillbelimited.Inordertoobtainanti-SVCVdrugsinthisstudy,thenewlysynthesizedcoumarincompoundswereevaluatedantiviralactivitiesbyusingthecellmolecularscreeningmodelinvitro.ThefurtherresearchontheantiviralactivityofactivecoumarinswasstudiedthroughtheobservationonmorphologicalandbiochemicalchangesandtestsonapoptosisafterEPCcellsinfectedbySVCVorexposedbydrugs.Additionally,theeffectofactivecoumarinsonviralinfectionandtherelationshipbetweendrugsandhostantiviralresponsewerealsoexplored,whichwascontributedtoprovidethetheoreticalbasisforthedevelopmentofantiviraldrugsinaquaculture.Themainresultsaredescribedasfollows.1.Evaluationonantiviralactivityofcoumarincompoundsagainstspringviraemiaofcarpvirusinvitro.Forthepreliminaryscreen,therelativeexpressionofSVCVGproteinof49kindsofcoumarincompoundsweretestedbyquantitativerealtimePCR(qRT-PCR).Amongthescreenedcoumarins,theinhibitorypercentageofB4(7-[3-(benzimidazole)propane]coumarin),C2(7-[4-(4-methylimidazole)butoxy]coumarin),C4(7-[4-(benzimidazole)butoxy]coumarin)andD5(7-[6-(2-methylimidazole)dioxyl]coumarin)wasexaminedmorethan90%,asthemosteffectiveagentsinthistest.Byanalyzingthestructure-activityrelationship,differenttypesofimidazolederivatives(includingmethyl-imdazoleorbenzimidazole)wereconsideredtoplayakeyroleintheanti-SVCVactivityofthescreenedcoumarinsinthesamelengthofthelinker group.Furthermore,theactivecoumarinssignificantlyreducedSVCV-inducedcytopathiceffect(CPE),kepthostcellviability,andprotectedEPCcellsagainstSVCV.Incomparison,theprotectionofC4andD5in72hwasbetterthanB4andC2,andthustheywerechosenforthefurtherstudy.Importantly,C4andD5inhibitedtheexpressionofSVCVN,PandMmorethan90%,andshowedagoodmetabolicfeatureswiththehigherdrugcontentsincellsinacertainperiodoftime.2.EffectofC4andD5onSVCV-inducedapoptosis.Basedontheobservationoffluorescencestaining,scanningandtranslationelectronmicroscopythattypicalapoptoticfeaturesincludingcellularmorphologydisappeared,nuclearfragmentation,cytoplasmicdegradation,andthecollapseofcytoskeletalfibersystem,theresultsweredeterminedthatSVCVcouldinduceapoptosisinEPCcells,andC4/D5significantlyinhibitedSVCV-inducedapoptosis.Flowcytometryanalysisshowedthatmorethan52%ofapoptoticcellsoccurredin48hafterSVCVinfection.Withtheincreaseofinfectiontime,theapoptoticratewouldfurtherenhance,reaching63.2%.For10mg/LC4andD5treatments,apoptoticrateswerereducedsignificantly,whichthepercentofnormalcellswasmorethan80%thatclosedtothecontrolgroup.Besides,theapoptoticratesofcoumaringroupsweregraduallydecreasedwithdrugdoseenhanced,whichindicatedthatanegativecorrelationwasexistedbetweendrugdosesandviral-inducedapoptosistosomeextent.WhiletheresultofcaspaseactivityindicatedthatC4andD5controledsignaloccurancetoblockviral-inducedapoptosis.3.AntiviraleffectofcoumarinC4onSVCVclearanceviaNrf2/AREsignalingpathwayactivationregulatedbyPKC.InordertoexploretheantiviralmechanismofcoumarinC4againstSVCV,thestateofNrf2-AREsignalingpathwaywasexamined.TheresultshowedthatcoumarinC4obviouslyincreasedSODandCATactivitiesandGSHcontentinEPCcells,whichcouldpreventcellfromoxidativedamage.Inaddition,C4resultedinahigherphosphorylationlevelsofPKCαThr638andPKCβSer660tosomeextentthatisinvolvedintheactivationofNrf2phosphorylationtofavorNrf2translocationtonucleus4-foldversuscontrolgroup.TheresultofRNAinterferereflectedthatoneofdownstreamtargetgenesinNrf2-AREsignalingpathway,HO-1,couldaffectIFNsexpression,andthusinhibitSVCVreplication.FurtherdataofWesternblotandqRT-PCRindicatedthatC4alsoup-regulatedHO-1expressioninadditiontocellularIFNresponse.Therefore,C4hadanintenseresponseonSVCVreplicationthroughtheactivationofPKC-Nrf2-AREsignalingpathway,whichenhancedHO-1andIFNsexpressiontosuppressviralinfection.4.D5playedanantiviralroleonspringviremiaofcarpvirusbyactingontheGprotein. BystudyingontheeffectofcoumarinD5onviralreplicationduringtheearlystageofSVCVinfection,D5blockedviraladhesionorviralRNAdeliveryfromendosomestothecytosol,andthusplayedanantiviralroleinEPCcells.AfterincubatingSVCVwithD5invitro4handrecoveringthevirionparticlesbyultracentrifugationbeforeinoculationofcultures,theresultclearlyrepliedthatD5inhibitedtherelativeexpressionofSVCVGprotein(reaching90%)andsignificantlydecreasedviraltiterfrom106.5±0.1to103.4±0.2,whichindicatedthatD5brokevirusparticletoreduceviralinfectivityandproliferation.AsimilarresultwasobtainedfromtheexperimentusingEPCcellstransfectedwithpEGFP-SVCVG,inwhichD5inhibitedtheexpressionofpEGFP-SVCVGinEPCcells.Therefore,theresultspresentedinthissectionsuggestedthatD5targetSVCVGproteinandcanbeavirucidalagenttoblockSVCVreplicationinhostcells.Furthermore,D5alsoactivatedAkt-mTorsignalingpathwaybyreducingphosphorylationlevelsofErk1/2,whichdecreasedthenumberofautophagosomeandinhibitedSVCV-inducedautophagy.SinceautophagywasnecessaryforSVCVproliferationinEPCcells,therewasaninhibitionofD5duringviralreplicationandvirionparticlereleaseperiods.5.EvaluationonantiviralactivityofcoumarinC4andD5againstspringviraemiaofcarpvirusinvivo.SVCV-infectedzebrafishtreatedwithcoumarinC4andD5weretestedforfishmortalityandvirusconcentrationinfishbodybyintraperitoneallyinjectionmanner.TheresultsshowedthatthecumulativemortalityinC4orD5treatmentswasdecreased17.5%and20%comparedwithSVCVgroup,respectively.OtherdataalsoindicatedthatC4andD5hadanantiviraleffectonSVCV,becauseofthereductionofSVCVGproteinexpressioninspleenandkidneyat1stand4th.Meanwhile,twocoumarinspromotedanti-oxidaseactivitiesandthuskeptthebalanceofantioxidantsystem.Besides,C4andD5couldactivateIFNsexpressionagainstSVCVproliferationinzebrafishduringtheearlystageofviralinfection.Therefore,theseresultssuggestedthattreatmentwithC4orD5waspotentialagentsforreducingSVCVinfection.Insummary,coumarinC4andD5couldeffectivelycontrolSVCVproliferationbyhostantioxidant-antiviralresponseanddirectantiviraleffect,respectively.Astheconsequence,bothcoumarinsreducedvirusconcentrationobviously,kepthostcellviabilityeffectively,anddecreasedthemortalityofzebrafish.Therefore,therewasabroadapplicationprospectsofC4andD5inpreventionandcontrolofSVC.KEYWORDS:Springviraemiaofcarpvirus;Coumarincompounds;Nuclearfactor-E2-relatedfactor-2;Fusion;Autophagy 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1SVC简介......................................................................................................................21.1.1病症和病理变化...................................................................................................21.1.2流行情况...............................................................................................................31.1.3SVC的诊断与防治...............................................................................................41.2SVCV研究进展...........................................................................................................51.2.1生物学特征...........................................................................................................51.2.2结构蛋白特征.......................................................................................................61.2.3分类地位...............................................................................................................81.2.4SVCV毒株的遗传多样性....................................................................................81.3抗病毒药物研究进展..................................................................................................81.3.1抗病毒药物的类型...............................................................................................81.3.2抗病毒药物作用机制研究.................................................................................111.4香豆素类化合物简介................................................................................................121.4.1香豆素类化合物的分类.....................................................................................131.4.2香豆素类化合物的生物活性.............................................................................141.5本研究的目的和意义................................................................................................18第二章香豆素类化合物离体抗SVCV活性研究...............................................................192.1材料与方法................................................................................................................192.1.1细胞和病毒.........................................................................................................192.1.2香豆素类化合物.................................................................................................202.1.3试剂和仪器.........................................................................................................242.1.4细胞培养、病毒增殖及滴度检测.....................................................................242.1.5香豆素毒性检测.................................................................................................242.1.6香豆素抗SVCV活性初筛检测........................................................................252.1.7抗SVCV香豆素活性复筛检测........................................................................272.1.8香豆素C4、D5在EPC细胞内的药物代谢检测............................................272.1.9香豆素C4、D5前、后处理细胞抗SVCV活性检测.....................................282.2结果与分析................................................................................................................292.2.1香豆素抗SVCV活性初筛检测结果................................................................292.2.2抗SVCV香豆素复筛检测结果........................................................................292.2.3香豆素（B4/C2/C4/D5）对SVCVN、P以及M蛋白表达的作用结果......31 2.2.4EPC细胞形态学观察结果..................................................................................322.2.5香豆素对病毒滴度的作用结果.........................................................................342.2.6香豆素C4、D5细胞内代谢检测结果.............................................................352.2.7香豆素C4、D5前、后处理细胞的抗SVCV活性检测结果.........................362.3讨论............................................................................................................................362.3.1药物构效关系分析.............................................................................................362.3.2香豆素类化合物的抗病毒作用.........................................................................382.4小结............................................................................................................................39第三章香豆素C4、D5抗SVCV诱导的细胞凋亡活性研究............................................403.1材料与方法................................................................................................................403.1.1细胞和病毒.........................................................................................................403.1.2药物.....................................................................................................................413.1.3试剂和仪器.........................................................................................................413.1.4香豆素C4、D5对SVCV诱导的细胞凋亡形态学作用.................................413.1.5细胞超微结构观察.............................................................................................423.1.6AnnexinV-FITC/PI凋亡双染检测.....................................................................433.1.7Caspase酶活性分析............................................................................................443.2结果与分析................................................................................................................443.2.1细胞核损伤观察结果.........................................................................................443.2.2细胞骨架损伤观察结果.....................................................................................463.2.3细胞表面超微结构观察结果.............................................................................483.2.4细胞内部超微结构观察结果.............................................................................493.2.5AnnexinV-FITC/PI凋亡双染检测结果.............................................................503.2.6Caspase酶活性检测结果....................................................................................523.3讨论............................................................................................................................533.3.1病毒感染引起的细胞凋亡.................................................................................533.3.2病毒对细胞骨架的影响.....................................................................................533.3.3Caspase家族的作用............................................................................................533.4小结............................................................................................................................54第四章香豆素C4通过PKC-Nrf2/ARE通路抗SVCV研究.............................................554.1材料与方法................................................................................................................564.1.1细胞和病毒.........................................................................................................564.1.2药物.....................................................................................................................564.1.3试剂、抗体和仪器.............................................................................................564.1.4香豆素C4对SVCV感染过程的作用..............................................................56 4.1.5香豆素C4对细胞抗病毒反应的作用..............................................................574.2结果与分析................................................................................................................614.2.1香豆素C4对SVCV感染过程的作用结果......................................................614.2.2抗氧化酶活性及ROS检测结果.......................................................................644.2.3Nrf2表达及核转运检测结果.............................................................................644.2.4PKC激活剂和抑制剂抗SVCV检测结果........................................................684.2.5PKC激活剂和抑制剂对Nrf2蛋白和下游靶基因HO-1表达的作用结果....694.2.6香豆素C4对PKCα/β亚基磷酸化的作用结果...............................................714.2.7香豆素C4对HO-1表达的作用结果...............................................................724.2.8siHO-1对干扰素表达的作用结果.....................................................................724.2.9香豆素C4对干扰素基因表达的作用结果......................................................734.3讨论............................................................................................................................744.3.1Nrf2-ARE信号通路与病毒的关系....................................................................744.3.2PKC对Nrf2-ARE信号通路的调控作用..........................................................754.3.3HO-1的抗病毒作用............................................................................................754.4小结............................................................................................................................76第五章香豆素D5对SVCVG蛋白功能的作用研究.........................................................775.1材料与方法................................................................................................................785.1.1细胞和病毒.........................................................................................................785.1.2药物.....................................................................................................................785.1.3试剂、抗体和仪器.............................................................................................785.1.4香豆素D5对SVCV感染过程的作用.............................................................785.1.5香豆素D5对细胞抗病毒反应的作用..............................................................795.2结果与分析................................................................................................................805.2.1香豆素D5对病毒感染过程的作用结果..........................................................805.2.2超速离心检测结果.............................................................................................825.2.3香豆素D5对G蛋白重组质粒细胞内表达的作用结果.................................845.2.4Erk抑制剂抗SVCV检测结果..........................................................................855.2.5香豆素D5和Erk抑制剂对细胞自噬的作用结果..........................................875.2.6香豆素D5和Erk抑制剂对Erk1/2、Akt和mTor磷酸化的作用结果........905.3讨论............................................................................................................................915.3.1抗病毒药物的作用靶点.....................................................................................915.3.2细胞自噬与病毒的关系.....................................................................................925.3.3PI3K-Akt-mTor信号通路对细胞自噬的调控作用...........................................925.4小结............................................................................................................................93 第六章香豆素C4、D5在体抗SVCV活性研究................................................................956.1材料与方法................................................................................................................956.1.1病毒和实验鱼.....................................................................................................956.1.2药物.....................................................................................................................956.1.3病毒攻毒浓度检测.............................................................................................956.1.4香豆素C4、D5在体抗病毒活性检测.............................................................956.2结果与分析................................................................................................................966.2.1SVCV攻毒模型构建结果..................................................................................966.2.2香豆素C4、D5在体抗病毒活性检测结果.....................................................976.2.3香豆素C4、D5诱导干扰素基因表达检测结果.............................................986.2.4香豆素C4、D5在体抗氧化检测结果.............................................................996.3讨论..........................................................................................................................1006.4小结..........................................................................................................................101结论................................................................................................................................102参考文献................................................................................................................................103附录................................................................................................................................120致谢................................................................................................................................126作者简介................................................................................................................................128 第一章文献综述据中国渔业年鉴数据，我国水产养殖总量约占世界总量的70%，是世界上水产养殖产量最大的国家，也是世界上唯一养殖产量超过捕捞产量的国家，其中，养殖产量占总产量的73.7%（季本安等2017）。随着水产养殖集约化程度的加剧、规模化和产业化程度的不断提高，日益恶化的养殖水域环境导致了鱼类病害越来越频发。在鱼类养殖的过程当中，病害的发生将严重影响鱼类的生长、发育和繁殖，重者更将导致养殖鱼类的大面积死亡，直接导致严重的经济损失，因此对于病害的治疗工作十分重要。水产养殖业中，引起水产动物疾病的病原主要是细菌、真菌、病毒及寄生虫等，其中大多数病原引起的疾病都可以利用药物防治手段得到控制。而水生动物病毒病的治疗目前还存在一定的难度，其主要以预防为主，从源头管理做起，其次是切断病毒传播途径（王姝等2012）。鱼类病毒性疾病中的鲤春病毒血症（SpringViremiaofCarp，SVC）是由鲤春病毒血症病毒（SpringViremiaofCarp，SVCV）引发的一种严重危害鲤科鱼类的急性出血性病毒病。SVCV的宿主范围很广，能感染包括鲤（Cyprinuscarpio）、金鱼（Carassiusauratus）、锦鲤（Cyprinuscarpiokoi）、鲫（Carassiuscarassius）、草鱼（Ctenopharyngodonidella）以及鳙（Aristichthysnobilis）等在内的几乎所有的养殖鲤科鱼类（Ahneetal.2002；Fijan1984），其中，一龄以上的鲤鱼受危害最为严重。同一鱼种的不同个体之间对SVCV的易感性差异很大，成年鲤鱼发病通常不发生死亡或死亡率较低，鱼龄越小越敏感，因此，该病的流行对我国鲤科鱼类的养殖构成极大的威胁。自1971年病毒毒株被分离、鉴定以来（Fijan1972），研究人员一直致力于寻找可有效防控SVC的治疗手段。然而到目前为止，尚无任何有效控制该病发生的药物、疫苗或方法，国际上通行的有效措施是对SVC进行严密的监测，及早发现该病，并对病鱼进行隔离或扑杀，从而达到抑制SVC暴发流行的目的。通常疫苗免疫和高效、低毒、低残留、环境污染小的无公害抗病毒药物是预防病毒性疾病爆发的有效手段，也是保障水产品安全和生态安全重要措施。然而，渔用疫苗大规模的商业化以及在世界范围内推广应用进程仍然十分缓慢（杨先乐和曹海鹏2005）。因此，药物防治技术研究对于SVC和其它水产病毒病的防控与健康养殖有重要意义。我国拥有丰富的药用植物资源，并有着悠久的实践历史，从药用植物中筛选抗病毒药物有潜在的广阔的应用前景。近些年，在抗击“非典”和甲型流感病毒过程中，中医药显示出独特的抗病毒优势，引起世人的高度重视（崔颖和郑继方2010）。植物合成物和次级代谢产物，也称为天然产物，是一类小分子化合物，它们结构多样化、生物活性多样化。与现有的西药相比，植物源药物易于在自然环境中降解，对水体环境和水生生物不会造成严重污染，在人体内积累的可能性较低，同时还具有独特的作用机理和作用方式、不易产生耐药性等优点。近年来，以天然活性产物的结构作为先导药物模型，根1 据构效关系分析对先导化合物进行结构修饰进而产生拥有自主知识产权的新药已成为国内外开发新型植物源药物的研究热点，具有非常重要的经济和社会意义。1.1SVC简介SVC被世界动物卫生组织（Officeinternationaldesépizooties，OIE）列为必须上报的动物疾病之一（Ashrafetal.2016），我国农业部所发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》也将SVC列为一类动物疫病。SVC通常在春季爆发，并引起幼鱼和成鱼极高的死亡率（Kanellosetal.2006）。起初SVC主要流行于东欧和中欧国家，逐步传播至欧洲大部分地区。随着水产贸易的快速发展和鱼类新品种的引进，目前北美、西亚以及中东地区也均有流行（Ahneetal.2002；Dikkeboometal.2004；Fijan1999；Tengetal.2007）。截止到目前，我国尚未有该病大规模爆发的报道，但已从患病的金鱼、锦鲤等观赏鱼体内分离、鉴定出SVCV（Liuetal.2004）。1.1.1病症和病理变化图1-1感染SVCV的锦鲤（Pettyetal.2014）Figure1-1KoiinfectedwithSVCV感染SVCV的鱼类会出现呼吸困难、游动活力下降、常常聚集在池塘出水口等现象，并伴有死亡，这是SVC爆发的早期信号。随着病毒在鱼体的增殖，发病后期的病鱼游动速度进一步下降甚至几乎停止游动，对外界刺激反应迟钝，身体丧失平衡（陈爱平等2010）。由于SVCV主要在毛细血管内皮细胞、造血器官和肾细胞内增殖，从而破坏了体内水盐平衡和正常的血液循环，在临诊上表现为各组织器官的水肿、出血、变性、坏死及炎症。该病的主要病状是鱼体色发黑，有瘀斑性出血，常见于皮肤及鳃上。鳃丝颜色变浅，呈淡红色或灰白色，并有出血点，眼球突出，肛门红肿且突出，能够从肛门处拖出细长、黏稠呈粪便样的“假粪”；鱼体腹部膨大，有大量带血的腹水，在将病鱼捞出水时，腹水可从肛门处自动流出（图1-1）。病鱼的肌肉会因出血而呈红色，肝胰脏、2 脾、肾肿大，造血组织坏死。脾脏严重充血，肾脏的排泄管出现退行性变化。其他内脏也会有出血斑点，尤以鳔壁最常见，而鳔的血管极度扩张。自然情况下，SVC通常与细菌性病原并发感染或继发感染。在无细菌继发性感染时，病鱼主要表现有鱼体局部出血，造血组织坏死以及黏膜下组织水肿，脑血管周围淋巴细胞增多以及肝脏、心脏局部坏死等现象；如伴有细菌感染，则会引起细菌性败血症，出现带血的腹水，肠壁严重发炎，常伴有纤维素性腹膜炎、其他性炎及坏死性肠炎。此外，病鱼体内血红蛋白量减少，嗜中性粒细胞及单核细胞数增加，血浆中糖原及钙离子浓度降低。当出现显性感染时，电镜检查可清晰的发现鱼肝胰脏、脾脏、肾脏、鳃以及脑中都含有大量病毒颗粒。1.1.2流行情况SVC曾被称为鲤传染性水肿病的一种复合病症，多年来一直存在争议。Fijian等（1971）从患急性型鲤水肿病的鲤鱼中分离得到一株弹状病毒，建议将此病称为SVC。顾名思义，该病主要流行在水温较低的春季，暴发流行的最适温度为16~17℃，鱼苗和成鱼在水温17℃以上时很少发生显性感染。当水温超过22℃时，鱼一般不再发病，偶然幼鱼在22~23℃时也能受到感染。人工感染潜伏期随水温、感染途径、病毒感染量而不同，周期可从1至60d；在13~20℃时潜伏期为7~15d。在流行季节，封闭池塘鱼种、苗一旦感染病毒，发病率可达100%，死亡率达到50~70%甚至更高。自然环境下，发生于冷水阶段的SVC往往表现为慢性，而许多暖水阶段则表现为急性。该病曾主要流行于欧洲一些冬、春季水温低的国家，包括英国、罗马尼亚、德国、捷克和乌克兰等地区，鱼类最高死亡率达到80~90%（Baudouyetal.1980）。随后，亚洲部分国家、南美洲和北美洲也相继报道（Ahneetal.2002；Fijan1999；Dikkeboometal.2004；Garveretal.2007；Pettyetal.2014；Phelps2012；Tayloretal.2013；Tengetal.2007；Yuetal.2014a）。目前，SVC已成为一种全球性的鱼类病毒病。SVCV主要通过水平方式进行传播，也不排除垂直传播的可能。病鱼、死鱼、携带病毒的鱼被污染的水以及网具等是主要传染源。病毒可由感染鱼排出的粪便经水体传播，也可经某些血吸昆虫如水蛭和鱼虱传播。此外，病毒自身可在适宜的水温环境下在水体中存活一周左右。病毒侵入鱼体一般首先感染鱼鳃上皮细胞，进行一系列增殖（Kanellosetal.2006），再逐渐侵染其他组织器官，最终导致鱼发病。在人工感染试验中，通过注射方式感染病毒，鱼类的死亡率为100%，而通过浸泡方式则只有20%，因此，外伤也是一个重要的病毒传播途径（王姝等2012）。普通鲤在进入含有病毒的水中2h后即可在鳃组织中观察到病毒颗粒，6d后可在血液中发现病毒，10~11d后在各种内脏器官中鉴定出病毒。由于SVCV感染后存活的鱼能够产生强烈的免疫保护力并伴有循环抗体成为隐形的病毒携带者，因此在养殖场一旦出现SVC爆发情况，如不销毁养殖场内所有的水生生物，将很难根除该病毒（Ahneetal.2002）。3 1.1.3SVC的诊断与防治1.1.3.1SVC的诊断方法作为一种鲤科养殖鱼类的重大病害，SVCV的快速检测、鉴定对于有效防控SVC至关重要。传统的血清学检测通过细胞培养、分离病毒，利用包括中和试验、免疫过氧化物酶分析、间接免疫荧光观察以及酶联免疫吸附反应等鉴定SVCV（FaisaandAhne1984；Rodáketal.1993）。然而，整个操作过程往往费时费力（Ahne1980），并且在间接免疫荧光和酶联免疫吸附反应试验中容易出现与其他弹状病毒的交叉反应（Way2010），很难将SVCV与其他病毒明确区分。另外，单克隆抗体也是一种有效检测SVCV的工具，能够特异性识别病毒功能蛋白（Chenetal.2008；Luoetal.2014）。但由于传统生产工艺的复杂性，单克隆抗体的生产尚需要得到进一步的优化。近期一种全新的单链抗体被应用于快速鉴定SVCV（Liuetal.2013），试验表明该抗体能特异性识别SVCV，并且不会与其他弹状病毒产生交叉反应。因此，这种方法的建立提供一种简单、有效且节省成本的应用基础，有助于今后对SVCV的快速鉴定。除了上述的检测手段外，多种PCR方法因灵敏性高、可快速准确地鉴定病原也被用于SVCV的鉴定。其中，包括以反转录PCR（ReversetranscriptionPCR，RT-PCR）为基础构建的SVCVM和G蛋白基因的生物素标记的DNA探针（Oreshkovaetal.1999）、RT-PCR结合巢式PCR联合检测方法（Koutnáetal.2003）、多重实时定量PCR（Real-timequantitativePCR，qRT-PCR）（Liuetal.2008）和TaqMan探针法（Yueetal.2008）。而根据2002年颁布的《鲤春病毒血症病毒（SVCV）逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法》，我国出入境检验检疫行业标准是利用RT-PCR方法检测SVCV。此外，易感细胞系对于病毒检测、分离和鉴定也是必需的。目前，OIE推荐使用EPC细胞和FHM细胞分离SVCV，这两种细胞在接种SVCV能够产生明显的CPE现象（王姝等2012）。在观察到敏感细胞系出现CPE时，可立即通过PCR方法、电子显微镜、免疫荧光分析和病毒滴度检测等手段对病毒进行综合鉴定。1.1.3.2SVC的防治措施目前，该病在防治方面只能实行较为严格的卫生管理和控制措施。由于该病的免疫疫苗尚处于实验阶段，因此目前无有效的治疗方法。在防治方面，首先必须采取严格检疫，杜绝病毒源的流入，特别是针对欧洲的鱼种。再者，水温在20℃以上时，鲤鱼机体内能产生较高水平的干扰素和抗体，抵御SVCV的攻击，所以可将水温提高至22℃以上以控制该病发生。其次，池水需用含碘量100mg/L以上的碘伏、季铵盐类或含氯消毒剂消毒。另外，培育抗病力强的鱼种，保证饵料质量，合理投饵有效避免SVC的爆发。值得注意的是，小型养殖场尚可通过上述手段避免SVC的爆发，而大型养殖场由于周围的环境条件难以控制，一般的防治措施很难奏效。目前，通过传统手段的选择、杂交和分子手段的基因遗传学技术都未能培育出具有4 SVCV抗性的育苗株。而研发的灭活苗和弱毒苗在鱼体内虽然能产生一定的免疫力，但还存在许多不足，如造价高、保护力不强以及安全性低等。新兴的DNA疫苗与传统疫苗相比有许多优点，成本低、易生产和储存；而多价苗将多个编码抗原的基因插入到同一个载体上构建质粒，能够高效率的抗多种病害。当前在水产养殖业中，针对VHSV和IHNV的新型疫苗已显示出良好的应用价值，但至今无SVCV新型疫苗的报道。因此，认为，研究人员认为今后需要为水产疫苗的发展建立一套可灵活应用的模型和标准，以满足疫苗的效力、安全性和是否能通过当地的法规、符合当地流行病学情况等各种限制条件，为将来开发SVCV疫苗（包括活苗、灭活苗、亚单位苗和核酸苗）做准备（Ahne2002；Ashrafetal.2016）。1.2SVCV研究进展1.2.1生物学特征AB图1-2SVCV病毒结构及其基因组示意图。（A）病毒粒子的结构；（B）基因组结构和基因连接序列（Ashrafetal.2016）。Figure1-1SchematicofSVCVanditsgenome.(A)Modelofviralstructure;(B)Structureofgenomicorganizationandgenejunctionsequence.SVCV病毒粒子为弹状病毒的典型形态学特征，呈棒状或子弹状，一端为圆弧形，另一端平坦，长90至180nm，宽60至90nm（徐耀先2000），外面有一层紧密包裹着的囊膜（图1-2A）。病毒基因组长度为11019个核苷酸残基，为负链RNA，包含5个主要的开放阅读框（OpenReadingFrame,ORF），编码5个蛋白，排列次序为3’-N-P-M-G-L-5’（图1-2B）（Björklundetal.1996）。病毒核苷酸主要与核蛋白（Nucleoprotein，N）结合成核衣壳，呈螺旋对称，直径约为50nm，并结合有少量的磷蛋白（Phosphoprotein，P）和RNA聚合酶（Polymerase，L）；囊膜由脂质和蛋白质组成，紧密地包裹着核衣壳，内表面为基质蛋白（Matrixprotein，M），外表面为糖蛋白（Glycoprotein，G）（Ahneetal.2002）。5 病毒粒子的浮力密度在CsCl中为1.20~1.20g/mL（BachmannandAhne1973），在15~60%的蔗糖溶液中为1.16g/mL（Lenoir1973），在5~25%的蔗糖梯度系统中的沉降系数为38~40S（Hill1975）。在纯化、制备病毒过程中，很容易观察到SVCV的缺损颗粒，其长度只有正常病毒粒子的2/3。尽管缺损病毒含有与正常病毒相同的脂质和蛋白质等组成成分，但无感染性（Ahneetal.2002）。病毒自身的抵抗力不强，感染力容易受到各种环境因子的影响，对脂类溶剂、酸和热等条件极度敏感，如对乙醚敏感；对温度敏感，加热15min，45℃条件时病毒感染力仅为1%，60℃时为0，在56℃加热且pH为3的条件下，SVCV可迅速灭活，14℃下也可使90%的病毒灭活；对酸敏感，在pH=3的溶液中处理病毒粒子30min，感染率下降为1%；在pH为7~10时，病毒感染率稳定，为100%；pH=11时，病毒感染率为50%~70%。另外，福尔马林、含氯消毒剂（500mg/L）、NaOH溶液（2%）、碘液（0.01%）、紫外线和γ射线等可以使病毒在较短时间内（约10min）失活（付峰等2006）。而血清（fetalbovineserum，FBS）对病毒粒子的感染力具有一定的保护作用，即保存在含2%FBS培养液中的SVCV，在反复冷冻-解冻4次过程中病毒感染率仅下降10%，而无血清时则下降95%。因此，试验人员常采用冷冻干燥法，用含一定浓度血清的冻存液在液氮中长时间保存病毒（黄琪琰1993）。SVCV可以在黑头软口鲦上皮瘤细胞（Epitheliomapapulosumcyprini，EPC）、草鱼性腺细胞（GrassCarpOvaryCell，GCO）、胖头鲤肌肉细胞系（FatHeadMinnow，FHM）以及斑马鱼胚胎细胞系（ZebrafishEmbryonicFibroblast，ZF-4）等鱼类细胞株上增殖，并出现相应的细胞病变效应（Cytopathogeniceffect，CPE）（王津津等2016；Espínpalazónetal.2016）。此外，SVCV也可在猪肾、牛胚、鸡胚以及一些爬行动物细胞株上增殖（付峰等2006）。1.2.2结构蛋白特征表1-1SVCV基因组特征（Ashrafetal.2016）Table1-1CharacteristicsoftheSVCVgenomeGeneORFORFstartORFend5'UTRProtein3'UTRORFProteinlengthlengthpositionpositionlengthlengthlength(bp)(bp)(bp)(nt)(nt)(bp)(aa)ORF1N133512721070132668418ORF2P967930101407233627309ORF3M716672102376304734223ORF4G15881530103094462348509ORF5L6325628810468610973Trailer2095SVCV主要编码5个蛋白，各结构蛋白编码位置如表1-1所示（吴术盛2015）。该病毒基因组的前导区有69个核苷酸，其中，1~19位可能为启动子，50~56位是前导RNA的转录终止信号，60~64位是N蛋白的转录其实信号AACAG，而拖尾序列含有L蛋白的转录终止信号TATG（A），为49个核苷酸长度，并且末端有一段核苷酸序列与前导6 区反向互补，这是不分段负链RNA病毒的一个共同特征（Hoffmannetal.2002）。病毒基因间的连接区是严格保守的，除了G-L基因间为CTAT4个核苷酸，其余基因序列间均有CT2个核苷酸（Björklundetal.1996）。SVCV的这些调节区域与其他水泡病毒属成员都是一致的，但与弹状病毒科的其他属病毒有差异。1.2.2.1核蛋白（N）核蛋白N在SVCV结构蛋白中含量最丰富，是组成病毒粒子核衣壳结构的关键蛋白，与病毒RNA相互作用形成核衣壳的双螺旋结构（Chenetal.2008），其分子量约为47KDa，共编码418个氨基酸残基，氨基酸序列与水泡性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus，VSV）的核蛋白同源比例达50%以上（Hoffmannetal.2002）。目前，有关核蛋白功能的研究相对较少，对比其他弹状病毒核蛋白的功能可以推测，SVCV的核蛋白在病毒的基因转录及调控过程中发挥重要作用（Dasetal.1999）。1.2.2.2磷蛋白（P）作为病毒粒子核衣壳的组成成分之一，磷蛋白P是一种与聚合酶相关的磷酸化蛋白，由309个氨基酸残基组成，分子量约为35.5KDa。该蛋白与N蛋白、聚合酶L蛋白共同参与病毒RNA的转录和复制（Blumbergetal.1981）。与另外4种蛋白相比，磷蛋白的含量较低，据推测，这可能是由于磷蛋白基因的起始密码子不易被核糖体识别，进而导致该蛋白的翻译水平下降（Guptaetal.2003）。1.2.2.3基质蛋白（M）基质蛋白即M蛋白，由223个氨基酸组成，分子量约为25.6KDa。作为连接胞质和囊膜的桥梁，M蛋白参与形成病毒粒子的弹状结构（Ahneetal.2002）。M蛋白富含丝氨酸和苏氨酸，可发生磷酸化作用，通过与病毒的核衣壳以及进入宿主细胞膜内的糖蛋白G胞浆结构域相互作用，启动病毒粒子的装配和出芽（KiuchiandRoy1984）。此外，研究发现M蛋白序列的N端与VSV较为相似，富含一段高度保守的脯氨酸氨基酸序列PPXY（P为脯氨酸，Y为酪氨酸，X为任意氨基酸），这可能与病毒的出芽紧密相关（付云红2012）。此外，该蛋白还能阻断拼接mRNA、snRNA和snRNP的核转运，并降低其他物质的核转运速率（付云红2012）。1.2.2.4糖蛋白（G）糖蛋白G位于病毒粒子的表面，由509个氨基酸组成，分子量大小约为57.4KDa，其在结构上存在糖基化作用。作为是一种典型的跨膜蛋白，G蛋白在氨基端有一段疏水性的信号肽，在切除信号肽后方可形成成熟的糖蛋白。G蛋白在病毒粒子表面形成三聚体状的囊膜粒子，与细胞上的受体结合，介导病毒内吞作用（Ahneetal.2002）。另外，作为病毒最主要的抗原决定簇蛋白，G蛋白决定着病毒的血清学特征，可导致机体产生中和抗体，以激活细胞免疫（Johnsonetal.1999）。目前，有研究表明弹状病毒的G蛋白在细胞内传递过程中发生构象改变，诱导细胞发生融合从而将病毒的核酸物质由吞噬泡释放进入细胞质（EstepaandColl1997；Masetal.2002）。7 1.2.2.5病毒依赖性RNA聚合酶蛋白（L）在SVCV5个结构蛋白中，L聚合酶蛋白的分子量最大，约为238.2KDa，可编码2095个氨基酸残基，是一种病毒依赖性RNA聚合酶，需要在N蛋白和P蛋白的辅助下才能发挥酶活性，进而共同完成病毒的转录和复制（Björklundetal.1995）。聚合酶蛋白的活性在20~25℃时最高，并受到甲基供体S-腺苷-L甲硫氨酸浓度的影响（RoyandClewley1978）。1.2.3分类地位目前SVCV属弹状病毒科（Rhabdoviridae）、水泡性病毒属（Vesiculovirus）的暂时成员。该病毒科的成员可以感染脊椎动物、无脊椎动物以及植物等。除植物弹状病毒外，感染动物的弹状病毒主要分为4个属:①水泡性病毒属（Vesiculovirus），代表种为水泡性口炎印第安纳病毒（VesicularStomatitisIndianaVirus，VSIV）；②狂犬病毒属（Lyssavirus），代表种为狂犬病毒（RabiesVirus，RABV）；③短时热病毒属（Ephemerovirus），代表种为牛流行热病毒（BovineEphemeralFeverVirus，BEFV）；④粒弹状病毒属（Novirhabdovirus），代表种为鱼类传染性造血器官坏死病毒（InfectioushaematopoieticNecrosisVirus，IHNV）。最初SVCV因其基本特征被认为是哺乳动物弹状病毒的一员。随着近期对弹状病毒基因组研究和对SVCV基因组和蛋白质分析的深入，研究人员将SVCV分入Vesiculovirus，作为一种暂定种。1.2.4SVCV毒株的遗传多样性概括地说，SVCV在进化上主要被分为两大分支：亚洲型和欧洲型（Milleretal.2007；Stoneetal.2003）。依据G蛋白核苷酸序列的结果，Stone等（2003）对多个采集地分离的SVCV毒株进行分析、比对和系统发育树研究，又将SVCV分为Ia、Ib、Ic和Id4个亚组。其中Ia亚组的毒株分离自亚洲、英国和北美地区；Ib和Ic亚组的毒株分离自东欧地区；Id亚组的毒株来自英国和一些其他欧洲国家（Hoffmannetal.2005；Milleretal.2007；Stoneetal.2003；PadhiandVerghese2012；Zhangetal.2009）。SVCV毒株的遗传聚类与地理分布有关，也就是说在不同的地区病毒的进化是相对独立的（Stoneetal.2013）。另外，不同毒株的进化速度是不同的，Ia亚组的进化速度最高，其中，该组中P和G蛋白的核苷酸替代率比Id组高出3.5倍（PadhiandVerghese2012）。相比于N和G蛋白，P蛋白显示了较高的基因变异程度，因此作为一个合适的检测指标用来研究SVCV的流行趋势（Milleretal.2007；SokolandKoprowski1975）。1.3抗病毒药物研究进展1.3.1抗病毒药物的类型根据药物化学结构性质和来源分类，抗病毒药物主要分为化学合成药物和中药制剂两大类。8 1.3.1.1化学合成药目前已获批准使用的抗病毒药物很少，只属于少数几个化学家族（表1-2）。虽然这些化合物是安全有效、作用靶点、抗病毒作用途径和作用机理较为明确，但其中有些疗效并不显著且有一定的副作用，因此限制了它们的应用。以下是一些常见的抗病毒化学合成药物及其作用机制。（1）阿昔洛韦：该化合物于1974年首次发现，直到20世纪80年代中期研究人员才认识到它具有抗疱疹病毒作用。作为一种核苷类似物，阿昔洛韦结构与鸟嘌呤核苷类似，只是具有一个非环状的糖基。阿昔洛韦是一种药物前体，必须在感染病毒的宿主细胞内经磷酸化作用后才能发挥抗病毒作用（王慧英和康克非1990）。（2）更昔洛韦：该化合物是阿昔洛韦的衍生物，主要用来治疗人巨细胞病毒（Cytomegalovirus）感染。Cytomegalovirus基因组能够编码磷酸化更昔洛韦的激酶，从而活化该化合物发挥抗病毒作用。（3）利巴韦林：又称病毒唑，于1972年合成，具有广谱抗病毒活性。利巴韦林磷酸盐能够竞争性抑制肌苷单磷酸脱氢酶，导致鸟嘌呤核苷5’-三磷酸（GTP）合成受阻，使病毒核酸合成物缺少而抑制病毒复制。利巴韦林同时抑制病毒RNA依赖的聚合酶的起始和延伸过程。（4）金刚烷胺：作为第一种针对多种病毒的特异性高且药效强的抗病毒药物，金刚烷胺是含有三个环状结构对称的胺类化合物，能够特异性阻断四聚体跨膜离子通道，使质子不能进入病毒颗粒内部，阻止甲型流感病毒的脱壳，阻碍病毒核酸物质在转录和复制（李秋和王珊2011；Jacobetal.2016）。（5）膦甲酸钠：该药是唯一一个用于治疗疱疹病毒的非核苷DNA复制抑制剂，是疱疹病毒DNA聚合酶上焦磷酸结合位点的非竞争性抑制剂，对于乙肝病毒聚合酶和人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV）逆转录酶也有抑制作用（唐伟伟2015）。表1-2抗病毒药物目录（DeClercq2002）Table1-2TheantiviralrepertoireSelectedcompoundsinCompoundsApproachTargetvirus(es)developmentfortheapprovedindicatedtargetvirusPolysulphates,polysulphonates,HIV,HSV,CMV,polycarboxylates,VirusadsorptionRSVandotherpolyoxometalates,inhibitorsenvelopedviruseschicoricacid,zintevir,cosalanederivatives,negativelychargedalbumins9 HIV,RSVandVirus–cellfusionHIV:AMD3100,TAK779otherinhibitorsandT20derivativesparamyxovirusesAcyclovir,valaciclovir,HerpesvirusesBicyclicfuropyrimidineganciclovir,ViralDNA(HSV-1,-2,VZV,nucleosideanalogues,valganciclovir,polymeraseinhibitorsCMV,EBV,HHV-A5021,penciclovir6,-7,-8)cyclohexenylguaninefamciclovir,brivudin,foscarnetNRTIs:zidovudine,didanosine,zalcitabine,Emtricitabine,amdoxovirReversetranscriptasestavudine,lamivudine,Emivirine,UC781,HIVinhibitorsabacavir,NNRTIs:DPC083,TMC125nevirapine,(R165335)delavirdine,efavirenzDNAviruses(polyoma-,Acyclicnucleosidepapilloma-,herpes-,CMV:cidofovir;HIV:HBV:adefovirphosphonatesadeno-andtenofovirpoxviruses),HIV,HBVInhibitorsofprocessesassociatedwithviralHIV,HCVRNAsynthesisHIV:saquinavir,HIV:atazanavir,mozenavir,ViralproteaseHIV,herpesviruses,ritonavir,indinavir,tipranavir;Humaninhibitorsrhinoviruses,HCVnelfinavir,rhinovirus:AG7088amprenavir,lopinavirViralneuraminidaseInfluenzaAandBZanamivir,oseltamivirRWJ270201inhibitorsvirusIMPdehydrogenaseMycophenolicacid,EICAR,HCV,RSVRibavirininhibitorsVX497(–)RNAS-haemorrhagicfeveradenosylhomocysteineviruses(forhydrolaseinhibitorsexample,Ebola)1.3.1.2中草药制剂中草药是我国传统医学的重要组成部分，是中华民族医学和文化的瑰宝。中国拥有丰富的药用植物资源，并有着悠久的实践历史，从药用植物中筛选抗病毒药物有潜在的广阔的应用前景（陈晓慧2017）。与化学合成药相比，中草药的活性成分易于在自然环境中降解，对水体环境和水生生物不会造成严重污染，在人体内积累的可能性较低。10 中草药的生物活性成分十分复杂，种类繁多，主要有生物碱、挥发油、萜类、皂苷类、酚类、植物蛋白和多糖类物质等（孙居锋2007）。以往的研究发现：金银花、黄连、苦参、板蓝根、银杏、黄芪和甘草等对流感病毒（Flu）、乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）、呼吸合胞病毒（RespiratoryVirus）、HIV、非典型性肺炎病毒（SevereAcuteRespiratorySyndromeassociatedCoronavirus，SARS-CoV）、单纯疱疹病毒（HerpesSimplexVirus，HSV）、登革热病毒（DengueVirus，DENV）等具有良好的抗病毒活性（何立巍等2005；Shangetal.2011；Zhangetal.2010；Zouetal.2012）。针对水生动物病毒，研究人员发现将中草药添加到饲料后，能够显著增强鱼类的免疫应答水平，从而增强鱼体抗病能力，如大黄、黄连、杜仲叶粉和当归等（简纪常和吴灶和2002）。番石榴叶的水提浸膏对对虾白斑综合症病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）具有强烈的杀灭作用（郭志勋等2011）；而艾草、忍冬和牛繁缕提取液可以抑制IHNV和VHSV在宿主细胞内增殖（Tongetal.1990）。另外，有研究表明银黄、板蓝根和炎琥宁浓度分别在15.6、31.3和6.3mg/L时具有显著抑制锦鲤疱疹病毒（KoiHerpesvirus，KHV）作用（李俊超等2014）。而从远志甲醇浸膏中分离得到的两种活性化合物1,5-脱水葡萄糖醇和3,4,5-三甲氧基肉桂酸可以提高宿主细胞免疫基因的表达，在一定程度对抑制草鱼呼肠孤病毒（GrassCarpReovirus，GCRV）在CIK细胞内的增殖（Yuetal.2014b）。另外，从绿茶粗提物中提取的表没食子儿茶素没食子酸酯同样能够阻止GCRV病毒粒子吸附于宿主细胞表面，发挥药物抗病毒作用（Wangetal.2016）。1.3.2抗病毒药物作用机制研究1.3.2.1病毒入侵和脱壳由于病毒与宿主细胞表面受体的相互作用具有高度特异性，因此病毒繁殖周期的第一步是一个非常有意义的靶点。人们对于病毒入侵抑制剂的研究来源于单克隆抗体实验，单克隆抗体可以抑制病毒黏附和入侵培养的细胞，对被动免疫动物起到很好的保护作用，而这个结果表明有效的入侵抑制剂可以被用作抗病毒药物。这些化合物能够干扰病毒-宿主之间的相互作用，并且不对细胞受体的正常功能产生影响。例如一种从大黄和何首乌中提取的蒽醌化合物，能够明显阻断SARS-CoV）刺突蛋白（S蛋白）和受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的相互作用，从而抑制病毒感染（Hoetal.2007）。1.3.2.2抑制病毒的穿入和脱壳参见1.4.1.1（化学合成药）金刚烷胺抗流感病毒作用。1.3.2.3蛋白酶病毒蛋白酶通常切割蛋白前体从而产生功能单位或在病毒颗粒包装过程中释放结构成分，例如所有疱疹病毒均编码一种丝氨酸蛋白酶，这种酶在病毒核衣壳形成过程中是必不可少的（徐萍2000）。因此，这种丝氨酸蛋白酶的一些特殊折叠结构和催化位点就能作为药物靶点，被研究人员用来设计、合成全新的特异性抗病毒化合物。此外，完11 整的HIV的DNA在宿主细胞中被翻译成前体蛋白，然后病毒蛋白酶特异性地裂解前体蛋白，最终形成具有感染性的病毒。在HIV前体蛋白中存在分解位点，只能被HIV和与其密切相关病毒蛋白酶所识别，而沙奎那韦是一种与分解位点结构相似的类肽，其可与病毒蛋白酶的活性部位结合，抑制蛋白酶的活性，发挥抗HIV作用（Kimetal.1998）。1.3.2.4病毒复制酶病毒的复制酶作为抗病毒药物的一个主要靶点被广泛研究。通过遗传学分析，人们知道DNA聚合酶的辅助蛋白对于病毒复制是必需的，而RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶是病毒特有的，到目前为止动物细胞中尚无类似的细胞成分能够在动物细胞中复制长的RNA模板，因此，这些聚合酶及其不同的病毒特异性活性（如引物合成、抓帽和病毒基因组RNA二级结构）都成为抗病毒药物的良好靶点。现存的抗病毒药物阿昔洛韦和利巴韦林就分别作用于病毒DNA聚合酶和RNA聚合酶（Barnesetal.2002；Bergmannetal.2017）。1.3.2.5调控蛋白病毒复制周期的控制经常需要特殊的调控蛋白。许多调控蛋白对于病毒的复制是必需的，因此成为抗病毒药物筛选的一类重要靶点。例如福米韦生是一种磷硫酰化反义寡核苷酸，被用来治疗Cytomegalovirus引起视网膜炎，该化合物就具有抑制病毒调控蛋白的功能（边琪等2002）。1.3.2.6调控RNA分子宿主和病毒的基因组都编码小RNA（miRNA），这些miRNA能控制大量基因的表达。有研究表明，一种在肝脏中表达的小RNA，miR-122，即可以调控400余种参与代谢通路的基因的表达。而当miR-122被抑制后，其能够保护肝脏细胞免受HCV感染（Lanfordetal.2010）。因此，小RNA在今后可被作为抗病毒化合物的一个新靶点。1.4香豆素类化合物简介香豆素类化合物是一类具有苯并α-吡喃酮内酯环结构天然有机化合物的总称，其中一部分有香甜气味，常以单体或糖苷的形式存在于自然界中，许多高等植物如芸香科、伞形科、菊科、豆科等都含有该类化合物。植物的根、茎、叶、皮以及果实等各部位，以及如蛇床子、补骨脂、前胡及秦皮等许多中草药中均含有香豆素类化合物。由于该类化合物相对分子质量较小，易于化学合成，且生物利用度较高，近些年已成为国内外药物开发研究的热点（佐建锋等2003）。X-单晶衍射分析发现绝大多数的活性香豆素都具有刚性稠环结构，母环结构的C-7位上均有含氧取代基的存在。因此，香豆素（coumarin）和7-羟基香豆素（7-hydroxycoumarin）都可作为香豆素类化合物的母体结构（图1-3）。12 图1-3香豆素与7-羟基香豆素结构Figure1-3Structureofcoumarinand7-hydroxycoumarin1.4.1香豆素类化合物的分类目前对香豆素类化合物的分类主要有两种方法：一是根据母环结构中含氧取代基的数量和位置进行分类；二是按生源途径所形成的基本骨架进行分类。其中后一种分类常将香豆素类化合物分为简单香豆素（图1-4，1、2、3）、呋喃香豆素（图1-4，4、5、6、7）、吡喃香豆素（图1-3，8、9、10、11）和其他香豆素（图1-4，12、13、14）（徐任生2004；孔令义2008）。图1-4一些天然香豆素类化合物（肖川2012）Figure1-4Somenaturalcoumarincompounds1.4.1.1简单香豆素简单香豆素是指仅在香豆素母核苯环上有取代基的一类香豆素，取代基常为羟基、甲氧基、亚甲二氧机和异戊烯基等，其中7-C上总为含氧取代，6位和8位电负性较高，易于烷基化，所以接异戊烯基较多。常见的简单香豆素有当归内酯、瑞香内酯以及七叶内酯等。1.4.1.2呋喃香豆素呋喃香豆素是指在7-羟基香豆素的C-6或者C-8位有异戊烯基时，与C-7位的酚羟基缩合形成呋喃环结构，成环后有时会因为降解而少3个碳原子。根据呋喃环的位置又可将呋喃香豆素分为线型（linear）和角型（angular）两类。常见的呋喃香豆素有补骨脂13 素（线型）、花椒毒粉（线型）、茴芹内酯（角型）和异香柑内酯（角型）等。1.4.1.3吡喃香豆素吡喃香豆素指的是香豆素母核的C-7位酚羟基与C-6或C-8位的异戊烯基缩合形成2,2-二甲基-α-吡喃环结构的一系列化合物及双吡喃香豆素。根据吡喃环的位置也可以分为线型和角型两类，即6,7-吡喃骈香豆素和7,8-吡喃并香豆素。另外，也存在少数在C-5,6位形成的吡喃环或同时在C-5,6位、C-7,8位存在的两个吡喃环。常见的吡喃香豆素有鲁望菊内酯（线型）、花椒内酯（线型）、5-羟基邪蒿内酯（角型）和邪蒿内酯（角型）等。1.4.1.4其他香豆素其他香豆素是指香豆素母环的C-3或C-4位有取代基（如苯基、羟基和异戊烯基等）的一类香豆素（章维华2010）。常见的其他香豆素有胀果香豆素A、海棠果内酯、拟雌内酯和异甘草香豆素。1.4.2香豆素类化合物的生物活性由于化学结构中包含π-π共轭体系，香豆素类化合物能够通过多种非共价作用方式与生物体内的不同活性位点结合，从而使其具有非常广泛的生物学活性，如抗肿瘤（Salemetal.2016）、抗菌（Dastanetal.2016;Gafneretal.2011）、抗病毒（BatistićandStojanovski2012）、抗氧化（Rehakovaetal.2014）、抗癌（Dandriyaletal.2016；Nasretal.2014）等。1.4.2.1抗肿瘤作用天然香豆素因具有对肿瘤细胞高特异选择性且对正常细胞低毒性的特点，被研究人员认为是新型抗肿瘤药物研究的重要方向。Prasad等（2010）从Clausenalansium(Lour.)Skeels中分离得到一种补骨脂素衍生物，其对人宫颈癌细胞具有良好的抑制作用，在药物浓度仅为0.01μg/mL时对癌细胞的生长抑制率达到50%，而治疗人宫颈癌对照药物顺铂的IC50则高达349.9μg/mL。而从CicutavirosaL.的地上部分分离得到的香豆素类化合物对K562和K562/A02白血病细胞表现出极佳的细胞毒性作用，与阳性对照药物阿霉素相比（IC50=0.4/22.4μM），该化合物对两种白血病细胞的IC50值分别为0.39/3.09μM（Wangetal.2011）。目前，以天然香豆素为先导化合物为基础，对其化学结构进行再修饰以提高抗肿瘤活性具有重要的意义。Carta等（2012）使用Lawesson试剂反应得到多种2-硫代香豆素衍生物15~19，发现此类衍生物能够显著抑制肿瘤细胞中碳酸酐酶亚型IX（CAIX）和XII（CAXII），因此可称为靶向CA的抗肿瘤候选药物。Yang等（2011）则以3-苯基香豆素为母体，合成得到一系列羟基、甲氧基和乙酰氧基等取代基的衍生物，并发现这些新化合物对HL-60和A549细胞的生长具有明显的抑制活性，其中甲氧基取代衍生物20的活性最佳，IC50分别为5.2和7.5μM。而在香豆素C-3位引入4,5-二氢吡唑类基团合14 成得到的化合物21、22对胃癌细胞端粒转移酶的IC50分别为2.0mg/L和1.8mg/L，抑癌活性显著高于阳性对照药品Ethidium（Liuetal.2010）。另有一些研究证实香豆素可作为潜在的抗乳腺癌药物，这是因为香豆素参与形成的香豆素雌激素聚合物具有选择性调控雌激素受体的作用，抑制乳腺癌肿瘤细胞增殖（Jiménez-Orozcoetal.2011；Kusumaetal.2011；Scottetal.2011）。图1-5香豆素15~24化学结构（李林虎等2013）Figure1-5Thestructureofcoumarin15~24除此之外，研究发现一些香豆素类化合物同样可诱导多种肿瘤细胞发生细胞凋亡。例如Kempen等（2003；2008）研究发现香豆素-3-羧酸芳酯衍生物23、24在体外可有效阻止肿瘤侵袭并在体内诱导肿瘤细胞凋亡。通过改造3-羧酸酯，试验结果表明3-羧酸芳酯对药物抗肿瘤活性至关重要。从Murrayasiamensis中分离得到的具有α-亚甲基-γ-内酯环结构的香豆素类化合物对HL-60型白血病细胞表现出显著的毒性作用，并通过激活细胞中的Caspase-9和Caspase-3的催化活性致使细胞凋亡从而达到杀灭癌细胞的作用（Murataetal.2008）。1.4.2.2抗菌作用香豆素自身抗菌活性较低，如果在母环上引入某些取代基后，新化合物的抗菌活性将显著增强。如含有长链取代基的简单香豆素欧前胡素和阿莫树脂醇对巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）、藤黄微球菌（Micrococcusluteus）、溶壁微球菌（Micrococcuslysodeik）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的抗菌活性明显增强（罗礼阳等2017）。Maračić等（2015）发现，在一些简单香豆素的母环结构上引入含三氮唑的支链取代基后，化合物展现出良好的抗卡他莫拉菌（Moraxellacatarrhalis）活性，最小抑菌浓度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）≤0.25mg/L，其抗菌作用优于阿奇霉素。另外，从Prangospabularia分离出的三种呋喃香豆素氧化前胡素、欧前胡素和蛇床子素对S.aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、大肠杆菌（Escherichiacoli）和铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）均表现出一定抗菌活性（Tadaetal.2002）。由链霉菌产生的香豆酶素是抗生素类药物，其同样属于香豆素类化合物，Periers等（2000）15 对其抗菌作用机制及构效关系作了深入研究，结果显示该抗生素与细菌回旋酶具有高度亲和力，通过与ATP竞争结合到DNA回旋酶抑制该酶的催化功能，从而阻碍细菌DNA的复制。图1-66,7-dimethoxycoumarin、6-methoxy-7-hydroxycoumarin和5’-oxoaurapten的化学结构Figure1-6Thestructureof6,7-dimethoxycoumarin,6-methoxy-7-hydroxycoumarinand5’-oxoaurapten除了对细菌作用外，香豆素类化合物对真菌亦具有很好的抗菌活性。通过抗菌活性测试，Bousetla等（2011）发现含伞形科植物Buniumincrassatum中的两个香豆素类化合物6,7-二甲氧基香豆素和6-甲氧基-7-羟基香豆素的植物浸膏对真菌表现出比细菌更强的抑制活性。而Kurdelas等（2010）从传统中药材Baccharisdarwinii中分离到3种香豆素类化合物（图1-6），通过抗菌活性测试发现，5’-oxoaurapten对红色毛癣菌（Trichophytonrubrum）、石膏样小孢霉菌（Microsporumgypseum）和须毛癣菌（Trichophytonmentagrophytes）等真菌表现出了较高杀菌活性。当药物浓度达到15.6mg/L时，5’-oxoaurapten对3种病原菌均表现出显著的生长抑制作用；当浓度达到125.0mg/L时，5’-oxoaurapten可以完全抑制3种霉菌的生长。此外，Radulović等（2011）研究证实，4-（萘胺基）-3-硝基香豆素对黑曲霉菌（Aspergillusniger）和白色念珠菌（Candidaalbicans）都显示出良好的抑制活性。而中草药蛇床子（Cnidiummonnieri）中的主要成分蛇床子素被证实对病原性真菌具有广谱抗菌功能，如玉米小斑病菌（Helminthosporiummaydis）、大白菜软腐病菌（Erwinia）、梨轮纹病菌（Physalosporapiricola）、辣椒炭疽病菌（Vermiculariacapsici）以及红色毛癣菌（Trichophytonrubrum）等（黄昌华等2005；兰树敏等2010；迮福惠等2005）。1.4.2.3抗病毒作用早在1992年，Kashman等（1992）从胡桐属植物Calophyllumlanigerum分离的香豆素类化合物calanolides可抑制HIV逆转录酶活性，有效保护T细胞不受到病毒攻击，并具有一定的耐药性。随后，研究人员又从同属的其他植物C.cerasiferumVesque、C.inophyllumLinn和C.teysmanniivar.中发现对HIV病毒具有同样抑制作用的两种香豆素类化合物Costatolide和inophyllumP，其中Costatolide与calanolideA互为同分异构体（Spinoetal.1999）。其中，体外试验结果表明，calanolideA抗HIV病毒的EC50值为0.11μM，治疗指数为818。因此，calanolides及其衍生物的合成是目前抗HIV药物研究的热点之一（Patiletal.1993）。Ma等（2008）利用溴原子吡喃环侧链上末端C上的一个氢原子替换，对calanolideA进行化学修饰，得到衍生物25。体外的抗HIV活性结果显示，该药物抗病毒活性要16 强于calanolideA，其EC50为2.9nM。药物构效关系则说明在香豆素母环C-10位置上进行适当的化学修饰可在一定程度上提高化合物的抗HIV活性。而Xue等（2010）紧接着对衍生物25做了进一步的化学修饰，用氯原子将25中的溴原子进行替代，合成得到衍生物26，该化合物同样对HIV有着较高的抑制作用，EC50为7.4nM）。与此同时，在对小鼠进行口服给药过程中则发现衍生物26具有较高的利用率以及较低的生物毒性，因此，该药物具有一定的应用价值。此外，从植物Lomatiumsuksdorfii和Angelicamorii中分离得到的一类7,8-吡喃香豆素类化合物同样被发现能够显著抑制HIV在宿主细胞内的增殖复制（Yangetal.1998）。图1-7化合物calanolideA、25和26的化学结构Figure1-7ThestructureofcalanolideA,25and26除此之外，Lee等（2009）从药用植物Ferulaassa-foetidaL.的根中分离得到一个香豆素类化合物27，研究发现该化合物对H1N1病毒具有良好的抑制作用，其抗病毒IC50和IC90值分别为0.26和0.44mg/L，低于传统抗流感对照药物金刚烷胺（IC50=0.92mg/L）。而一些研究发现，苯并咪唑类化合物可抑制HCV中NS5BRNA聚合酶活力，从而使该类化合物具有抗病毒作用。Hwu等（2008）以亚甲基硫基为桥连基团合成了一系列香豆素-苯并咪唑类化合物，并研究其抗病毒活性，结果发现：其中的两个香豆素类化合物28与29具有抗HCV功能，药物的EC50值分别为3.4和4.1μM。其中，化合物29在浓度达到5.0μM时，对HCV增殖的抑制率超过90%。在上述研究的基础上，Neyts等（2009）通过化学手段将苯并咪唑环上的两个碳原子用氮原子进行取代，改造得到的两个化合物30和31对HCV的抑制能力相比于28和29提高了29倍。图1-8化合物27~31的化学结构Figure1-8Thestructureof27~311.4.2.4抗氧化活性在诸多种类的香豆素类化合物中，含羟基的香豆素有着优良的抗氧化能力，一直受到人们的关注。例如，瑞香素是中草药祖师麻（Daphnegiraldii）中的一种主要成分，具有增加冠脉流量、扩张末梢血管、降压、抗缺氧等作用（李书慧等2002）。倪奕昌等（1999）研究发现瑞香素对红细胞膜脂质过氧化物的生成具有显著的抑制作用。Dangles等（2010）合成的3-羟基瑞香素同样具有良好的抗氧化能力，能够清除细胞内多余的氧化自由基；17 而Raj等（1998）合成的两个瑞香素类似物4-甲基-7,8-二羟基香豆素和4-甲基-7,8-二乙酰基香豆素在NADPH依赖性的肝微粒体脂质过氧化过程中同样表现出良好的抗氧化作用。Tyagi等（2005）则通过合成引入氨基、乙酰氨基取代基的4-甲基香豆素，发现羟基与氨基相邻的化合物对脂质过氧化具有的抑制作用强于维生素E，这个结果也表明了邻位羟基、氨基具有提高抗氧化与清除自由基的能力。另外，从何首乌（Polygonumamplexicaule）、茯苓（Melicopeglabra）以及川牛膝（Cyathulaofficinalis）中均提取发现一系列香豆素类化合物在清除DPPH自由基测试中，表现出较高的抗氧化活性（韩兴梅和洪敏1999；Panetal.2004；Tantryetal.2012）。1.4.2.5其他生物活性除了以上各种生物活性外，香豆素类化合物还具有抗寄生虫（Arangoetal.2010；Songetal.2015；Wangetal.2008）、消炎止痛（Bedoyaetal.2005；DeClercq2004；Yuetal.2003）、抗心律失常（张志祖等1994）、降血压以及抗辐射等活性（吴冬梅等1997）。而从Prangospabulari分离出的一些香豆素类化合物被发现能抑制IL-2/IL-4/IL-1β和TNF-α的释放，从而调节生物体免疫功能。胡萝卜、芹菜、茴香等一些伞形科植物中含有的香豆素类化合物同样具有一定免疫调节活性，可以通过增加CD8、T细胞和活化的外周血单核细胞的数量促进淋巴细胞的增殖（Cherngetal.2008）。1.5本研究的目的和意义根据农业部统计资料，我国鲤鱼养殖产量占淡水产量的20%以上，鲤科鱼类养殖量占淡水养殖量的50%以上。SVC是对鲤科鱼类危害最大的传染病之一，且尚无有效的治疗方法。现在很关键的问题是SVC在国外流行时死亡率很高，而在我国目前还没有发生大规模爆发。初步的研究显示是病毒和我国的鲤鱼品系之间尚未完全适应。根据近几年的监测数据，SVCV可能正在发生变异，越来越适应中国的养殖品种，使其成为SVC易感种。因此，当前需要采取有力的措施，加强SVC的防控，尽快研究出有效的治疗药物或疫苗，以应对将来可能出现的疫情大暴发。香豆素类化合物作为天然产物活性化合物中的重要组成部分，已经被证实具有广泛的生理及药理活性，同时药物安全性较高，值得被开发利用。因此，以香豆素作为先导物进行相关药物研发一直都是人们关注的热点。目前，关于香豆素的研究主要集中在人用活性药物的筛选、药理活性评价、作用靶标研究、作用机理研究、结构修饰和构效关系研究等方面，在兽、禽及水产用药方面的研究极少。本研究以SVCV和EPC细胞为研究对象，体外筛选新合成的多种香豆素类化合物，通过前期研究对各香豆素进行抗病毒活性评价，得到两种有效地抗SVCV的药物。在此基础上，探索化合物对病毒和宿主之间的作用机理，为开发新型香豆素类水产用原料药提供一定的理论依据。18 第二章香豆素类化合物离体抗SVCV活性研究自1971年SVCV被分离、鉴定以来（Fijan1972），研究人员一直在努力寻找防控SVC的有效治疗手段。然而，到目前为止，尚没有任何防治措施可有效地控制SVCV的感染。一般情况下，疫苗作为一种传统手段被用来预防和控制病毒性疾病（Cuietal.2015；EmmeneggerandKurath2008；Kanellosetal.2007；Liuetal.2012；Zhuetal.2015），但是目前水产疫苗的使用受到两方面的限制：一是保证鱼体在感染病毒前体内能够产生强烈的免疫反应；二是其不能用于治疗已受病毒感染的病鱼（Gotesmanetal.2015）。另外，在水产养殖中疫苗的使用也存在很多局限，一方面是缺乏有效的载体能够高效、快速地将疫苗送入鱼体产生抗体；另一方面，疫苗自身的生产、实验成本也限制了其在养殖中大规模使用（Ashrafetal.2016；Life2008）。因此，水产养殖业中病害的防治需要依靠药物来进行。然而现阶段在水产养殖中所使用的药物多为农药、人用药或兽用药，对于水产专用药物尤其是抗病毒药物尤为缺乏，并且在药物开发过程也存在着一系列问题。所以，筛选高效的抗病毒鱼类专用药物对于SVCV的防治具有极其重要的意义。随着抗病毒药物研究的深入，合适的生物-靶标筛选模型在药物筛选过程中开始发挥至关重要的作用。当前，根据选用材料和作用对象的不同，药物筛选模型主要分3种：整体动物筛选模型、组织器官离体筛选模型以及细胞分子水平筛选模型（胡娟娟和杜冠华2001）。随着细胞生物学的快速发展，目前已有多个细胞系代替动物个体被用于体外抗病毒药物筛选，与前两种筛选模型相比，细胞筛选模型具有药物作用机制明确、用量少、可大规模筛选等特点（Horrocksetal.2003）。作为一种更接近生理状态的药物筛选模型，细胞分子水平筛选模型将细胞模型与待选药物相互作用，利用ELISA、荧光显色技术及核磁共振等生物化学手段检测药物的抗病毒能力，并通过细胞生长状态、病毒分子数量和病毒侵染力等测定指标对药物进行快速筛选（张惠君等2006；Sklaretal.2007；Walleretal.2003）。本章研究以49种新合成的香豆素类化合物作为研究对象，利用EPC细胞模型对药物的体外抗SVCV活性进行初步筛选，借助qRT-PCR技术检测病毒核酸量在细胞内的变化，直接反应药物的抗病毒效果，并借助浓度梯度实验对其中具有较好抗病毒活性的化合物进行复筛，从而确定每种活性化合物的半数有效抗病毒浓度。与此同时，通过细胞活力检测和病毒滴度实验分别开展药物对细胞的安全性和病毒侵染性的研究，为后续药物抗病毒机制研究提供基础依据。2.1材料与方法2.1.1细胞和病毒EPC细胞由中国水产科学院长江水产研究所曾令兵研究员惠赠；SVCV（0504型）由大连海洋大学李强教授惠赠。19 2.1.2香豆素类化合物3种香豆素类过渡中间体和46种香豆素类化合物均由本实验室合成及鉴定（刘广路2016）。称量适当质量的待测化合物，加入一定体积的二甲基亚砜（DMSO）超声溶解10min，配成浓度为50mg/mL的待测母液，置于-20℃冰箱中保存、备用。简要的合成路线图见图2-1，详细的化合物名称及化学结构式见表2-1。ABC图2-1香豆素类化合物合成路线图。（A）7-羟基香豆素；（B）4-甲基-7-羟基香豆素；（C）4-羟基香豆素。Figure2-1Syntheticrouteofcoumarins.(A)7-hydroxycoumarin;(B)4-methyl-7-hydroxycoumarin;(C)4-hydroxycoumarin.表2-1香豆素类化合物编号及结构式Table2-1Thenumberandconstitutionalformulaofcoumarincompounds化合物名称结构式CompoundsConstitutionalFormulaX7-羟基香豆素C10H8O3A7-（2-溴乙氧基）香豆素C11H9BrO3B7-（3-溴丙氧基）香豆素C12H11BrO3C7-（4-溴丁氧基）香豆素C13H13BrO320 D7-（6-溴己氧基）香豆素C15H17BrO3E7-（8-溴辛氧基）香豆素C17H21BrO3F7-（10-溴葵氧基）香豆素C19H25BrO3G4-羟基香豆素C9H603H4-甲基-7-羟基香豆素C11H10O3A17-[2-（咪唑）乙氧基]香豆素C14H12N2O3A27-[2-（苯并咪唑）乙氧基]香豆素C18H14N2O3A37-[2-（甲基咪唑）乙氧基]香豆素C15H14N2O3A47-[2-（苯基咪唑）乙氧基]香豆素C20H16N2O3NO2NA57-[2-（4-硝基咪唑）乙氧基]香豆素NC14H11N3O5OOOA67-[2-（4-甲基咪唑）乙氧基]香豆素C15H14N2O3B17-[3-（咪唑）丙氧基]香豆素C15H14N2O3B27-[3-（2-甲基咪唑）丙氧基]香豆素C16H16N2O3B37-[3-（4-硝基咪唑）丙氧基]香豆素C15H13N3O5B47-[3-（苯并咪唑）丙氧基]香豆素C19H16N2O321 B57-[3-（4-甲基咪唑）丙氧基]香豆素C16H16N2O3C17-[4-（咪唑）丁氧基]香豆素C16H16N2O3C27-[4-（4-甲基咪唑）丁氧基]香豆素C17H18N2O3C37-[4-（4-硝基咪唑）丁氧基]香豆素C16H15N3O5C47-[4-（苯并咪唑）丁氧基]香豆素C20H18N2O3C57-[4-（2-甲基咪唑）丁氧基]香豆素C17H18N2O3D17-[6-（咪唑）己氧基]香豆素C18H20N2O3D27-[6-（4-甲基咪唑）己氧基]香豆素C19H22N2O3D37-[6-（4-硝基咪唑）己氧基]香豆素C18H19N3O5D47-[6-（苯并咪唑）己氧基]香豆素C22H22N2O3D57-[6-（2-甲基咪唑）己氧基]香豆素C19H22N2O3E17-[8-（苯基咪唑）辛氧基]香豆素C26H28N2O3E27-[8-（咪唑）辛氧基]香豆素C20H24N2O3E37-[8-（2-甲基咪唑）辛氧基]香豆素C21H26N2O3E47-[8-（4-甲基咪唑）辛氧基]香豆素C21H26N2O322 E57-[8-（苯并咪唑）辛氧基]香豆素C24H26N2O3F17-[10-（咪唑）葵氧基]香豆素C22H28N2O3F27-[10-（2-甲基咪唑）葵氧基]香豆素C23H30N2O3F37-[10-（4-甲基咪唑）葵氧基]香豆素C23H30N2O3G14,4,4-三氟甲基-7-羟基香豆素C10H5F3O3G26-氟-4-羟基香豆素C9H5FO3G36-甲基-4-羟基香豆素C10H8O3G46-溴-4-羟基香豆素C9H5BrO3G56-氯-4-羟基香豆素C9H5ClO3G66-硝基-4-羟基香豆素C9H5NO5H14-甲基-7-(6-溴己氧基)香豆素C16H19BrO3H24-甲基-7-[6-（4-甲基咪唑）己氧基]香豆素C20H24N2O3H34-甲基-7-[6-（苯并咪唑）己氧基]香豆素C23H24N2O3H44-甲基-7-[6-（2-甲基咪唑）己氧基]香豆素C20H24N2O323 H54-甲基-7-[6-（咪唑）己氧基]香豆素C19H22N2O32.1.3试剂和仪器本章所用试剂和仪器信息详见附录。2.1.4细胞培养、病毒增殖及滴度检测从-80℃冰箱中取出冻存的EPC细胞，用含10%FBS的M199细胞培养基（内部含有浓度单位为100IU/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素）进行细胞复苏。待细胞生长稳定后，进行传代培养，细胞培养箱温度维持在25±0.5℃，CO2浓度为5%。根据细胞生长密度及状态，每2~3天传代一次。具体细胞培养及传代步骤同杨毅（2014）。从液氮中取出冻存的SVCV病毒悬液，37℃水浴快速溶解复苏。用无血清的M199培养基漂洗细胞培养瓶内密度为80%~90%的EPC细胞，按体积比为1%接种病毒悬液，25℃感染2h，在此期间培养瓶需要摇晃3~5次。病毒感染结束后应及时回收病毒液，并向培养瓶中加入细胞维持液（含5%FBSM199细胞培养基），继续培养一段时间。在48~96h后，利用倒置显微镜观察EPC细胞感染病毒的情况，待80%以上细胞出现CPE现象时，收取培养瓶中的病毒，分装于2mL冻存管内，液氮中保存、备用。向96孔细胞培养板中加入密度为1×104/孔的EPC细胞100μL，25℃培养16~24h。待细胞生长至80%~90%时，向其中接种稀释度为101~1010的病毒液100μL/孔，每个稀释度设置8个平行孔，25℃培养箱中培养2h。孵育结束后，将病毒液回收，用M199培养基漂洗孔内细胞2次，添加100μL细胞维持液继续培养96h。实验设置3组平行，每隔24h观察记录各稀释度单层细胞的CPE现象，并记录相应病变孔数，按照Reed-Muench法计算SVCV的半数组织细胞感染量（tissuecultureinfectivedose，TCID50）（ReedandMuench1938）。2.1.5香豆素毒性检测台盼蓝（TrypanBlue）是一种细胞活性染料，可用来反应细胞膜的完整性，因此常被用来检测细胞存活状态。活细胞不能被台盼蓝染成蓝色，而死细胞能够被染成淡蓝色。本实验采用台盼蓝染色法检测各香豆素类化合物对EPC细胞的毒性，具体操作步骤如下：（1）用含5%FBS的M199培养基梯度稀释母液浓度为50mg/mL各香豆素类化合物至50、25、12.5、6.25、3.13以及1.06mg/L；（2）称取0.4g台盼蓝，加入少量双蒸水研磨，然后定容至10mL，滤纸过滤后4℃保存备用，使用时用0.1MPBS稀释至0.4%；（3）向24孔细胞培养板中加入密度为5×104/孔的EPC细胞800μL，25℃培养一定时间，待细胞生长至单层时，吸出培养基，M199培养基漂洗2~3次，加入上述新鲜24 配置的含香豆素的细胞维持液，于25℃培养箱中继续培养48h；（4）用浓度为0.25%、含EDTA的胰蛋白酶消化24孔板中细胞，0.1MPBS漂洗2~3次，制备成单细胞悬液，并作适当稀释，细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合均匀；（5）室温染色3~5min，取一定体积细胞悬液置于载玻片上，加盖玻片后用高倍镜观察，计数200个细胞中活细胞、死细胞的数目，按公式计算得到细胞存活率（细胞存活率/%=未染色活细胞数/染色死细胞数×100）。2.1.6香豆素抗SVCV活性初筛检测2.1.6.1细胞样品的采集依据2.1.5（香豆素毒性检测）的药物细胞毒性检测结果，我们将49种香豆素类化合物分为3个初筛组，活性检测浓度分别设定为1、10和25mg/L（细胞在该药物浓度下死亡率均低于10%）。实验过程示意图见图2-2，具体操作步骤如下：（1）将密度为1×105/孔的EPC细胞接种于12孔细胞培养板中，25℃培养16~24h，待细胞生长至单层时，吸出培养基，M199培养基漂洗2~3次后，加入SVCV稀释液3TCID（1×1050，M199培养基稀释），25℃孵育2h；（2）首先用细胞维持液将母液浓度为50mg/mL的各香豆素类化合物分别稀释至1、10和25mg/L。其次，在SVCV孵育2h后，回收病毒液，M199培养基漂洗2~3次，加入新鲜配置的含香豆素培养基或细胞维持液（对照组，含0.02、0.2或0.5‰DMSO），25℃继续培养48h；（3）香豆素暴露48h后，将药液吸出，0.1MPBS洗涤EPC细胞2~3次，用含EDTA、浓度为0.25%的胰蛋白酶消化细胞，然后1000rpm、5min离心收集细胞样品，弃去上清后向收集的样品内加入TRIzol试剂，准备提取各样品总RNA。图2-2香豆素类化合物抗SVCV活性初筛流程图Figure2-2TheantiviralscreeningworkflowofcoumarinsagainstSVCV2.1.6.2总RNA的提取（1）将含EPC细胞的TRIzol液转移至1.5mL无菌无酶的EP管中，用无菌枪头反复吹打直至管底无沉淀；（2）每1mLTRIzol加入200μL三氯甲烷，涡旋剧烈振荡15s使溶液充分乳化，室温静止2~3min，12000g、4℃离心15min；（3）小心吸取上层水相500~600μL转移至新的无菌无酶EP管中，加入等体积的25 异丙醇，上下颠倒离心管使液体充分混匀，室温静置10min，12000g、4℃离心10min；（4）吸弃（3）中的上清液，沿管壁缓慢加入1mL75%乙醇，上下颠倒离心管以洗涤RNA沉淀，7500g、4℃离心5min后再次吸弃上清；（5）室温干燥RNA沉淀8~10min后，加入15~20μL无RNA酶的ddH2O溶解RNA。利用核酸浓度测定仪检测RNA纯度及浓度后，RNA样品放置于-80℃冰箱保存、备用。2.1.6.3细胞内SVCV含量检测使用VazymeHiScriptQSelectRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）反转录试剂盒对各样品总RNA进行反转录PCR，详细反应体系见表2-2。表2-2反转录PCR反应体系Table2-2ThereactionsystemofReverseTranscriptionPCR(RT-PCR)试剂名称体积ReagentsVolumeRNasefreeddH2Oto8μL4×gDNAwiperMix0.5μLOligo(dT)18(10μM)0.5μL模板RNA1pg~500ng将上述样品轻轻吹打混匀后，42℃反应2min。在第1步的反应管中直接加入5×SelectqRTSuperMixⅡ2μL，使用移液器轻轻吹打混匀。50℃反应15min，85℃反应2min。以β-actin为内参、反转录产物为模板，利用qRT-PCR检测各化合物抗病毒活性，比较SVCV在不同药物处理后的G蛋白表达情况。SVCV各结构蛋白基因和EPC细胞内参基因引物序列如表2-3所示（Gotesmanetal.2015；Lietal.2016；Miestetal.2014；Yangetal.2014），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表2-3引物序列Table2-3Sequencesofprimerpairs基因名称引物序列（5'-3'）GenesPrimersequences(from5'to3')β-actinForwardGCTATGTGGCTCTTGACTTCGAReverseCCGTCAGGCAGCTCATAGCTSVCVglycoprotein(G)ForwardGCTACATCGCATTCCTTTTGCReverseGCTGAATTACAGGTTGCCATGATSVCVnucleoprotein(N)ForwardAACAGCGCGTCTTACATGCReverseCTAAGGCGTAAGCCATCAGCSVCVphosphoprotein(P)ForwardTGAGGAGGAATGGGAATCAGReverseAGCTGACTGTCGGGAGATGTSVCVmatrixprotein(M)ForwardTACTCCTCCCACTTACGAReverseCAAGAGTCCGAGAAGGTC反转录PCR合成的cDNA模板用VazymeAceQ®qPCRSYBR®GreenMasterMix试26 剂盒进行qRT-PCR扩增，条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火1min，循环40次；熔解曲线分析，65℃至95℃，每步5s。仪器为Bio-RadCFX96Real-TimePCRDetectionSystem。总体积为15μL的反应体系如表2-4所示，利用2-△△Ct法分析实时定量数据。表2-4实时定量PCR反应体系Table2-4ThereactionsystemofQuantitativeReal-timePCR(qRT-PCR)试剂名称体积ReagentsVolumeSYBR®GreenMasterMix7.5μLForward/ReversePrimers0.3μL模板cDNA1.5μLddH2O5.4μLTotal15μL2.1.7抗SVCV香豆素活性复筛检测2.1.7.1香豆素对SVCV增殖的作用选择在初筛实验中抗病毒抑制率>50%的香豆素作为进一步的研究对象，设置0.1、0.25、0.63、1.6、4、10和25mg/L作为复筛浓度。抗病毒活性检测方法同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。2.1.7.2香豆素对EPC细胞生长活力的作用将密度为1×104/孔的EPC细胞接种于96孔细胞培养板中，25℃培养一定时间，待细胞生长至75%~90%时，吸出培养基，M199培养基漂洗2~3次，加入不同浓度的抗病毒抑制率>50%的香豆素（0.1~63mg/L），25℃培养48h。每个浓度3个平行孔，设置正常生长的EPC细胞为对照组（含一定体积的DMSO）。采用CCK-8法测定EPC细胞生长活力。CCK-8（碧云天生物技术）染色方法按照说明书进行（详见附录），用酶标仪在450nm波长下检测各孔OD值，根据以下公式计算得到细胞生长活力。细胞生长活力/%=（OD处理组－OD空白组）/（OD对照组－OD空白组）×1002.1.7.3香豆素对SVCV滴度的作用病毒滴度测定实验中细胞接种及病毒感染过程同2.1.4（细胞培养、病毒增殖及滴度检测）。SVCV感染后，回收病毒液，用M199培养基漂洗EPC细胞2次，加入100μL含抗病毒香豆素（25mg/L的B4、C2和10mg/L的C4、D5）的细胞维持液继续培养72h。每隔24h观察记录各稀释度单层细胞的CPE现象，按照Reed-Muench方法计算TCID50。2.1.8香豆素C4、D5在EPC细胞内的药物代谢检测（1）细胞样品处理将一定密度的EPC细胞接种于6孔细胞培养板中，生长16~24h至单层，然后加入新鲜配置的10mg/L香豆素C4、D52mL/孔，分别在香豆素处理细胞后0.5、1、2、4、27 8、12、24、36和48h收集细胞样品。重新称取适量的香豆素C4、D5溶于经0.22μm滤膜过滤的色谱分析级甲醇中，配制成标准品溶液，作为药物细胞代谢测定的对照组。（2）上样前处理上步收集的细胞样品经PBS洗涤后转入无菌的10mL离心管中，加入1mL色谱分析级甲醇，利用电动匀浆机冰上匀浆2~3min，室温静置4h后，12000g离心20min，取上清液转入新的10mL离心管中，置于50℃烘箱中，至离心管前后两个检测时间点质量无差异。将上述已完全干燥的样品加入色谱乙腈：水的体积比为70：30的流动相中，涡旋器上振荡1~2min，并超声溶解10min，使香豆素C4、D5充分溶解。室温静置4h后，通过水系0.22μm的滤膜过滤，4℃放置备用。（3）高效液相色谱测定香豆素含量通过香豆素C4、D5标准品确定药物出峰时间，根据不同浓度的化合物和对应的峰面积得到化合物浓度标曲。高效液相色谱仪采用德国安捷伦（Agilent）公司的1260型高效液相色谱仪。香豆素C4、D5的高效液相色谱检测条件如下所示：色谱柱：岛津C18液相色谱柱；流动相：色谱乙腈：水（V:V=70:30）；流速：1mL/min；检测波长：254nm；进样量：100µL柱温：25℃。2.1.9香豆素C4、D5前、后处理细胞抗SVCV活性检测2.1.9.1药物前处理设置香豆素C4、D50.1、1、10mg/L三个暴露浓度，将这些浓度的药物（由细胞维持液稀释母液得到）加入到已长至单层细胞的12孔板中，25℃培养4h后弃去上清，M199培养基漂洗2~3次。然后加入SVCV病毒液（1000×TCID50），25℃孵育2h后收集病毒上清液，用M199培养基漂洗2~3次，再每孔加入细胞维持液1mL，25℃继续培养48h后收集细胞样品，提取总RNA，反转录PCR得到各样品cDNA模板后，qRT-PCR检测SVCV蛋白表达。2.1.9.2药物后处理将SVCV病毒液（1000×TCID50）加入到已长至单层细胞的12孔板中，25℃孵育2h后回收病毒液，M199培养基漂洗细胞2~3次。再每孔加入细胞维持液1mL，25℃继续培养24h后，弃去维持液，M199培养基漂洗2~3次，加入新鲜配置的一定浓度的香豆素C4、D5，25℃再培养24h后收集细胞样品，提取样品总RNA，反转录PCR得到各样品cDNA模板后，qRT-PCR检测SVCV蛋白表达。28 2.2结果与分析2.2.1香豆素抗SVCV活性初筛检测结果根据细胞毒性实验结果，我们将49种香豆素按初筛浓度1、10和25mg/L分为3组，EPC细胞在此初筛浓度下死亡率均小于10%。各香豆素抗SVCV活性如图2-3所示，25mg/L初筛组共有12种香豆素类化合物（A2、B、B1、B3、B4、C2、C3、C5、D、D1、D2和D3）对SVCV增殖的抑制率大于50%；10mg/L初筛组则有4种药物（C4、D4、D5和G1）抗SVCV抑制率大于50%；1mg/L初筛组抗病毒活性不佳，各药物对SVCV增殖的抑制率均低于50%。在上述16种活性香豆素中，B4、C2、C4以及D5这4种香豆素抗SVCV活性最好，对病毒增殖的抑制率超过90%。图2-349种香豆素类化合物对SVCVG蛋白表达的抑制作用Figure2-3Thepercentinhibitionof49coumarinsontheSVCVofGproteinexpression2.2.2抗SVCV香豆素复筛检测结果进一步的浓度梯度检测结果显示（图2-4），16种活性香豆素的抗SVCV活性随着药物浓度的升高而增强，并伴随对细胞增殖抑制的增加。值得注意的是，10mg/L香豆素B4和4mg/L香豆素C4对SVCV增殖抑制率也超过90%。尽管台盼蓝实验中B4在25mg/L时对EPC细胞无显著毒性作用，但CCK-8检测发现B4在该药物浓度下可以抑制细胞增殖，降低细胞生长率，对细胞活力有较大影响。通过比较图中的两条曲线，除B4外，其余活性香豆素在抗SVCV有效浓度范围内对细胞生长活力无显著影响。利用SPSS软件对上述结果进行分析，我们发现C4抗SVCV半数抑制浓度（Halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）最低，仅为0.5mg/L（表2-2）。29 图2-416种香豆素抗病毒、细胞增殖率浓度梯度曲线Figure2-4Thedose-responsecurvesofatotalof16coumarinsforantiviraleffectandcellproliferation表2-216种活性香豆素的抗病毒半数抑制浓度（±95%置信区间）Table2-2Theinhibitoryconcentrationsathalf-maximalactivity(IC50)of16coumarins(±95%confidenceinterval)化合物IC50valuesCompounds(mg/L)A27-[2-（苯并咪唑）乙氧基]香豆素12.4(10.9~14.3)B7-（3-溴丙氧基）香豆素13.6(9.3~22.7)B17-[3-（咪唑）丙氧基]香豆素6.8(5.5~8.2)B37-[3-（4-硝基咪唑）丙氧基]香豆素11.9(7.8~21.6)30 B47-[3-（苯并咪唑）丙氧基]香豆素2.2(2.0~2.4)C27-[4-（4-甲基咪唑）丁氧基]香豆素3.2(2.8~3.7)C37-[4-（4-硝基咪唑）丁氧基]香豆素21.6(17.0~29.9)C47-[4-（苯并咪唑）丁氧基]香豆素0.5(0.4~0.6)C57-[4-（2-甲基咪唑）丁氧基]香豆素8.8(7.9~10.0)D7-（6-溴己氧基）香豆素12.5(10.8~14.7)D17-[6-（咪唑）己氧基]香豆素15.0(12.3~19.0)D27-[6-（4-甲基咪唑）己氧基]香豆素17.4(12.1~29.4)D37-[6-（4-硝基咪唑）己氧基]香豆素29.5(18.9~64.6)D47-[6-（苯并咪唑）己氧基]香豆素5.3(4.3~6.7)D57-[6-（2-甲基咪唑）己氧基]香豆素1.6(1.2~1.8)G14,4,4-三氟甲基-7-羟基香豆素3.2(2.8~3.8)2.2.3香豆素（B4/C2/C4/D5）对SVCVN、P以及M蛋白表达的作用结果香豆素B4、C2、C4、D5对SVCVN/P/M蛋白表达的抑制作用如图2-5所示，这4种药物对N/P/M蛋白表达的抑制趋势同对G蛋白相类似，各药物的病毒抑制率均超过85%，最高活性浓度能够有效降低SVCV3种蛋白的表达。其中，香豆素D5对SVCVN和M蛋白表达的抑制作用最强，最高抑制率达到98.2%；而香豆素C4对SVCVP蛋白表达的抑制作用最强，最高抑制率达到96.3%。A31 BC图2-5香豆素B4、C2、C4及D5对SVCVN、P和M蛋白表达的抑制作用Figure2-5TheinhibitionofcoumarinsB4,C2,C4andD5ontheexpressionofSVCVN,PandMproteins2.2.4EPC细胞形态学观察结果香豆素B4、C2、C4、D5对感染SVCV的EPC细胞的保护效果如图2-6所示。倒置显微镜观察结果显示正常的EPC细胞呈不规则多边形以及单层密集排列的状态，在被SVCV感染48h后，EPC细胞出现了明显的CPE现象，胞体收缩变圆、边缘折光度增加，数量显著减少，细胞单层呈破渔网状；72h后，细胞开始出现大量死亡，细胞碎32 片增加，明显丧失细胞生长活力。而分别经过4种药物处理后，感染SVCV的EPC细胞在48h内均保持良好的细胞形态。另外，除香豆素B4外，其余3种香豆素均能较好的维持细胞生长活力，与病毒组相比，细胞生长活力分别增加38.4%（C2）、39.2%（C4）及40.0%（D5）。在72h时，各药物处理组的EPC细胞开始出现轻微的CPE现象，其中C2处理组较为明显，其细胞生长活力与48h时相比显著下降31.7%。这说明C2抗SVCV持续时间较短，仅在48h具有较好的抗SVCV活性。33 图2-6香豆素B4、C2、C4及D5对感染SVCV的EPC细胞形态学和细胞活力的作用。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01,*P<0.05。Figure2-6MorphologicaleffectandcellviabilityofcoumarinsB4,C2,C4andD5againstSVCVinEPCcells.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.2.2.5香豆素对病毒滴度的作用结果香豆素B4、C2、C4、D5在活性浓度下处理感染不同稀释度SVCV的EPC细胞均可有效降低病毒滴度（图2-6）。其中，经过B4、C4和D5处理，SVCV病毒滴度在72h检测点降低至105.2（B4）、105.0（C4）及104.7（D5）TCID50/0.1mL。此外，经过C2处理后，SVCV病毒滴度在72h呈急剧上升趋势，药物组与纯病毒组（108.0TCID50/0.1mL）7.0TCID相比，病毒滴度在72h下降幅度较小，仅降至1050/0.1mL，这可能与药物在细胞内的分解、代谢速度以及用药持续时间有关。上述结果说明，相比于香豆素C2，香豆素B4、C4和D5对SVCV增殖的抑制作用持续时间较长，药物抗病毒作用较为稳定。34 图2-7香豆素B4、C2、C4及D5对SVCV病毒滴度的作用。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure2-7TheeffectofcoumarinsB4,C2,C4andD5onSVCVviraltitres.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.2.2.6香豆素C4、D5细胞内代谢检测结果通过高效液相色谱对香豆素C4、D5在EPC细胞内的药物代谢进行测定，结果如图2-8所示。在该液相色谱条件下，C4、D5的出峰时间分别为9.12和11.45min。根据细胞计数统计，对药物在细胞内的浓度进行换算，结果显示这两种香豆素在EPC细胞内具有较高的代谢速率，并且代谢趋势较为接近，均在4h时细胞内药物含量迅速升高达到顶峰，浓度分别为每106个细胞含3.81μgC4和4.01μgD5，并在随后4~8h内维持在3μg以上。随着代谢时间至24h，每106个EPC细胞内依然含0.42μgC4和0.47μgD5。因此，香豆素C4、D5显示出优异的药物代谢特性，可在较短时间内快速进入EPC细胞，并在24h内维持较高的胞内药物浓度。图2-8香豆素C4、D5在EPC细胞内的代谢研究。数据表示为平均值±标准差。Figure2-8ThepharmacokineticstudyofcoumarinsC4andD5inEPCcells.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate.35 2.2.7香豆素C4、D5前、后处理细胞的抗SVCV活性检测结果香豆素C4、D54h处理EPC细胞后SVCV在细胞内的增殖结果如图2-9A所示。实验发现这两种香豆素在最高活性浓度下均对SVCVN、P、M、G4个蛋白的表达无明显作用，说明C4、D5在药物前处理EPC细胞时无抗SVCV功能。与前处理实验结果不同的是，后处理实验显示C4、D5在SVCV感染EPC细胞24h后依然具有较高的抗病毒活性，对SVCV增殖抑制力超过50%（图2-9B）。结合前面的实验结果，我们认为随着药物持续处理时间的延长至48h，香豆素C4、D5的抗SVCV效率将进一步的提高。AB图2-9香豆素C4和D5不同处理对SVCV增殖的作用。（A）药物4h前处理；（B）药物24h后处理。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure2-9TheeffectofcoumarinsC4andD5onSVCVreplication.(A)Pre-treatmentofdrugsfor4h;(B)Post-treatmentofdrugsafter24h.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.2.3讨论2.3.1药物构效关系分析本章以49种香豆素类化合物为研究对象，通过qRT-PCR检测SVCVG蛋白在EPC细胞内的表达情况，在细胞水平筛选出4种香豆素（B4、C2、C4及D5）具有较好的抗36 SVCV活性。细胞形态学检测和药物浓度梯度实验也印证了这4种香豆素对SVCV具有潜在的抗病毒功效。进一步的研究发现利用香豆素C4、D5处理感染SVCV的EPC细胞后能够在72h以内产生高效的细胞活力保护效应，其效果优于另外B4和C2。通过分析药物构效关系，我们发现不同种类的咪唑类化合物的抗SVCV活性要明显优于其他基团（如Br和NH2）的化合物，其中，苯并咪唑和甲基咪唑取代基对化合物抗病毒活性贡献最大。香豆素母环与杂环之间的烷烃取代基长度对各化合物的抗病毒活性有显著影响，它们之间最佳的烷烃取代基为丁基和己基。我们前面的研究同样发现香豆素咪唑类化合物杀虫活性比哌嗪、吡唑、Br以及NH2取代基化合物高（刘广路2016）。表2-3CoMFA模型中香豆素类化合物的实验值、预测值和残差值Table2-3TheactualIC50,pIC50,pIC50,Pred.IC50andresidualsofcoumarincompoundsinCoMFA编号IC50pIC50Pred.IC50Res.编号IC50pIC50Pred.IC50Res.Ab47.4333.7523.960-0.208C5b0.4835.8405.863-0.023A1a28.5663.9533.9430.010Da14.7004.3454.3290.016A2a12.4004.3934.3600.033D1b12.3004.4054.833-0.429A3a23.5044.0604.098-0.038D2a17.4004.2734.2530.020A4a16.5294.3034.2950.008D3a29.5004.0834.091-0.008A6b25.0574.0334.416-0.384D4a5.3004.8354.8220.013Ba13.6004.3184.339-0.021D5a1.4595.3505.373-0.024B1b6.8004.5994.5880.011Ea28.4764.0924.0580.034B3a11.9004.4234.4170.007E1a18.4524.3534.372-0.019B4a2.2005.1635.1530.010E4a2.8175.0993.8711.229Cb38.7473.8833.905-0.022G1a3.2004.8574.8570.000C1b23.4934.0834.155-0.073G2a24.4603.8673.8530.014C2a3.2004.9704.9370.033G4a38.7143.7923.7350.057C3a21.6004.1834.783-0.600G5a37.1093.7233.733-0.011C4a8.8004.5304.5020.028“a”代表抗病毒活性模型中训练集化合物“b”代表抗病毒活性模型中测试集化合物另外，我们从上述香豆素中选取29种可最终确定抗SVCVIC50值的香豆素类化合物用于构建定量构效关系（QuantitativeStructure-ActivityRelationship，QSAR）模型，其中按4:1分为训练集和测试集两部分（各化合物抗病毒对应pIC50值见表2-3）。通过构建化合物抗病毒模型，从图2-10可以看出，绝大多数的预测值和实验值分布于Y=X两侧，这表明该CoMFA模型具有一定的可靠性。另外，使用SYBYL-X2.0软件构建CoMFA模型，选取活性值最高的香豆素C4作为模板分子进行3D-QSAR分析，结果显示在香豆素支链苯并咪唑取代基的C-4和C-5位有一块绿色区域，这表明在这两个区域中引入适当的化学基团进一步地可以提高香豆素类化合物抗SVCV活性（图2-11）。值得注意的是，随着烷烃取代基长度增长至辛基及以上，各化合物对EPC细胞的毒性作用出现急剧升高。与此同时，我们也发现杂环取代基的种类对香豆素的毒性有一定的影响，主要表现为非咪唑类取代基显著降低化合物毒性，而咪唑类取代基化合物相对毒性较高。因37 此，后续研究关于精确确定化合物活性基团与抗病毒活性、药物毒性之间的关系，将有助于开发更为有效、低毒的抗SVCV药物。图2-10实验pIC50值与预测pIC50值之间关系的散点图（CoMFA），直线为训练集和测试集的回归线。Figure2-10PlotoftheexperimentalpIC50versusthepredictedpIC50valuesforCoMFAanalysis.Thesolidlineistheregressionlineoftrainingandtestcompounds.ABCD图2-11香豆素类化合物抗病毒CoMFA等势图。A为活性香豆素类化合物的分子叠加图，B和C分别为立体图和静电图，D为B与C的叠加图。Figure2-11CoMFAcontourmapsofthehighlyactivecompoundagainstSVCV.(A)Thestackingchartofcoumarindericativesmolecular;(B)Stericcontourmap;(C)Electrostaticcontourmap;(D)ThesuperpositiongraphofBandC.2.3.2香豆素类化合物的抗病毒作用关于香豆素类化合物抗病毒活性当前大多集中于人类病毒病方面，此类化合物展现出非常有价值的应用前景（Tianetal.2009；Završniketal.2011）。Hwu等（2008）研究发现利用亚甲基硫基作为桥联基团合成的苯并咪唑类香豆素能够抑制HCV的NS5BRNA聚合酶活力，从而对HCV的增殖起到很强的抑制作用，其中这两种化合物的半数38 有效浓度（Medianeffectiveconcentration，EC50）分别为3.4和4.1μM。Neyts等（2009）在前一研究的基础上将苯并咪唑基团上的两个碳原子用氮原子代替，合成的新化合物对HCV的抑制能力得到显著的提升。此外，四氢异喹啉类香豆素也被发现能够有效抗HCV病毒，其EC50为20μM（Mazzeietal.2008）。对于HIV的感染，Kashman等（1992）和Patil等（1993）从中草药中提取的两种吡喃类香豆素CalanolideA和InophyllumsB对HIV具有高度特异性，其中CalanolideA抗病毒EC50仅为0.11μM，因此，这两个化合物及其衍生物已成为目前抗HIV药物的研究热点。除此之外，Lee等（2009）从一种生长在亚洲地区的中草药Ferulaassa-foetidaL.根部分离出一个香豆素类化合物能够有效抑制H1N1病毒，其活性浓度远低于常用抗病毒药物金刚烷胺（IC50=0.92μg/mL），IC50值仅为0.26μg/mL。目前在水产养殖业中尚无合成药物抗鱼类病毒病的先例，大多数的研究集中于天然药用植物粗提浸膏对病毒增殖的抑制作用，如板蓝根、银黄提取物抑制KHV的复制以及黄芩和板蓝根的提取液对GCRV的抑制作用（安伟等2011；李俊超等2014）。然而，药用植物活性成分复杂，使用不同溶剂对其有效成分提取往往会造成抗病毒活性单体纯度较低，使用浓度过大，不利于实际药物应用。所以，在抗病毒天然产物开发方面，产率高、纯度高、速度快的提取工艺需要进一步的研究。此外，许多治疗人病毒病的药物也被发现对鱼类病毒的感染具有一定的作用，如利巴韦林对GCRV（Zhuetal.2015）、VHSV（Marroquíetal.2007）以及大麻哈鱼呼肠孤病毒（ChumSalmonReovirus，CSV）（DewitteorrandBols2007）等以及盐酸吗啉胍对GCRV的抑制作用（Yuetal.2015）。另外，利巴韦林在浓度大于10mg/L时能够有效降低IPNV在CHSE-214细胞（大鳞大麻哈鱼胚胎细胞细胞系）和RTG-2细胞（虹鳟鱼性腺细胞系）内的复制（MigusandDobos1980）。然而，Shen等（2018）研究发现阿昔洛韦、金刚烷胺、阿糖胞苷、更昔洛韦、盐酸吗啉胍、阿糖腺苷及利巴韦林在安全浓度内对SVCV在EPC细胞内的增殖均无显著的抑制作用。本章研究发现的新香豆素类化合物C4、D5能够有效控制SVCV的增殖，防止宿主细胞出现病变现象，因此，这两个香豆素可在后续的实验中作进一步的深入研究。2.4小结本章研究通过体外抗病毒筛选实验发现7-[4-（苯并咪唑）丁氧基]香豆素（C4）和7-[6-（2-甲基咪唑）己氧基]香豆素（D5）在10mg/L具有较高的抗病毒活性，能够有效抑制SVCV4种结构蛋白在EPC细胞内表达，显著地降低病毒滴度，保护细胞免受SVCV的感染；与其他香豆素相比，香豆素C4、D5可在72h内维持EPC细胞生长活力。因此，综上结果将这两种药物作为下一阶段实验的研究对象。39 第三章香豆素C4、D5抗SVCV诱导的细胞凋亡活性研究细胞凋亡是机体在受到内外信号刺激时，由基因控制的一种细胞主动性死亡过程，是机体维持自身内环境稳态、调控免疫系统功能化和机体发育的一种重要方式（FinkandCookson2005；Wylieetal.1980）。作为一种较为温和的细胞死亡模式，细胞凋亡在进行过程中往往是单一细胞死亡，不会累及至周围其他细胞，而且细胞内部溶酶体膜是完整的，也不会伴随炎症反应发生（王艾琳和李坚2004）。根据细胞凋亡的形态学特征变化，一般可将其发生过程分为以下三个阶段：①核碎裂阶段，即包括细胞膜表面一些特殊结构的消失，细胞核固缩、染色质凝聚以及胞浆浓缩等变化；②凋亡小体产生阶段，也就是细胞膜形成的泡状突起与母胞体分离形成凋亡小体、细胞质膜出现空泡化这个过程；③吞噬或降解阶段，即凋亡小体自行崩解或被周围、巨噬细胞所吞噬（王新玲等1999）。另外，细胞凋亡的生化特征包括：DNA断裂，细胞核内染色质形成不连续的、以180~200bp整数倍为最小单位的寡聚核苷酸片段（李静和白玉梅2003；Johnsonetal.1996），以及线粒体氧化呼吸受损，产生的能量物质减少，膜电位降低，线粒体生成的细胞色素C由内部向外部漏出，并激活下游Caspase通路从而导致细胞凋亡（FallandBennettJr1999）。当前越来越多的研究表明病毒感染能够诱导宿主细胞发生凋亡（MüllerAandRudel2001），而细胞凋亡对不同病毒的致病性具有不同的作用。一方面，细胞的凋亡作用能够直接影响病毒在宿主细胞内的复制增殖，并且能够利用吞噬细胞清理被病毒诱发凋亡的细胞，从而进一步阻断病毒的传播，例如流感病毒能够诱导人单核细胞、Hela细胞、巨噬细胞等发生凋亡（刘菲菲和何士勤2002）；另一方面，病毒诱导的细胞凋亡又是病毒致病的主要因素，其能够造成大量的细胞死亡（单士刚等2006），例如禽流感病毒的致病性与病毒诱导的细胞凋亡有关（Itoetal.2002），以及SARS诱导的细胞凋亡对病毒致病效应方面可能也存在一定的影响（Mizutanietal.2005；Tanetal.2004）。因此，研究药物对病毒导致的细胞凋亡作用能够为控制病毒感染性和致病性提供更多的活性数据支持，为进一步应用药物提供理论依据。前一章实验结果表明香豆素C4、D5能够有效抑制SVCV在EPC细胞的增殖，并在一定程度上显著地抑制SVCV四种结构蛋白基因的表达，最终有效保护宿主细胞免受病毒感染。本章实验以SVCV诱导的EPC细胞凋亡为线索，采用多种细胞凋亡检测技术，通过观察SVCV感染和药物处理后EPC细胞的形态学及生化指标变化，对香豆素C4、D5的抗细胞凋亡以及SVCV对宿主细胞的作用作进一步的研究，以期为后续病毒感染过程和药物抗病毒机制提供一定的参考。3.1材料与方法3.1.1细胞和病毒细胞和病毒同2.1.1。40 3.1.2药物香豆素C4、D5同2.1.2。3.1.3试剂和仪器本章所用试剂和仪器信息详见附录。3.1.4香豆素C4、D5对SVCV诱导的细胞凋亡形态学作用3.1.4.1细胞核损伤检测（1）细胞培养和病毒感染将密度为1×105/孔的EPC细胞接种于含圆形细胞爬片的12孔细胞培养板中，25℃培养16~24h至细胞在爬片上生长至单层。然后吸出培养基，M199培养基漂洗2~3次，加入SVCV稀释液（1×103TCID50），25℃孵育2h。（2）药物处理用细胞维持液将香豆素C4、D5母液分别稀释至10mg/L，待SVCV孵育2h后，回收病毒液，用M199培养基漂洗细胞2~3次，加入新鲜配置的含香豆素培养基或细胞维持液（对照组，含0.2‰DMSO），25℃继续培养48~72h。（3）细胞固定在48、72h后，将12孔板内的药物-病毒培养基吸出，用0.1MPBS漂洗爬片上细胞2~3次后，加入500μL4%多聚甲醛，室温孵育20min以固定EPC细胞。（4）细胞染色细胞固定完成后，用0.1MPBS漂洗爬片上细胞3次，每次1~2min，再加入500μL5μMDil细胞膜荧光探针工作液，37℃避光孵育10~20min，然后吸弃工作液，0.1MPBS洗涤3~5次，每次2~3min。加入DAPI染液，37℃避光染色15~20min。染色结束后，吸弃DAPI染液，0.1MPBS洗涤3次，每次2~3min。（5）封片用镊子小心取出长满细胞的爬片，将爬片含细胞的一面朝上放置在吸水纸进行干燥（不能完全晾干）。吸取抗荧光淬灭剂15~20μL滴加在干净载玻片上，将爬片含细胞面朝下盖在载玻片上，尽量避免气泡的出现（可轻压爬片挤出多余液体，用吸水纸将爬片边缘擦干）。室温避光静置干燥约20min后用无色指甲油涂抹在爬片边缘，以封片。待指甲油凝固后，将含爬片的载玻片置于4℃避光保存，样品在3d内用正置荧光显微镜观察。（6）荧光显微镜（Leica-DM5000）观察细胞爬片采用正置荧光显微镜进行观察，Dil的最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm，显红色。DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI与核酸结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm，显蓝色。3.1.4.2细胞骨架损伤检测41 （1）细胞培养和病毒感染同3.1.4.1细胞核损伤检测（1）。（2）药物暴露同3.1.4.1细胞核损伤检测（2）。（3）细胞固定同3.1.4.1细胞核损伤检测（3）。（4）细胞微管染色细胞固定完成后，用含0.1%TritonX100的0.1MPBS洗涤2~3次，每次3~5min；用含5%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%TritonX100的0.1MPBS洗涤EPC细胞1次，并以1:200比例稀释微管红色荧光探针（Tubulin-TrakcerRed，碧云天）配置成染色液，按500μL/孔加入到含爬片的12孔板中，37℃避光孵育45~60min后，吸弃染色液，用含0.1%TritonX100的0.1MPBS洗涤细胞4次，每次5min。再向12孔板中加入DAPI染液，37℃避光染色15~20min后，吸弃DAPI染液，0.1MPBS洗涤3次，每次2~3min。（5）封片同3.1.4.1细胞核损伤检测（5）。（6）荧光显微镜（Leica-DM5000）观察细胞爬片采用正置荧光显微镜进行观察，Tubulin-TrackerRed探针最大激发波长为555nm，最大发射波长为565nm，显红色。3.1.5细胞超微结构观察3.1.5.1细胞表面超微结构观察（1）细胞样品的收集将密度为1×106/孔的EPC细胞接种于6孔细胞培养板中，25℃培养16~24h，待细胞长至单层时，吸出培养基，用M199培养基漂洗2~3次，加入SVCV稀释液（1×103TCID50），25℃孵育2h；待病毒孵育2h后，回收病毒液，用M199培养基漂洗2~3次，加入新鲜配置的10mg/L香豆素C4或D5，25℃继续培养48~72h。药物暴露结束后，用0.1MPBS洗涤细胞2~3次，再用含EDTA、浓度为0.25%的胰蛋白酶消化细胞，然后1000rpm、5min离心收集样品，弃上清后向收集的细胞内加入预冷的2.5%的戊二醛固定液，4℃过夜以固定细胞样品。（2）细胞玻片样品的制备将0.5cm×0.5cm的小方块（载玻片）放入酸缸过夜，取出后依次分别用蒸馏水和无水乙醇冲洗数次，置于烘箱中烘干后，密封备用。使用微量移液器吸取少量10%多聚-L-赖氨酸溶液均匀滴加于处理后载玻片上，再将玻片放入烘箱60℃烘烤1h，备用。取出在2.5%戊二醛溶液中固定的细胞样品，静置约10min后用无菌蒸馏水冲洗以除去表42 面残留的固定液，然后均匀分散到涂有多聚赖氨酸载玻片上，并用显微镜观察细胞是否被吸附。（3）样品处理以及扫描电镜观察将附着有细胞样品的载玻片小心的放到10mL无菌干净的样品瓶中进行后续脱水处理。首先用0.1M的PBS缓冲液漂洗3次，每次约5min；然后分别用浓度为30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液对样品进行梯度脱水一次，每次约10min，再用无水乙醇脱水一次、丙酮脱水两次，每次20min；其次用丙酮与乙酸异戊酯（V/V=1/1）的混合液置换20min；最后将细胞样品完全置于乙酸异戊酯中，处理2h。使在扫描电镜观察前，用CO2临界点干燥仪对各样品进行临界点干燥，然后喷金镀膜，最后用S-4800场发射扫描电镜观察。3.1.5.2细胞内部超微结构观察细胞的收集同3.1.6细胞表面超微结构观察（1）。将上步已固定的细胞样品转入5mL离心管中，1500g离心15min，弃上清；将样品细胞按琼脂注模法包埋于低熔点琼脂（1~2%）中，待样品凝固后，将含细胞的琼脂块切成1mm3左右正方体小块；再用2.5%的戊二醛固定样品小块6h，然后用0.1M的PBS进行漂洗，5、10、15、20、25、30min各洗涤一次；之后用1%锇酸4℃固定2h，再用PBS进行前一步漂洗；用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇各脱水一次，每次15min，最后用100%乙醇脱水两次，30min/次。脱水后的样品用比例为1:1（胶:乙醇）稀释胶渗透过夜，再用100%胶渗透两次，时间依次是2h和1h。制成的胶样放入60℃烘箱烘烤约48h，最后抠出胶粒，制备成超薄切片，准备透射电子显微镜观察。3.1.6AnnexinV-FITC/PI凋亡双染检测本实验使用VazymeAnnexinV-FITC/PI凋亡双染检测试剂盒对各EPC细胞样品的凋亡情况进行检测，具体操作步骤如下所示：（1）细胞样品的收集病毒感染及药物处理同3.1.5.1细胞表面超微结构观察（1）。药物-病毒处理实验结束后，用0.1MPBS洗涤细胞2~3次，再用浓度为0.25%的胰蛋白酶消化EPC细胞，300g、4℃离心5min收集样品。（2）染色步骤（1）中的细胞样品用预冷的0.1MPBS洗涤2~3次，300g、4℃离心5min收集细胞。然后向样品中加入100μL1×BindingBuffer缓冲液重悬细胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色工作液，轻轻混匀，室温、避光反应10min。最后，加入400μL1×BindingBuffer缓冲液，轻轻混匀，待测。细胞样品在1h内用流式细胞仪检测。（3）流式细胞仪分析流式细胞仪的激发波长为488nm，FITC所属的绿色荧光在FL1通道检测，PI所属43 的红色荧光在FL3通道检测。使用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点，FL1为横坐标，FL3为纵坐标，每个样品采集20000数据点。本实验样品细胞可以分为三个亚群：活细胞含极低强度的背景荧光；早期凋亡细胞仅有较强的FITC绿色荧光；晚期凋亡细胞有FITC绿色荧光和PI红色荧光双重染色。3.1.7Caspase酶活性分析本实验使用碧云天Caspase活性检测试剂盒对SVCV感染、香豆素C4/D5处理后的EPC细胞内Caspase3、8、9活性进行检测，具体操作步骤如下：（1）细胞样品的处理将一定数量的EPC细胞接种与于直径为10cm的细胞培养皿中，25℃培养24h，待细胞长至单层时，吸出培养基，用M199培养基漂洗2~3次，加入SVCV病毒稀释液3TCID（1×1050），25℃孵育2h；待孵育2h后，回收病毒液，再用M199培养基漂洗2~3次，加入新鲜配置的10mg/L香豆素C4或D5，25℃继续培养细胞48~72h。药物暴露结束后，用预冷的0.1MPBS洗涤细胞2次，再加入2mL预冷的PBS，铺满皿底；将培养皿呈一定程度的倾斜，使用无菌的细胞刮刀轻轻的、顺着一个方向刮下EPC细胞，使细胞集中于皿一侧底部，最后将细胞样品转移至预冷的1.5mL离心管中，600g、4℃离心5min后小心弃去上清（尽量确保无细胞被吸除）。（2）可溶性蛋白的提取及含量测定按照每2×106加入100μL细胞裂解液的比例加入裂解液，重悬细胞沉淀，冰浴裂解共30min。期间，每隔10min使用涡旋振荡器充分振荡样品5~10s。然后在4℃、12000~16000g条件下对样品离心15min，取上清液转移至新的、预冷的1.5mL离心管中，取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度（Bradford1976）。（3）Caspase酶活性检测参照试剂盒说明书构建标准曲线和设置反应体系，使用全波长荧光酶标仪（TecanM200）对上述样品中Caspase3、8、9酶活性进行检测。3.2结果与分析3.2.1细胞核损伤观察结果DAPI染色结果显示：SVCV感染EPC细胞48h后，通过荧光显微镜可清晰地观察到病毒感染组宿主细胞的细胞核出现典型的细胞凋亡特征，如细胞核界线模糊并伴随明显的融解趋势，染色质出现皱缩，细胞核逐步边缘化甚至轻微破裂，细胞内开始出现凋亡小体等（图3-1A，箭头所示）。随着SVCV感染时间至72h，EPC细胞的凋亡特征进一步显现：凋亡小体的数量急剧上升，细胞核界线出现消失现象（图3-1B）。相比之下，香豆素C4、D5处理后的EPC细胞与对照组观察结果基本一致，细胞均正常染色，细胞核形态大小一致，染色质也未出现皱缩现象，凋亡小体在观察区域数量极少，这个结果44 说明C4、D5能有效抗SVCV诱导的细胞凋亡，显示出这两种香豆素良好的抗病毒效果。A45 B图3-110mg/L香豆素C4、D5处理48（A）和72（B）h抑制SVCV诱导的凋亡小体在EPC细胞内产生Figure3-1TheinhibitionofcoumarinsC4andD5at10mg/LonSVCV-inducedapoptoticbodyinEPCcellsafter48(A)and72(B)htreatment3.2.2细胞骨架损伤观察结果细胞骨架由微管、微丝和中间纤维等不同类型的纤维组成，与细胞形态稳定、细胞整体运动和细胞器运动息息相关。Liu等（2013）研究表明宿主细胞的微丝骨架在SVCV感染过程中具有重要作用，参与病毒在细胞内的传递、运输。本实验的研究结果表明（图3-2）：SVCV感染EPC细胞可破坏细胞骨架纤维系统，导致微丝减少以及微管聚集并形成环状结构（如图中箭头所示）；更为严重地是，SVCV感染在72h时导致细胞局部区域肌动蛋白纤维崩解，微管扭曲成团状。而对照组EPC细胞中细胞骨架形态完整，肌动蛋白微丝呈放射状分布，蛋白纤维完整、清晰。此外，已感染SVCV的EPC细胞在经过香豆素C4、D5的处理后，细胞骨架与对照组相比无显著差异，结构保持完整。46 图3-2SVCV感染EPC细胞后，香豆素C4、D5对细胞骨架的保护作用Figure3-2TheprotectionofcoumarinsC4andD5oncytoskeletoninEPCcellsafterSVCVinfection47 3.2.3细胞表面超微结构观察结果场发射扫描电镜观察SVCV感染EPC细胞对细胞表面超微结构影响和药物对细胞保护作用的结果如图3-3所示。其中对照组的细胞形态保持完整，表面较为光滑，而SVCV感染48h后，EPC细胞形态发生一定的变化，细胞表面粗糙不平并伴有不同程度的孔洞。除此之外，也伴有凋亡小体的出现。随着病毒感染时间的延长至72h，EPC细胞表面结构出现严重的断裂，孔洞加大并可能有胞内基质的流出。与此同时，经香豆素C4、D5处理后的EPC细胞维持较为良好的形态结构，与对照组相比无明显差异，也未有典型的凋亡特征出现。扫描电镜结果与前一个荧光显微镜检测凋亡小体实验结果一致，说明香豆素C4、D5可有效减小SVCV对EPC细胞的伤害。A.Control-48hB.SVCV-48hC.C4+SVCV-48hD.D5+SVCV-48hE.Control-72hF.SVCV-72h48 G.C4+SVCV-72hH.D5+SVCV-72h图3-3场发射扫描电镜观察SVCV诱导EPC细胞凋亡Figure3-3ObservationonapoptosisinSVCV-infectedEPCcellsbyusingscanningelectronmicroscopy3.2.4细胞内部超微结构观察结果透射电镜观察SVCV感染EPC细胞对细胞内部超微结构影响及药物对细胞保护作用的结果如图3-4所示。SVCV感染后的EPC细胞出现染色质凝集、核膜分离以及空泡化的现象（图3-4B）；随着病毒感染时间延长至48h，宿主细胞内低电子区域面积急剧增加，细胞质空泡化逐渐严重，细胞核有裂解趋势并伴有核孔变大、内容物流出等现象（图3-4F）。值得注意的是，在病毒感染组，EPC细胞内部的线粒体数量明显减少，内部结构受损程度严重。而经过香豆素C4、D5处理，感染SVCV的EPC细胞与对照组相比差异不显著，细胞内部细胞核、线粒体和其他细胞器结构保持完好。A.Control-24hB.SVCV-24hD.D5+SVCV-24hC.C4+SVCV-24h49 E.Control-48hF.SVCV-48hG.C4+SVCV-48hH.D5+SVCV-48h图3-4透射电镜观察SVCV诱导EPC细胞凋亡Figure3-4ObservationonapoptosisinSVCV-infectedEPCcellsbyusingtransmissionelectronmicroscopy3.2.5AnnexinV-FITC/PI凋亡双染检测结果流式细胞术检测SVCV诱导EPC细胞凋亡结果如图3-5、3-6所示。图3-5A显示，SVCV感染EPC细胞能够显著降低正常细胞的比例，降幅达到47.34%，而凋亡细胞则大部分处于凋亡早期阶段。随着病毒感染时间延长至72h（图3-5B），病毒组细胞的正常比例进一步下降，只占全部细胞的31.63%；此外，该时间点EPC细胞的晚期凋亡率逐步升高，这说明病毒感染的EPC细胞受损进一步加强，细胞凋亡趋势明显，可能随时有胞体崩解的趋势，这个结果与扫描电镜所观察的现象相吻合。A.48h50 B.72h图3-510mg/L香豆素C4、D5处理SVCV感染后的EPC细胞，48（A）和72（B）h后通过Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理。Figure3-5Thepercentageofapoptoticcellsbytreatedwith10mg/LC4orD5wasassessedbyAnnexin-V/PIstainingat48(A)and72(B)hpostinfection.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate.在加入10mg/L香豆素C4、D5后，药物处理组的细胞凋亡率显著降低。相比于病毒组，药物处理组正常细胞的比例均超过80%。除此之外，我们检测了低浓度组C4、D5对SVCV诱导细胞凋亡的影响。统计结果显示，不同浓度C4和D5处理后EPC细胞凋亡率分别为53.8%~22.1%（48h0.1mg/L~4mg/LC4处理）、64.0%~31.4%（72h0.1mg/L~4mg/LC4处理）、50.5%~28.7%（48h0.1mg/L~4mg/LD5处理）和66.0%~37.2%（72h0.1mg/L~4mg/LD5处理）（图3-6）。通过分析数据结果，我们可以发现随着香51 豆素处理浓度的增加，药物处理组与病毒组的细胞凋亡率差值持续下降，这说明药物处理浓度与细胞凋亡呈负相关关系。图3-6香豆素C4、D5多浓度处理SVCV感染后的EPC细胞后，在48和72h统计细胞凋亡率。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理。Figure3-6Percentageofapoptoticcellswasdetectedafter48and72hpostinfectioninthepresenceofC4orD5atdifferentdoses(0.1,0.25,0.63,1.6,4and10mg/L).Linechartsrepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate.3.2.6Caspase酶活性检测结果SVCV感染和香豆素C4、D5处理EPC细胞后对胞内Caspase酶活性的影响如图3-7所示。结果显示SVCV感染细胞48、72h对Caspase3、9活性影响较大，病毒组酶活性分别为对照组的523%~392%（Caspase3）和174%~164%（Caspase9）；相比之下，Caspase8的活性只在72h显著增加，达到对照组的158%。与病毒感染后Caspase酶活性的变化相比，10mg/LC4、D5作用后Caspase-3、8、9酶活性均显著地降低，与对照组相比无显著差异。这些结果反映出这两种香豆素可通过调控Caspase活性达到有效抑制SVCV诱导细胞凋亡现象的出现。图3-710mg/L香豆素C4、D5处理SVCV感染后的EPC细胞后，Caspase3、8、9酶活性在48和72h变化情况。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01,*P<0.05。Figure3-7Caspase-3,8,9activitiesweredetectedafter48and72hpostinfectioninthepresenceofC4orD5at10mg/L.Linechartsrepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.52 3.3讨论3.3.1病毒感染引起的细胞凋亡与前一章节结果相似的是，本章研究发现香豆素C4、D5能够有效抑制SVCV诱导细胞凋亡的出现，这主要是与药物控制病毒在宿主细胞内的复制有关，也从侧面反映出这两个香豆素具有很好的抗病毒活性。另外，EPC细胞的凋亡结果显示凋亡细胞的细胞核出现浓缩，逐步凝聚在核膜周边，并且有一定数量的凋亡小体，更严重地是，EPC细胞表面出现多处小孔和凹陷，胞体有裂解的趋势。与此类似，Björklund等（1997）和Kazachka等（2007）研究发现基于细胞凋亡的细胞病变在病毒感染后期可使EPC细胞发生崩解，这将以利于装配成熟的SVCV进一步释放、扩散至邻近细胞开始新一轮的病毒感染增殖。一般情况下，正常的细胞凋亡过程对于机体的正常发育和代谢是至关重要的，有利于维持组织内部稳态。在感染宿主细胞后，病毒往往需要借助宿主细胞内部物质和能量系统来完成自身的增殖复制，在这个过程中，病毒将会引发严重的细胞凋亡从而产生典型的细胞病变效应（王艾琳和李坚2004）。例如猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisCoronavirus，TGEV）感染宿主细胞后会导致细胞核酸物质片段化和细胞表面结构发生变化（Dingetal.2012）；蛙虹彩病毒（RanagrylioVirus，RGV）感染FHM细胞后导致胞内染色体异常、DNA片段化以及线粒体裂解（Huangetal.2007）。3.3.2病毒对细胞骨架的影响病毒感染可改变宿主细胞的正常功能，使细胞处于有利于病毒复制的状态，其中较为显著的变化就是细胞骨架结构，它主要影响病毒的进入、胞内传递、组装和释放（Lehmannetal.2005）。许多研究结果表明微管、微丝、中间纤维和参与调节细胞骨架的功能蛋白在病毒感染周期内有重要作用（Hydeetal.2012；LymanandEnquist2009）。在本章研究中，我们观察到SVCV感染破坏了细胞骨架结构，使得骨架纤维逐步崩解，部分区域出现环状结构，并伴随微管、微丝的解聚，这与Liu等（2013）报道的SVCV调控EPC细胞骨架结构的结论是一致的。除SVCV外，斑点叉尾鮰病毒（Channelcatfishvirus，CCV）和新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singaporegrouperiridovirus，SGIV）感染宿主细胞，细胞骨架结构出现相似的现象（PopeandScheetz1998；Yanetal.2014）。另外值得关注的是，受损的细胞骨架在胞内SVCV的刺激下可能会弱化细胞吸附和释放病毒粒子的能力（Yuanetal.2014）。相比之下，经过C4、D5处理的EPC细胞骨架保持完整，未出现明显的受损情况，这可能会对SVCV释放产生影响，有利于保护宿主细胞正常功能。3.3.3Caspase家族的作用作为一类天冬氨酸依赖性的半胱氨酸蛋白酶，Caspase家族在细胞凋亡过程中起着53 核心作用，通过特异性地水解、修饰细胞内大量蛋白直接调控细胞凋亡过程（Liuetal.2007；ThornberryandLazebnik1998）。在正常情况下，细胞内的Caspase以酶原的形式存在，不具备活性，相对分子质量约为30000~50000；在受到病毒感染等因素激活后，其内部保守的天冬氨酸残基位点被切割形成3个亚单位，除了N端的亚单位不参与活性Caspase的形成外，另外两个游离的亚单位相互结合形成有活性的异二聚体，而两个异二聚体之间又能够相互结合从而进一步增强Caspase酶活性（Rupinderetal.2007；SalvesenandDixit1997；StennickeandSalvesen2000）。在细胞凋亡过程中，有两条经典的Caspase调控通路，一个由Caspase-8介导的死亡受体通路（Nagata2000），另一个是由Caspase-9所介导线粒体通路（DesagherandMartinou2000）。不同种类的病毒引起的凋亡机制不一样，例如流感病毒引起的细胞凋亡主要与Caspase-8介导的外源性信号活化有关，而VSV则主要利用内源性线粒体途径（Caspase-9）激活宿主细胞发生凋亡（Balachandranetal.2000）。关于SVCV的研究发现其诱发的细胞凋亡可能是通过肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF）介导的外源性和线粒体内源性这两条通路（Yuanetal.2014）。本章研究结果表明SVCV激活了Caspase-3、8、9，诱导产生出强烈的细胞凋亡信号，在这个过程中，Caspase-8的活性变化较小，48h与对照组相比差异不显著。由于Caspase-8被认为是整体细胞凋亡信号通路较为上游的一个信号酶，活化的Caspase-8可在一定程度上进一步活化线粒体凋亡通路，激活Caspase-9（DesagherandMartinou2000），因此，结合电镜观察到的EPC细胞内线粒体损伤现象，我们认为SVCV诱导的细胞凋亡主要是通过线粒体凋亡通路进行调控。目前在水产病毒中，GCRV、胰腺坏死病病毒（PancreaticNecrosisVirus，PNV）和RGV被发现具有与SVCV相似的凋亡调控特征（Fariedetal.2007；Huangetal.2007；Xiaoetal.2014）。此外，我们还发现C4、D5强力抑制了SVCV引起的死亡受体-线粒体凋亡通路上Caspase-8、9酶的活化，并最终恢复凋亡通路下游Caspase-3酶的状态，有效阻止细胞凋亡对EPC细胞的伤害。3.4小结本章研究结果显示SVCV主要通过内源性线粒体通路导致EPC细胞发生细胞凋亡。而香豆素C4、D5能够有效控制SVCV诱导Caspase凋亡信号的启动，避免细胞凋亡的发生，降低病毒对EPC细胞的危害，实现药物对细胞的直接保护作用。54 第四章香豆素C4通过PKC-Nrf2/ARE通路抗SVCV研究近年来，越来越多的证据表明大多数病毒感染宿主引起的氧化应激作用可造成组织损伤和炎症反应，这已成为病毒感染的主要致病机制之一（Gonzalezdosaletal.2011；Kimetal.2013；Narayananetal.2014）。一些病毒感染引起的氧化应激作用激活宿主细胞内多条抗氧化通路，导致下游靶点之一的抗氧化酶活力增强，从而避免细胞受到过度的损伤，有利于细胞的存活，并产生相应的抗病毒反应（Kosmideretal.2012）。作为细胞内最重要的氧化还原核心途径之一的核因子E2相关因子2（Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2），其介导的Nrf2-ARE（抗氧化反应原件，antioxidantresponseelements）通路在维持机体氧化平衡、抗炎症反应以及抵御病毒感染等方面起到极其关键的作用。Nrf2通路的缺失或激活障碍都会破坏细胞内平衡稳态，导致细胞功能性缺失，出现细胞凋亡甚至死亡（李冰2012）。先前的研究发现，SVCV感染EPC细胞提高了Nrf2蛋白的表达，促进Nrf2在24h内的核转运作用（Yangetal.2014），从而有效抑制SVCV增殖、降低病毒毒力、保护细胞免受病毒感染（Shaoetal.2016）。在正常情况下，Nrf2与胞质抑制因子Keap1相结合，处于未被激活的低水平表达状态，并不断地被Keap1泛素化和降解。而一旦出现氧化应激或其他诱导因素，信号首先被Keap1所捕获，通过与Keap1蛋白上关键Cys残基被修饰，改变构象从而释放并增强Nrf2蛋白的稳定性，使其由胞质转运至细胞核（Eggleretal.2005），然后识别并与ARE结合，最终启动下游多重基因转录，增强细胞的抗氧化能力（Zhaietal.2013）。除此之外，Nrf2同样可以被多种蛋白激酶磷酸化从而与Keap1分离而活化，并进入细胞核，启动抗氧化基因的转录。目前一些证据表明蛋白激酶C（ProteinkinaseC，PKC）、磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositide3-kinases，PI3K）和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）等多种途径参与Nrf2磷酸化过程（Leeetal.2001；NguyenandPickett2000；Shenetal.2004；ZipperandMulcahy2000），它们主要作用于Nrf2蛋白结构中的Ser40位点来发挥磷酸化作用。另外，Nrf2-ARE通路调控的下游目的基因有许多种，其中，HO-1被认为是Nrf2-ARE信号通路中抗SVCV的主要靶基因（邵军辉2016）。一些研究发现SVCV感染EPC细胞后能够下调HO-1的表达（Yuanetal.2012），导致宿主细胞内活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies，ROS）显著升高（Liuetal.2017）；而HO-1表达被抑制后，SVCV在宿主细胞内扩增效率显著增强。这些结果一方面说明SVCV具有类似于石斑鱼神经坏死病毒（RedspottedGrouperNervousNecrosisVirus,RGNNV）和GCRV（Changetal.2011；Jiaetal.2014）等水产病毒的致病原因，即通过氧化应激破坏鱼类机体抗氧化系统平衡，损害鱼体健康；另一方面显示出Nrf2-ARE通路在抗SVCV方面的关键作用。我们前章的研究结果表明香豆素C4有效地控制了SVCV在EPC细胞中的增殖效率，显著地抑制SVCV诱导细胞凋亡的发生，保证EPC细胞处于正常的生长状态，但55 其发挥抗病毒作用的机制尚不清楚。而作为一种羟基香豆素，C4被我们认为有着良好的抗氧化能力，因此，本章以SVCV感染EPC细胞过程为线索，首先确定香豆素C4对病毒增殖过程的影响，然后重点研究C4在抗SVCV过程中如何通过PKC调节宿主核心抗氧化系统——Nrf2-ARE通路，对SVCV复制过程的产生抑制作用，同时利用RNA干扰技术探究Nrf2-ARE通路下游重要靶点HO-1、干扰素与C4之间的关系，最终得到香豆素C4的抗SVCV机制。4.1材料与方法4.1.1细胞和病毒细胞和病毒同2.1.1。4.1.2药物香豆素C4同2.1.2。PKC激活剂Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）和PKC抑制剂Staurosporine购自碧云天生物技术，母液均为DMSO配置，浓度分别为10mg/mL和1mM。4.1.3试剂、抗体和仪器本章所用试剂和仪器信息详见附录。抗Nrf2（GTX103322）和PKCβ（GTX113252）多克隆抗体购自GeneTex公司；抗pNrf2-Ser40（ab76026）、PKCα（ab32376）、pPKCα-Thr638（ab32502）、pPKCβ-Ser660（ab75837）和HO-1（ab68477）多克隆抗体购自Abcom公司；抗α-Tubulin（AF0001）多克隆抗体、HistoneH3（AF0009）单克隆抗体、Tubulin（AT819）小鼠单克隆抗体和辣根过氧化物（HRP）标记的二抗购自碧云天生物技术；AlexaFluor488标记山羊抗小鼠和AlexaFluor594标记山羊抗兔荧光二抗购自Proteintech。4.1.4香豆素C4对SVCV感染过程的作用4.1.4.1病毒粒子吸附检测根据Espínpalazón等（2016）提出的方法，将一定密度的EPC细胞接种于25cm2细胞培养皿中，25℃培养24h，待细胞生长至90%时，吸出培养基，M199培养基漂洗24TCID次后加入10mL由细胞维持液配置的SVCV稀释液（1×1050）±新鲜配置的香豆素C4，4℃孵育30min（这一阶段病毒粒子与细胞表面受体结合但不被细胞所内吞）。随后，移除含病毒、药物的培养基，M199培养基洗涤EPC细胞2~3次，再用含EDTA、浓度为0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1000rpm、5min离心收集样品，弃去上清后向收集的细胞内加入TRIzol试剂，提取样品总RNA。参照2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）利用qRT-PCR对SVCV的G蛋白表达量进行检测。4.1.4.2细胞融合检测根据Espínpalazón等（2016）提出的方法，向96孔细胞培养板中加入密度为1×104/孔的EPC细胞100μL，25℃培养16~24h。待细胞生长至80%~90%时，向其中接种1×56 104TCID50的病毒稀释液100μL/孔（由细胞维持液稀释），25℃培养箱中培养24h。随后，回收病毒液，用细胞维持液洗涤2次，再加入新鲜配置的10mg/L香豆素C4，25℃分别孵育1、2、4h后，移除培养基，用0.1MPBS漂洗细胞2~3次。然后，向96孔板内加入pH为6的细胞融合培养基（由M199培养基配置，HEPES浓度为20mM，MES浓度为20mM），22℃孵育30min后，再用0.1MPBS漂洗细胞2~3次，加入pH为7.5的细胞融合培养基（配置同上），室温孵育2h。最后，用预冷的冰甲醇固定细胞15~20min，自然干燥后用吉姆萨染液染色45min，0.1MPBS漂洗细胞3~5次后用倒置显微镜观察细胞融合现象。4.1.4.3时间梯度检测（Timeofaddition）SVCV感染过程同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。感染病毒2h后回收病毒液，M199培养基洗涤细胞2~3次，再置换为细胞维持液。紧接着，每隔2h将细胞维持液换为新鲜配置的10mg/L香豆素C4，直至病毒感染后第12h。在该实验过程中，药物只处理感染病毒的细胞2h，即后一个时间点需要吸出前一时间点的香豆素，用M199培养基洗涤细胞2~3次后，再置换为细胞维持液。此外，每个时间点均有对照组（含0.2‰的DMSO）以及3平行处理。随后，移除含药物的培养基，收集细胞样品，向收集的细胞内加入TRIzol试剂，提取样品总RNA。参照2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）利用qRT-PCR对SVCV的4个结构蛋白表达量进行检测。4.1.5香豆素C4对细胞抗病毒反应的作用4.1.5.1抗氧化指标的检测（1）细胞内ROS检测A.细胞培养和病毒感染将密度为1×104/孔的EPC细胞接种于96孔细胞培养板中，25℃培养16~24h至细胞在孔内生长至90%，吸出培养基，M199培养基漂洗2~3次，加入SVCV稀释液（1×3TCID1050），25℃孵育2h。B.药物处理病毒孵育2h后，回收病毒液，用M199培养基漂洗2~3次，加入新鲜配置的10mg/L香豆素C4，25℃继续培养24、48h；C.ROS荧光探针的装载利用碧云天生物技术提供DCFH-DA荧光探针对ROS进行检测，按照1:1000用细胞维持液稀释浓度为10mM的DCFH-DA，使其终浓度变为10μM。药物处理后，用0.1MPBS漂洗板内细胞3次，加入100μL/孔ROS荧光探针工作液，37℃避光孵育30min，然后吸弃工作液，0.1MPBS洗涤3次，每次2~3min。最后用全波长荧光酶标仪检测ROS含量，并用倒置荧光显微镜显微镜观察。（2）抗氧化酶活性和还原型谷胱甘肽（GSH）含量检测57 细胞样品的处理和可溶性蛋白的提取同3.1.7（Caspase酶活性分析）。本实验使用GSH测定试剂盒（微板法）（南京建成）、超氧化物歧化酶（SOD）WST-1法测试盒（南京建成）和过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（南京建成）进行检测，实验均按照试剂盒说明书进行操作，产物利用全波段酶标仪进行检测。4.1.5.2Nrf2蛋白表达、磷酸化及核转运检测（1）Nrf2基因表达检测A.细胞样品的采集和总RNA的提取同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。B.使用VazymeHiScriptQSelectRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）反转录试剂盒对各样品总RNA进行反转录PCR，详细反应体系同表2-2所示。用移液器将上述样品轻轻吹打混匀。42℃反应2min。再在第1步的反应管中直接加入5×SelectqRTSuperMixⅡ2μL，使用移液器轻轻吹打混匀。50℃反应15min，85℃反应2min。以β-actin为内参、反转录产物为模板，利用qRT-PCR检测各样品中Nrf2蛋白基因的表达情况。蛋白基因和内参基因引物序列如表4-1所示（Yangetal.2014），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表4-1引物序列Table4-1Sequencesofprimerpairs基因名称引物序列（5'—3'）GenesPrimersequences(from5'to3')β-actinForwardGCTATGTGGCTCTTGACTTCGAReverseCCGTCAGGCAGCTCATAGCTNrf2ForwardGGACGAGGAGACCGGAGAGTTReverseCTGTTCTGCGAAAGCCTCATTCHO-1ForwardAGCTGTACAGGAGTCGCATGAAReverseACCTGGACGTTGAGCTCGAA反转录PCR合成的cDNA模板用VazymeAceQ®qPCRSYBR®GreenMasterMix试剂盒进行实时定量PCR扩增，条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；熔解曲线分析，65℃至95℃，每步5s。仪器为Bio-RadCFX96Real-TimePCRDetectionSystem。总体积为15μL的反应体系同表2-4所示。用2-△△Ct法分析实时定量数据。（2）Westernblot检测A.病毒感染和药物处理方法同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。药物处理组为0.1、1和10mg/L香豆素C4，分别选取24和28h收取样品。B.细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白的样品制备细胞总蛋白的提取同3.1.7（Caspase酶活性分析）。细胞质与细胞核蛋白的分离提取使用碧云天生物技术细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P0028），操作步骤依据试剂盒说明书进行。提取出的各蛋白样品与5×SDS上样缓冲液混匀，沸水煮10min，分装58 后-80℃保存。C.Westernblota.配置12%分离胶和5%浓缩胶，将上一步制好的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），初始电压为80V，待溴酚蓝条带达到分离胶、浓缩胶界线时改为120V，到目的条带充分分离时终止电泳；b.将目的蛋白（α-Tubulin、Nrf2、Histone和pNrf2-Ser40）进行切胶转膜处理，在冰浴条件下利用Bio-Rad蛋白转膜槽在电流为200mA时转膜0.5~2.5h；c.取出转膜后的、含目的蛋白的PVDF膜，浸泡到由TBST配置的5%脱脂奶粉中，室温封闭2h；d.TBST漂洗封闭完成的PVDF膜3~4次，每次10min，然后分别转入1:1000比例的α-Tubulin一抗、HistoneH3一抗和1:750比例的Nrf2一抗、pNrf2-Ser40一抗稀释液中，4℃孵育过夜；e.用TBST漂洗一抗孵育后的PVDF膜3~4次，每次10min，然后分别转入1:1000比例的HRP标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗稀释液中，室温下摇床轻摇2h；f.用TBST漂洗二抗孵育后的PVDF膜3~4次，每次10min，然后取出PVDF膜冲滴加ZATA超灵敏化学发光显影液，确保工作液均匀覆盖膜上，最后用成像仪拍照记录，用ImageJ软件分析条带分子量和净光密度值。（3）免疫荧光分析A.病毒感染和药物处理方法同3.1.4.1（细胞核损伤检测），分别选取24和28h收取细胞样品爬片。B.细胞固定、通透用0.1MPBS漂洗爬片上细胞2次，加入500μL4%多聚甲醛，室温固定20min后，再用PBS漂洗细胞3次，每次3min，加入500μL含TritonX100的免疫染色强力通透液（碧云天生物科技），室温孵育15min。通透后用PBS洗涤3次，每次5min，然后用山羊血清封闭30~60min，不漂洗，直接加入1:250比例的Nrf2或pNrf2-Ser40一抗稀释液，4℃封闭过夜。C.荧光染色一抗封闭结束后，回收一抗稀释液，用PBST漂洗细胞3次，每次5min，再加入1:500比例的荧光二抗，室温避光孵育1h；之后，回收二抗稀释液，PBST漂洗3次，每次5min，再加入DAPI染液，37℃避光染色15~20min。染色结束后，吸弃DAPI染液，PBST漂洗3次，每次2~3min。D.封片方法同3.1.4.1（细胞核损伤检测）。4.1.5.3PKC激活剂、抑制剂对SVCV的作用方法同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。药物处理组为0.1~1nMStaurosporine59 和1~10μMPMA，分别选取24、28h收取样品总RNA，用qRT-PCR检测SVCVG蛋白的相对表达量。4.1.5.4PKC激活剂、抑制剂对Nrf2蛋白、PKCα/β蛋白的作用方法同4.1.8（Nrf2蛋白表达、磷酸化及核转运检测），不含病毒感染组。4.1.5.5香豆素C4对PKCα/β亚基磷酸化和HO-1表达的作用（1）Westernblot检测PKCα/β亚基磷酸化方法同4.1.8.2（Westernblot检测）。（2）qRT-PCR和Westernblot检测HO-1表达方法同4.1.8.1（Nrf2基因表达检测）和4.1.8.2（Westernblot检测）。4.1.5.6RNA干扰及干扰素表达检测（1）siRNA的设计、合成本实验中用到的siRNA序列同邵军辉（2016），由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，序列为：siHO-1sense-GCUGAUCAAAGCUGCGACUTT，antisense-AGUCGCAGCUUUGAUCAGCTT。（2）siRNA转染根据脂质体2000（InvitrogenTM）转染试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：A.将EPC细胞以密度为5×104/孔接种于24孔细胞培养板中，25℃培养至60~70%单层细胞时准备转染。B.配置转染液：取两个无菌无酶的1.5mLEP管，一管中加入100μL无血清OPTI-MEM培养基和2μL脂质体2000，混匀，室温静置约5min。另一管加入100μL无血清OPTI-MEM培养基和终浓度为100nM的siRNA，混匀，室温静置约5min。C.将上述两管混合液混匀，室温静置20min。在静置期间，吸除24孔板中的培养基，用无血清OPTI-MEM培养基洗涤2次。D.吸除上述洗涤培养基，将200μL混合液滴加到细胞层，再补加800μLOPTI-MEM培养基，轻摇后将细胞培养板置于25℃培养箱中培养6h，最后更换为细胞维持液、病毒稀释液或新鲜配置的香豆素C4继续孵育EPC细胞24~48h。E.按2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）方法提取各样品总RNA，检测相应基因的表达量。（3）干扰素表达检测A.细胞样品的采集、总RNA的提取、反转录PCR以及qRT-PCR检测同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。B.以β-actin为内参、反转录产物为模板，利用qRT-PCR检测各样品中干扰素基因的表达情况，引物序列如表4-2所示（Lietal.2016），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，循环40次；熔解曲线分析，65℃至95℃，每步5s。总体积为15μL的60 反应体系如表2-4所示。利用2-△△Ct法分析实时定量数据。表4-2引物序列Table4-2Sequencesofprimerpairs基因名称引物序列（5'—3'）GenesPrimersequences(from5'to3')IFNForwardATGAAAACTCAAATGTGGACGTAReverseGATAGTTTCCACCCATTTCCTTAARIGForwardTGCTGGACCGGATGTGTTATCTReverseTGGTGATCGATGGTTCGATTCTISG15-2ForwardGCCTGGTATCACAGACAGReverseACATCTTGCACTGACATAMAVSForwardGAATGTCCCTGTCCGAGAAAReverseTCTGAACATGCTCGTTTGCAG4.2结果与分析4.2.1香豆素C4对SVCV感染过程的作用结果病毒识别实验结果显示香豆素C4处理组的病毒G蛋白相对表达量与对照病毒组无差异，甚至略有升高（图4-1A）；利用吉姆萨染色，我们观察发现SVCV诱导的细胞融合率均超过50%，而C4在3个时间段的处理均未降低SVCV诱导的细胞融合（图4-1B）。下一阶段的时间梯度检测发现C4在4~6h、6~8h和10~12h显著地降低SVCVM和P蛋白的表达水平，相对表达率分别为60.6%-46.2%、51.7%-50.3%和44.1%-45.6%（M-P）（图4-4C）。与此同时，C4被发现在2~4h（病毒吸附阶段）和8~10h（疑似病毒释放阶段）对SVCV各结构蛋白表达无作用。上述3个实验结果说明香豆素C4在SVCV感染前期无抗病毒作用，药物发挥抑制病毒作用主要发生在病毒复制期，而这有可能与EPC细胞相关的抗病毒反应有关。A61 BC图4-1香豆素C4对SVCV吸附EPC细胞（A）、SVCV诱导细胞融合（B）和不同时间点病毒增殖（C）的作用。红色线圈代表合胞体，融合比例依据下列公式：（合胞体内细胞核数目/总细胞核数目）×100，每个孔统计计算200个细胞核。时间梯度实验中各处理组的蛋白相对表达倍数均与对照组作比（对照组设为1）和比较差异。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure4-1EffectofcoumarinC4onbinding(A),SVCV-inducedfusion(B)andtimeofaddition(C).Redlinesdenotesyncytia.About200nucleiperwellwerecounted.Percentageoffusionwascalculatedasthe(numberofnucleiinsyncytia/totalnumberofnuclei)×100.Therelativeexpressionsoftreatmentsarerepresentedasfoldinductionrelativetotheexpressionlevelincontrolcells(setto1).Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.62 A63 4.2.2抗氧化酶活性及ROS检测结果图4-2A结果显示，SVCV感染的EPC细胞内荧光强度有了明显的增强，这说明胞内的ROS含量上升较为显著；而经过C4处理的细胞内部荧光与对照组相比较为一致，几乎无荧光。上述结果显示出SVCV对EPC细胞造成的氧化损伤，也反映了C4具有极佳的抗SVCV-氧化作用。在图4-2B中，我们发现加入C4后，随着药物浓度的增加，各处理组的细胞GSH含量呈上升趋势，其中，在C4浓度为0.1~1mg/L时，处理组与对照组的数据差异不显著；但是随着浓度上升至10mg/L，24和48h处理组的GSH含量分别升至53.8和49.8μmol/gpot，明显高于对照组，分别为是对照组的1.4倍（24h）和1.2倍（48h）。另外，本实验发现C4同样提高了EPC细胞内SOD和CAT酶活性，使其整体上升趋势同GSH。综上所述，香豆素C4具有良好的抗氧化作用，可保护EPC细胞免受SVCV导致的氧化损伤。B图4-2香豆素C4对SVCV诱导生成的ROS（A）以及EPC细胞内GSH含量、SOD和CAT酶活性（B）的作用。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure4-2EffectofcoumarinC4onSVCV-inducedROSproduction(A),andGSHcontent,SODandCATactivityinEPCcells(B).Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.4.2.3Nrf2表达及核转运检测结果对经过0.1~10mg/L香豆素C4处理的细胞RNA样品进行qRT-PCR检测，结果显示出药物处理后Nrf2基因表达出现不同的变化：相比于对照组，10mg/LC4处理使Nrf2的转录水平在24h上升1.5倍，在48h超出对照组0.9倍（图4-3A）。Westernblot分析表明SVCV在24h内显著增加Nrf2基因的表达水平，并激活Nrf2蛋白入核（图4-3B和C），这个结果与杨毅（2014）的研究相类似。随着SVCV感染时间至48h，Nrf2总蛋白表达水平表现出显著的下降趋势，入核蛋白量较24h减少约42%；总蛋白磷酸化水平与对照组相比明显降低，仅为46%。这个结果表明SVCV在感染前期通过氧化应激提高Nrf2蛋白表达水平，虽然促进其核转运，但被激活的Nrf2的强度不足以清除胞内积累的ROS。事实上，SVCV诱导细胞产生的ROS在病毒感染后36h即达到顶峰（Liuetal.2017），随着感染时间到病毒感染后期，SVCV转而通过抑制Nrf2蛋白表达、降低64 蛋白磷酸化水平发挥自身持续增殖、感染的能力，这有利于新装配成熟的病毒粒子释放，感染周围其他细胞。与此同时，实验结果证实了C4不仅激活了Nrf2总蛋白的表达，而且通过促进其Ser40的磷酸化水平进一步推动Nrf2蛋白的入核，发挥后续抗病毒功能。其中在48h，10mg/LC4导致Nrf2入核量接近对照组的4倍，磷酸化程度接近2.5倍。免疫荧光实验结果也显示出上述的现象（图4-4），即C4处理组细胞核内Nrf2蛋白量和磷酸化的荧光强度相比对照组有了明显上升。ABC图4-3香豆素C4对Nrf2蛋白表达、磷酸化程度和核转运量的影响。（A）qRT-PCR分析Nrf2基因表达水平；（B和C）Westernblot分析Nrf2蛋白表达以及磷酸化水平。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure4-3EffectofcoumarinC4onexpressionandtranslocationofNrf2andphosphorylatedNrf2.(A)Nrf2mRNAexpressionswereanalyzedbyqRT-PCR.(BandC)Thetotalamountandphosphorylation65 levelofcellularandnuclearNrf2proteinwereanalyzedbyWesternblotting.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.AB66 CD图4-4免疫荧光检测Nrf224（A-B）和48（C-D）h蛋白表达及核内定位。Figure4-4ImmunocytochemistrystudyofcellsshowedintracellularexpressionandlocationofNrf2at2467 (A-B)and48(C-D)h.4.2.4PKC激活剂和抑制剂抗SVCV检测结果PKC激活剂PMA在48h内对感染SVCV的EPC细胞的保护作用如图4-5A所示。经过10μMPMA处理后，感染SVCV的细胞保持了良好的细胞形态，呈不规则多边形、单层密集排列的状态。而经过PKC抑制剂Staurosporine处理后，感染SVCV的细胞出现明显的病变现象，与病毒对照组相比基本一致，甚至局部病变程度已超过对照组，即细胞收缩边缘，数量急剧减少，细胞单层呈破渔网状，明显丧失生长活力。经过CCK-8检测，PMA处理EPC细胞后的细胞活力较SVCV对照组显著提高了12~41%。PMA和Staurosporine对SVCV在EPC细胞内增殖的影响如图4-5B所示。结果显示PMA强烈抑制SVCV的复制，在24h时对SVCV最高抑制率达到14.6%，48h时为18.1%；相反的是，Staurosporine促进SVCV增殖，48h处理组与病毒组相比，SVCVG蛋白表达量升高了2.4倍。除此之外，流式细胞术在48h检测出相类似的结果（图4-5C）：10μMPMA显著地降低病毒感染后的细胞凋亡率，正常细胞率升高至73.3%；而Staurosporine则相对应的提高了SVCV感染后的细胞凋亡率，正常细胞率下降至26.9%。综上所述，PKC在SVCV感染宿主细胞过程发挥积极的抗病毒作用。A68 BC图4-5PMA和Staurosporine对SVCV感染后EPC细胞形态学和细胞活力（A）、G蛋白相对表达量（B）以及细胞凋亡率（C）的作用。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01,*P<0.05。Figure4-5EffectofPMAandStaurosporineonSVCV-inducedmorphologicalchangeandcellviability,therelativeexpressionofGprotein,andapoptoticrate.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.4.2.5PKC激活剂和抑制剂对Nrf2蛋白和下游靶基因HO-1表达的作用结果与香豆素C4对Nrf2蛋白表达和核转运作用相类似，PMA在24h时显著地提高了Nrf2蛋白的转录水平，分别比对照组高出77%和132%；相反的是，Staurosporine在24和48h均抑制了Nrf2基因的表达（图4-6A）。另外，PMA通过增强总Nrf2蛋白磷酸化水平激活其入核，而Staurosporine在总蛋白水平具有抑制Nrf2蛋白磷酸化作用，从而在一定程度上减少Nrf2蛋白入核量（图4-6B和C）。上述实验结果说明鱼类细胞中PKC和哺乳动物细胞类似，同样可以通过磷酸化Nrf2Ser40位点促进Nrf2蛋白与Keap1分离，增加Nrf2细胞核内含量。此外，我们研究发现10μMPMA处理EPC细胞后，Nrf2-69 ARE通路下游靶基因之一的HO-1表达出现显著地上调，分别达到对照组的237%（24h）和184%（48h）；而在加入1nMStaurosporine后，细胞内HO-1的表达量出现一定程度的下降，分别为对照组的64%（24h）和65%（48h）（图4-6D）。ABC70 D图4-6PMA和Staurosporine对Nrf2蛋白和HO-1表达的影响。（A）实时定量分析Nrf2基因表达水平；（B和C）Westernblot分析Nrf2蛋白表达以及磷酸化水平；（D）实时定量分析HO-1基因表达水平。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure4-6EffectofPMA和StaurosporineonexpressionsofNrf2andHO-1.(A)Nrf2mRNAexpressionswereanalyzedbyqRT-PCR.(BandC)ThetotalamountofcellularandnuclearNrf2proteinwereanalyzedbyWesternblotting.(D)Nrf2mRNAexpressionswereanalyzedbyqRT-PCR.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.4.2.6香豆素C4对PKCα/β亚基磷酸化的作用结果如图4-7所示，Westernblot检测发现香豆素C4从不同程度上提高了PKCαThr638和PKCβSer660两个位点的磷酸化水平，尤其是PKCβ亚基，在24和48h磷酸化程度图4-7香豆素C4对PKCα/β亚基磷酸化程度的影响。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。71 Figure4-7EffectofcoumarinC4phosphorylatedPKCα/β.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.分别提高了69%和128%。值得注意的是，SVCV对PKCαThr638位点磷酸化作用较强，其在24h可显著提高PKCα磷酸化水平，而48h时为抑制作用。由于SVCV对Nrf2蛋白磷酸化的作用也存在相似的变化趋势，因此，SVCV可能主要通过PKCα亚基对Nrf2蛋白进行调控。4.2.7香豆素C4对HO-1表达的作用结果在EPC细胞中加入10mg/L香豆素C4后，我们发现药物处理组的HO-1基因表达出现了显著的上升，分别为对照组的188%（24h）和223%（48h）；在病毒组的EPC细胞中加入C4后，HO-1的表达同样表现出明显的上调，分别为病毒的192%（24h）和184%（48h）（图4-8A）。而Westernblot检测表现出相似的结果（图4-8B），即HO-1蛋白表达量在C4处理下升高。对于SVCV感染组细胞的HO-1表达，我们在转录水平上并未观察到明显的变化，仅仅在翻译水平出现一定程度的表达量下降。AB图4-8香豆素C4对HO-1表达的影响。（A）qRT-PCR分析HO-1基因表达水平；（B）Westernblot分析HO-1蛋白表达水平。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure4-8EffectofcoumarinC4onHO-1expression.(A)HO-1mRNAexpressionswereanalyzedbyqRT-PCR.(B)ThetotalamountofHO-1proteinwereanalyzedbyWesternblotting.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.4.2.8siHO-1对干扰素表达的作用结果如图4-9A所示，siHO-1具有明显的敲降效果，HO-1表达降低比例达到68.3%（24h）和55.6%（48h）。在基因敲降的基础上，用SVCV感染EPC细胞，24~48h测定结72 果显示，SVCV-G基因转录相对于对照组分别增加2.1和3.8倍，这说明HO-1对SVCV增殖具有一定抑制作用。进一步的实验结果揭示HO-1基因表达量下降能够影响EPC细胞内干扰素基因的表达，使其在24和48h出现不同程度的下调（图4-9B）。AB图4-9qRT-PCR检测siHO-1处理后EPC细胞内SVCVG蛋白（A）和干扰素基因（B）的表达。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure4-9TheexpressionofSVCVGproteinandIFNsinEPCcellsaftersiHO-1treatmentwasdetectedbyqRT-PCR.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.4.2.9香豆素C4对干扰素基因表达的作用结果SVCV和香豆素C4处理EPC细胞后干扰素基因的相对表达变化情况如图4-10所示。结果发现在SVCV感染后，各干扰素基因均出现不同程度的上调，尤其是IFN表达的变化，在24、48h表达值分别达到对照组的11和8倍。另外，RIG、ISG15-2和MAVS基因在48h表达上调变化也极为显著。相比于病毒组，C4处理后细胞中干扰素的相对表达值均低于SVCV感染组，但与对照组相比，各基因的表达同样出现显著地增加。73 图4-1010mg/L香豆素C4对干扰素基因表达的作用Figure4-10EffectofcoumarinC4attheconcentrationof10mg/LontheexpressionofIFNs4.3讨论本章研究结果首先发现香豆素C4在SVCV感染前期对病毒侵入宿主细胞以及遗传物质从晚期内吞泡释放进入细胞质无作用，抗病毒过程主要发生在SVCV各结构蛋白转录、翻译及组装的过程中，因此宿主细胞的一系列抗病毒反应也将参与到药物抗病毒过程中。结合香豆素药物的抗氧化特点，我们认为香豆素C4在抑制SVCV增殖过程中对宿主细胞的抗病毒Nrf2通路的诱发作用是至关重要的，可作为药物抗病毒机制的关键研究。4.3.1Nrf2-ARE信号通路与病毒的关系Nrf2-ARE信号通路介导的氧化应激系统是生物体抵抗外源性异物刺激的核心适应性保护反应（李冰2012；Buelna-Chontaletal.2014）。而作为病毒感染过程中重要的致病机制之一，SVCV诱导宿主细胞产生大量ROS，导致机体出现氧化损伤，从而启动Nrf2抗病毒反应（Shaoetal.2016）。作为一种普遍存在的转录因子，许多研究发现不同病毒感染宿主细胞后都可影响Nrf2的表达，例如单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）、HBV、莫洛尼（氏）鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus，MoMuLV）和IAV等在感染宿主过程中都可激活Nrf2通路，上调各种与抗氧化系统相关的基因的表达和酶的活性，以缓解病毒引起的氧化损伤（Kosmideretal.2012；Qiangetal.2004；Schachteleetal.2012；Stephanieetal.2010）；而HCV、RSV以及人类偏肺病毒（humanmetapneumovirus，hMPV）等病毒通过抑制Nrf2通路的开启来下调Nrf2下游一系列的抗氧化反应，从而有利于病毒自身的扩增、传播（Chenetal.2013；Hosakoteletal.2011；Monicaetal.2011；Sulimanetal.2001）。一些研究发现SVCV感染过程中能够快速诱导ROS在胞内产生，改变SOD、CAT和POD等抗氧化酶的活性，并提高蛋白质羰基含量和8-羟化脱氧鸟苷（8-OhdG）水平，最终对宿主细胞造成强烈的氧化损伤（黄建2015）。74 另外的研究结果显示，为了响应SVCV触发的ROS，Nrf2通路在激活过程中有效地抑制SVCV增殖，保护了宿主细胞免受SVCV侵染（Shaoetal.2016）。依据上述研究的结果，本实验发现SVCV在24h内激活Nrf2的表达和增强蛋白核转运量；到了48h，情况发生逆转，其表现为Nrf2表达和核转运都受到病毒的显著抑制，此现象的出现可能与细胞氧化损伤程度和病毒粒子数目在EPC细胞内部的累积有关。此外，我们发现香豆素C4明显增加了Nrf2蛋白在胞内的表达，这将有助于C4利用EPC细胞自身的抗病毒反应控制SVCV在胞内的复制。与此同时，本章实验结果还显示细胞中抗氧化酶的活性在经过C4处理后呈现上升趋势，ROS的含量逐步降低，这说明了C4具有抗氧化的作用，可以通过启动Nrf2通路调控胞内抗氧化酶系统，维持胞内氧化动态平衡。4.3.2PKC对Nrf2-ARE信号通路的调控作用通常情况下，Nrf2Ser40位点的磷酸化会对Keap1蛋白中半胱氨酸残基进行修饰，从而改变Keap1的构象，导致Nrf2的释放、转移至细胞核（Leeetal.2013）。在Nrf2磷酸化过程中，PKC已被多个研究证明在哺乳动物体内通过转录后修饰对Keap1-Nrf2-ARE通路产生影响（BloomandJaiswal2003；Buelna-Chontaletal.2014；Huangetal.2002）。在本章实验中，PKC也被证实能够在鱼类细胞中对Nrf2磷酸化进行调节，并因此对SVCV增殖产生影响。然而，由于PKC包含多个活性亚基，如α、β、γ、δ以及ε等，因此目前关于PKC对Nrf2磷酸化的调节机制尚不清楚。在哺乳动物中，多数的研究集中于PKCδ的位点磷酸化作用（Kayetal.2011；Kimetal.2007；Kimetal.2016）。由于PKCδ参与多种细胞氧化应激反应，因此其也被推测能够靶向Nrf2磷酸化，促进Nrf2通路的激活（Huangetal.2000）。此外，Lee等（2013）报道发现GymnasterkoreayneB可通过PKCαThr638和PKCβSer660两个位点的磷酸化作用对Nrf2通路状态产生作用。近来的一项研究结果表明，PKC的激活剂PMA在1μM浓度处理下增加了PKCα亚基的磷酸化水平，并最终激活Nrf2介导的抗氧化反应（Santofimia-Castañoetal.2015）。而本研究同样发现PMA在10μM浓度下升高Nrf2磷酸化水平、激活其核转运，并且激活下游靶基因HO-1的表达，从而抑制SVCV在EPC细胞内增殖，这个结果说明PKCα亚基可能对SVCV增殖调控的重要性。基于上述猜测，我们通过进一步的研究发现，SVCV能够利用PKCα亚基磷酸化影响Nrf2通路的启动状态，对自身增殖产生积极作用。而香豆素C4类似于GymnasterkoreayneB的作用在发挥抗病毒的过程中利用宿主细胞的PKCα和PKCβ亚基的两个位点磷酸化作用促进Nrf2磷酸化程度，推动Nrf2蛋白入核，启动下游抗病毒通路（如HO-1），从而最终影响SVCV的增殖。4.3.3HO-1的抗病毒作用作为Nrf2通路最重要的下游靶基因之一的HO-1在催化血红素降解过程中所产生的产物具有多种细胞调节功能，尤其是参与抗病毒免疫应答。目前，已知HO-1表达量增加可以干扰多种病毒感染，如HCV（Zhuetal.2008）、HBV（Qiuetal.2010）及HIV75 （DevadasandDhawan2006）等。针对SVCV而言，本章的实验结果和先前的研究都发现，SVCV在EPC细胞内通过抑制HO-1的表达而有助于自身的增殖（Shaoetal.2016；Yuanetal.2012）。HO-1具有的抗病毒作用往往是与干扰素免疫反应相关，其被发现在巨噬细胞内通过与干扰素调节因子3（IFNregulatoryfactor3，IRF3）的相互作用影响病毒感染（Tzimaetal.2009）。值得注意的是，SVCVP蛋白是鱼类TANK-bindingkinase1（TBK1）的底物，可以竞争性抑制IRF3的磷酸化，继而导致IRF3磷酸化水平下降，抑制干扰素的转录表达，使SVCV有效躲避宿主免疫系统，有利于自身增殖（Lietal.2016）。尽管本章实验结果显示SVCV使干扰素基因表达上调，但这更多的是一种细胞自身的应激反应，可能由其他通路信号引起，需要作进一步的研究确定。因此，结合药物和病毒对HO-1的作用结果，我们认为香豆素C4在EPC细胞内抑制SVCV增殖是通过促进HO-1表达进而触发干扰素产生抗病毒反应（图4-11）。图4-11香豆素C4抗SVCV机制示意图Figure4-11SchematicofactionmechanismshowingthatcoumarinC4inhibitsSVCVreplication4.4小结本章研究结果显示香豆素C4在SVCV感染前期对病毒增殖无影响，其抗病毒作用主要是通过促进EPC细胞内总Nrf2蛋白的表达，并利用PKCαThr638和PKCβSer660两个位点的磷酸化作用调控Nrf2Ser40位点磷酸化水平，促进Nrf2蛋白入核量，启动下游靶基因HO-1和干扰素的表达，最终发挥抗SVCV作用。76 第五章香豆素D5对SVCVG蛋白功能的作用研究SVCV基因组共有5个ORFs，分别对应编码5种结构蛋白：核蛋白N、基质蛋白M、磷蛋白P、糖蛋白G和RNA聚合酶L（3’-N-P-M-G-L-5’）（Björklundetal.1996），其中G蛋白基因包含1536个碱基，所编码的蛋白由509个氨基酸残基构成。经过糖基化修饰后，纯化的G蛋白经SDS-PAGE分析后分子量在76~88kDa之间（Hoffmannetal.2002）。作为SVCV主要的免疫原性蛋白，G蛋白是一种典型的跨膜蛋白（Rocheetal.2008），以三聚体的形式位于病毒粒子囊膜表面，呈刺突状，可与宿主细胞表面受体结合，介导病毒的内吞作用。在病毒从宿主细胞释放时，G蛋白会装配在成熟病毒颗粒表面，参与整个出芽过程。由于SVCVG蛋白决定了SVCV的血清学特征，是病毒最重要的抗原和主要的免疫原性蛋白，可以引起宿主的免疫学反应，因此常被用于构建制备各类工程疫苗（Björklundetal.1996；Reschovaetal.2007）。SVCV的G蛋白存在RⅠ和RⅡ两个毒力区域，当中序列的差异会导致不同的病毒毒力，而如果两个区域同时发生突变，病毒毒力将显著降低（Gaudinetal.1999）。另外，不同株的SVCVG蛋白序列存在一定的差异，其遗传变异程度较大，这可能与病毒在不同地区的进化趋势有关。近年来的研究表明SVCVG蛋白除了上述作用外还能诱导宿主细胞发生自噬（Liuetal2015），以及在细胞培养基pH<6.0的情况下发生蛋白构象改变介导细胞融合（Rocheetal.2008）。病毒在感染宿主后会引起相应的多种应答反应，例如细胞凋亡、炎症反应以及氧化应激等，这类反应在一定程度上对调控病毒扩增起到至关重要的作用，也可维持宿主细胞处于正常的生理状态（EverettandMcFadden1999；Ferrarietal.1990；Kashetal.2006）。目前，抗病毒药物可以分为免疫/IFN诱导剂、蛋白酶抑制剂和直接病毒抑制剂等三大类型（DeClercq2005；Guoetal.2010；PatickandPotts1998）。其中免疫诱导剂是药物通过激活宿主免疫反应尤其是IFN的表达来实现清除病毒作用（Leyssenetal.2003；Shibinskayaetal.2010）；蛋白酶抑制剂则主要利用其对病毒复制过程中专一酶的活性抑制作用发挥抗病毒感染功效（Supuranetal.2003）；直接病毒抑制剂能够直接作用于病毒粒子或降低病毒的感染力实现对宿主的保护作用（Crottyetal.2001，2002；Guoetal.2010；Kleinetal.2003）。由于宿主抗病毒反应网络系统的复杂性，绝大多数药物都必须通过多种方式的共同作用才能实现清除病毒的目的，而目前关于直接作用病毒粒子的药物报道极少，但因为其具有选择性、直接性和高效性等特点，开发此类药物将具有广泛的应用前景。与第四章研究方法类似，本章首先通过受体结合、细胞融合以及时间梯度实验研究香豆素D5对SVCV感染过程的作用，然后利用超速离心和真核表达实验判断该药物是否通过直接作用SVCVG蛋白的方式达到清除病毒的目的。由于SVCVG蛋白被发现通过Erk-mTor通路参与细胞自噬过程已达到促进病毒增殖的目的，因此我们最后重点77 研究了D5对自噬调控通路Erk-Akt-mTor的调控作用，以期全面了解D5的抗SVCV机制。5.1材料与方法5.1.1细胞和病毒细胞和病毒同2.1.1。5.1.2药物香豆素D5同2.1.2。Erk抑制剂U0126和Sorafenib购自碧云天生物技术，母液均为DMSO配置，浓度分别为10mg/mL和1μM。5.1.3试剂、抗体和仪器本章所用试剂和仪器信息详见附录。抗LC3B（GTX127375）和P62（GTX100685）多克隆抗体购自GeneTex公司；抗Erk1/2（wl01864）、p-Erk1/2（wlp1512）、Akt（wl0003b）、p-Akt（wlp001a）和mTor（wl02477）多克隆抗体购自万类生物科技；抗p-mTor（ab109268）多克隆抗体购自Abcom公司；抗α-Tubulin（AF0001）多克隆抗体和辣根过氧化物（HRP）标记的二抗购自碧云天生物技术。5.1.4香豆素D5对SVCV感染过程的作用5.1.4.1病毒粒子吸附宿主细胞检测实验操作过程同4.1.4（病毒粒子吸附宿主细胞检测）。5.1.4.2细胞融合检测实验操作过程同4.1.5（细胞融合检测）。5.1.4.3Timeofaddition实验操作过程同4.1.6（时间梯度检测）。5.1.4.4超速离心检测（1）用细胞维持液稀释病毒液至1×103TCID50，按体积比1:1加入新鲜配置的0.1~10mg/L香豆素D5，轻轻振荡混匀后25℃分别孵育1、2和4h，对照组加入相应稀释比例的DMSO；（2）孵育完成后，将上述病毒药物混合液转移至超速离心管中，33000g超速离心90min后，小心除去上清，尽量使离心管底部无液体残留；（3）向超速离心管中加入一定体积的新鲜配置细胞维持液，用微量移液器轻柔吹打底部数次后再轻微振荡5~10s，使病毒粒子分散均匀；（4）按照2.1.4（细胞培养、病毒增殖及滴度检测）实验步骤对上述SVCV进行滴度检测；另按照2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）对上述SVCVG蛋白相对表达量进行检测。5.1.4.5SVCVG蛋白真核表达检测78 （1）重组G蛋白真核表达质粒的构建SVCV重组G蛋白真核表达质粒由本实验室设计、构建并保存（Zhangetal.2017）。（2）香豆素D5对重组质粒在EPC细胞内表达的检测根据FuGENE®6TransfectionReagent（Promega）转染试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：A.将EPC细胞以一定密度接种于含爬片的24孔或不含爬片的6孔细胞培养板中，25℃培养至70~80%单层细胞时准备转染；B.将转染试剂用Opti-MEM培养基稀释至一定体积后室温放置5min，然后按照一定比例向培养基中加入pEGFP-G质粒，混合均匀后室温孵育15min，最后将混合液加入到24或6孔细胞培养板中，轻摇后培养板置于25℃培养箱中培养6h；C.吸除上述混合转染液，M199培养基漂洗细胞2~3次后更换为细胞维持液新鲜配置的香豆素D5，25℃继续培养细胞24~48h；D.按照3.1.4.1（细胞核损伤检测）步骤制作细胞爬片，利用倒置荧光显微镜观察；此外，用不含EDTA的胰蛋白酶消化6孔细胞板内EPC细胞，300g离心5min收集细胞样品，用预冷的0.1MPBS洗涤细胞2~3次，添加一定体积的1×BindingBuffer进行细胞的重悬，1h内用流式细胞仪在激发波长为488nm下进行细胞单染检测；E.对6孔细胞培养板中的EPC细胞进行总RNA提取，参照2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）对上述SVCVG蛋白相对表达量进行检测。5.1.5香豆素D5对细胞抗病毒反应的作用5.1.5.1Erk抑制剂对SVCV的作用方法同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。药物处理组为1~5μMSorafenib和1~10μMU0126，分别选取24和28h收取样品总RNA，进行qRT-PCR检测SVCVG蛋白的相对表达量。5.1.5.2自噬检测（1）自噬小体荧光显微镜检测利用自噬测定试剂盒（Sigma）对EPC细胞内自噬小体进行检测，具体步骤如下：A~C同3.1.4.1（细胞核损伤检测）。D.配制吖啶橙染液避光称量一定质量的吖啶橙，用无菌水超声溶解后制成浓度为1mg/mL的吖啶橙母液，4℃避光保存备用，使用时用0.1MPBS稀释成10μg/mL工作液。E.细胞染色自噬测定试剂盒内500×AutoReagent以每20μL混合10mLStainBuffer配成染色工作液。在细胞固定完成后，用0.1MPBS漂洗爬片上细胞2~3次，加入400~500μL/孔自噬染色工作液，25℃CO2培养箱内孵育45~60min，用WashBuffer漂洗细胞爬片79 4~5次，每次2~3min。然后加入吖啶橙工作液，25℃避光染色15min。结束后，回收吖啶橙工作液，0.1MPBS漂洗爬片上细胞4~5次，每次5min。F.封片同3.1.4（细胞核损伤检测）。（2）自噬小体荧光酶标仪检测A.病毒感染及药物暴露同3.1.5.1（细胞表面结构观察）。药物-病毒处理实验结束后，用0.1MPBS洗涤细胞2~3次，用浓度为0.25%的胰蛋白酶消化EPC细胞，然后300g、4℃离心5min收集细胞样品。然后在样品中加入0.1MPBS，反复吹打数次，将各样品细胞按体积分为均匀的两份。B.在其中一份上述细胞样品中加入自噬染色工作液，轻微振荡或吹打细胞，25℃CO2培养箱内孵育45~60min，300g、4℃离心5min，用WashBuffer漂洗细胞爬片4~5次，每次2~3min，最后将取100μL各细胞样品加入96孔板中，在380nm下检测荧光值。C.另一份细胞样品采用CCK-8法检测细胞密度，检测方法2.1.7.2（香豆素对EPC细胞生长活力的作用）。（3）Westernblot分析总蛋白提取、蛋白样品制备的过程和Westernblot检测同4.1.8.2（Westernblot检测）。药物处理组为10mg/L香豆素D5，分别在24、48h收取样品。另外，目的蛋白LC3B和P62在冰浴条件下利用Bio-Rad蛋白转膜槽在电流为200mA时转膜时间分别为30min和1h40min。5.1.5.3Erk抑制剂对Akt-mTor通路蛋白磷酸化的作用利用Westernblot检测Sorafenib和U0126对EPC细胞Erk1/2、Akt和mTor蛋白磷酸化作用，方法同4.1.8.2（Westernblot检测）。目的蛋白Erk1/2、p-Erk1/2、Akt、p-Akt、mTor和p-mTor在冰浴条件下利用Bio-Rad蛋白转膜槽在电流为200mA时转膜时间为50~300min。5.1.5.4香豆素D5对Erk和Akt-mTor磷酸化的作用利用Westernblot检测香豆素D5对EPC细胞Erk1/2、Akt和mTor蛋白磷酸化作用，方法同4.1.8.2（Westernblot检测）。目的蛋白Erk1/2、p-Erk1/2、Akt、p-Akt、mTor和p-mTor在冰浴条件下利用Bio-Rad蛋白转膜槽在电流为200mA时转膜时间为50~300min。5.2结果与分析5.2.1香豆素D5对病毒感染过程的作用结果与香豆素C4的抗病毒作用不同的是，香豆素D5可对SVCV识别EPC细胞受体产生影响。实验结果显示SVCVG蛋白相对表达量在10mg/LD5处理下显著下降55%（图80 5-1A）。而在细胞融合过程中，D5处理后细胞融合率在3个处理时间点与对照组相比均出现不同程度下降，尤其是4h，细胞融合率由对照组的52.8%减少至11.8%（图5-1B）。我们认为这个结果主要与香豆素D5在EPC细胞内的代谢过程有关（详见2.2.6）。由于G蛋白主要参与SVCV感染宿主细胞的前期结合-融合过程，因此，基于上述两个实验，我们认为香豆素D5能够对SVCVG蛋白功能产生有效的抑制作用。进一步的时间梯度研究结果表明：D5处理组的G蛋白表达在最初的2~4h受到显著地抑制，表达率仅为对照组的31%（图5-1C），这同样说明香豆素D5主要在SVCV感染前期发挥抗病毒作用。AB81 C图5-1香豆素D5对SVCV吸附EPC细胞（A）、SVCV诱导细胞融合（B）和G蛋白表达（C）的作用。红色线圈代表合胞体。红色线圈代表合胞体，融合比例依据下列公式：（合胞体内细胞核数目/总细胞核数目）×100，每个孔统计计算200个细胞核。时间梯度实验中各处理组的G蛋白相对表达倍数均与对照组作比（对照组设为1）和比较差异。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure5-1EffectofcoumarinD5onbinding(A),SVCV-inducedfusion(B)andexpressionofGprotein(C).Redlinesdenotesyncytia.About200nucleiperwellwerecounted.Percentageoffusionwascalculatedasthe(numberofnucleiinsyncytia/totalnumberofnuclei)×100.TherelativeGproteinexpressionsoftreatmentsarerepresentedasfoldinductionrelativetotheexpressionlevelincontrolcells(setto1).Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.5.2.2超速离心检测结果SVCV病毒粒子经过0.1~10mg/L香豆素D5处理后通过超速离心与药物分离，重新感染EPC细胞，在48h后SVCVG蛋白相对表达量和病毒滴度如图5-2所示。与细胞融合检测结果相似的是，在10mg/LD5处理4h后，SVCVG蛋白的表达量减少最为显著，仅为对照组的10%；而在1和2h时间点，G蛋白的相对表达量则分别下降了53%和73%（图5-2A）。AB82 C83 图5-2超速离心分离病毒粒子后，香豆素D5对SVCVG蛋白相对表达量（A）、病毒滴度（B）和细胞病变效应的作用（C）。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。Figure5-2EffectofcoumarinD5ontherelativeexpressionofSVCVGprotein(A),viraltiter(B)andcytopathiceffect(C)weretestedafterultracentrifugation.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.此外，病毒滴度的检测从另一个方面证实了香豆素D5对SVCV感染力的影响，即药物在4h作用后使病毒滴度由106.5±0.1减小到103.4±0.2（图5-2B）。我们利用显微镜观察发现：1~2h10mg/LD5处理的EPC细胞依然可见少量的CPE现象，尽管与对照组相比已显著减少；而经过4h的处理后，EPC细胞形态保持良好，呈单层密集排列，CPE现象几乎不可见（图5-2C）。结合G蛋白在SVCV病毒粒子表面的位置以及病毒识别、增殖过程中的作用，上述结果说明了香豆素D5可能对SVCVG蛋白结构和功能造成一定破坏，从而影响SVCV对EPC细胞的感染力和增殖力。5.2.3香豆素D5对G蛋白重组质粒细胞内表达的作用结果EPC细胞转染pEGFP-SVCVG质粒后，利用流式细胞仪对质粒的表达进行定量的分析，结果如图5-3A所示：对照组的荧光强度明显高于药物处理组，并且随着D5浓度的升高，细胞内表达的G蛋白逐步降低的趋势，其在48h尤为显著。荧光显微镜的结果同样显示：当D5处理经转染的EPC细胞后，虽然仍可观察到G蛋白的荧光表达现象，但是荧光强度相比于纯病毒组较弱，并仅在EPC细胞局部显现。上述两个实验结果均反映了香豆素D5能够有效抑制pEGFP-SVCVG质粒在EPC细胞内的表达，也证实D5对SVCVG蛋白存在一定的作用，从而干扰SVCV的增殖。84 AB图5-3重组质粒表达的荧光检测。（A）流式细胞仪分析；（B）荧光显微镜分析。Figure5-3Fluorescencedetectionofrecombinantplasmid.(A)Flowcytometricanalysis;(B)Fluorescencemicroscopeanalysis.5.2.4Erk抑制剂抗SVCV检测结果Erk抑制剂Sorafenib和U0126在48h内对感染SVCV的EPC细胞的保护作用如图5-4A所示。其中，经过Sorafenib处理后，感染病毒的EPC细胞维持良好的细胞形态，呈不规则多边形、单层密集排列的状态，细胞病变效应与其他处理组相比明显减轻。而CCK-8检测结果显示两种抑制剂均能有效保持已感染SVCV的细胞的细胞活力。图5-85 4B的结果从另一方面证实了CCK-8的检测结果，即Erk抑制剂可以显著抑制SVCV的复制，尤其是抑制剂Sorafenib，其在48h对SVCV最高抑制率超过90%。此外，流式细胞术检测48h细胞凋亡的结果表明：与病毒对照组相比，抑制剂Sorafenib和U0126显著地减弱了SVCV导致的细胞凋亡，其中，Sorafenib的抗细胞凋亡作用要优于U0126，其凋亡率相比于病毒组降低幅度达到35%（图5-4C）。因此，综上所述，抑制剂实验说明了抑制Erk蛋白活性可以在SVCV感染EPC细胞过程发挥积极的抗病毒作用。AB86 C图5-4Sorafenib和U0126对SVCV感染后EPC细胞形态学和细胞活力（A）、G蛋白相对表达量（B）以及细胞凋亡率（C）的作用。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01,*P<0.05。Figure5-4EffectofSorafenibandU0126onSVCV-inducedmorphologicalchangeandcellviability,therelativeexpressionofGprotein,andapoptoticrate.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.5.2.5香豆素D5和Erk抑制剂对细胞自噬的作用结果香豆素D5对SVCV诱导产生的细胞自噬的作用如图5-5所示。荧光检测结果显示：经过D5和Erk两种抑制剂处理后，感染SVCV的EPC细胞内自噬小体的数量和荧光强度在24和48h均明显减少，其中除了U0126病毒组外，D5和Sorafenib药物处理组与对照组相比细胞内部自噬小体荧光强度均不显著（图5-5A和B）。另外，我们通过图5-5C的Westernblot检测结果发现，在SVCV感染后，LC3B-Ⅱ蛋白在两个测试时间点表达量显著增加，而药物处理组的蛋白表达水平在48h没有显著的变化；相对应的是，P62蛋白水平在SVCV感染后同样出现明显的下降。上述结果一方面表明10mg/L的香豆素D5通过降低EPC细胞自噬水平发挥抗病毒作用，较好地维持了EPC细胞在感染SVCV后的生理状态；另一方面，与Liu等（2015）的报道结果相一致的是，Erk1/2蛋白活性受到抑制后，可以对SVCV引起的细胞自噬起到负调控作用。87 A88 89 BC图5-5香豆素D5对SVCV诱导产生的自噬体的作用（A-B）以及Westernblot检测LC3B和P62蛋白的表达水平（C）。Figure5-5EffectofcoumarinD5attheconcentrationof10mg/LonSVCV-inducedautophagosome(A-B)andWesternblotanalysisofLC3BandP62levelsinEPCcells(C).5.2.6香豆素D5和Erk抑制剂对Erk1/2、Akt和mTor磷酸化的作用结果Liu等（2015）的实验结果显示，Erk1/2蛋白的磷酸化作用对mTor的磷酸化水平有负调控作用，而SVCV正是通过活化Erk1/2蛋白抑制了mTor的磷酸化，继而诱导细胞自噬，有助于自身在EPC细胞内的增殖。在本章研究中，结果如图5-6所示，我们首先AB图5-6Westernblot分析Erk、Akt和mTor蛋白表达以及磷酸化水平。数据表示为平均值±标准差，三个平行处理，**P<0.01，*P<0.05。90 Figure5-6ThetotalamountandphosphorylationlevelofErk,AktandmTorwereanalyzedbyWesternblotting.Datarepresentthemeans±SDofonerepresentativeexperimentperformedintriplicate,**P<0.01,*P<0.05.确认Erk1/2的活化对SVCV诱导的细胞自噬具有促进作用；其次，Westernblot检测发现Erk1/2蛋白磷酸化被Sorafenib和U0126抑制后能够提高Akt的磷酸化水平，而在这个过程中，SVCV感染细胞后的Akt磷酸化水平明显低于对照组（总的Akt蛋白表达水平无变化）。由于Akt是mTor的上游调控蛋白，因此，上述结果反映出Akt蛋白在SVCV诱导的自噬过程中同样起到重要的调控作用，即SVCV感染EPC细胞利用Erk1/2活化作用抑制Akt磷酸化，进而通过降低mTor的磷酸化水平达到诱导细胞自噬的作用。此外，本章实验发现感染SVCV的EPC细胞经过香豆素D5处理后，细胞内部Erk1/2的磷酸化水平显著下降，而Akt与mTor的磷酸化则被激活，蛋白表达出现明显升高（图5-6B）。结合前一个实验D5对细胞自噬小体产生的影响，我们认为香豆素D5主要通过降低Erk1/2蛋白磷酸化水平活化Akt-mTor通路，从而对SVCV诱导的细胞自噬产生抑制作用。5.3讨论5.3.1抗病毒药物的作用靶点病毒利用宿主细胞进行自身增殖的主要步骤主要分为以下5个部分：吸附、穿入-脱壳、遗传物质复制、结构蛋白的合成和加工以及病毒粒子的装配和释放。基于上述步骤，抗病毒药物可以通过靶向病毒复制过程中的某一环节发挥抗病毒作用，例如大黄素阻断SARS-CoVS蛋白与ACE2受体的吸附结合发挥抗病毒作用（Hoetal.2007）；金刚烷胺药物分子嵌入流感病毒M2离子通道，封锁氢离子流入，阻止病毒的脱壳过程，最终使流感病毒无法完成后续复制过程（Jacobetal.2016）；阿昔洛韦抗疱疹病毒则主要通过活化的三磷酸盐形式竞争性抑制病毒DNA聚合酶，导致病毒核酸复制终止，发挥抗病毒功效（Bergmannetal.2017）。由于组成结构简单，大多数病毒缺少自身酶系统，其必须依赖宿主细胞的酶系统才能完成自身增殖过程，然而病毒的遗传物质可能整合进入宿主细胞核酸物质中，不易消除，从而造成药物抗病毒效果不理想（陈晓慧2017）。本章研究通过病毒吸附和细胞融合实验首先确定香豆素D5主要在SVCV感染细胞早期阶段发挥抗病毒作用；其次，我们利用超速离心手段将病毒粒子与药物进行分离，结果显示D5降低了SVCV的感染力，而这可能与药物破坏病毒粒子结构有关。由于SVCVG蛋白位于病毒粒子囊膜表面，结构的变化会导致不同的病毒毒力（Gaudinetal.1999），因此我们认为香豆素D5可能特异性靶向G蛋白，通过干扰G蛋白功能发挥抗病毒作用。我们将G蛋白真核表达质粒转染进入EPC细胞，用D5处理后发现药物显著地抑制了G蛋白的表达，这个结果证明D5特异性作用于G蛋白。利用Phyre2在线工具对91 SVCVG蛋白结构进行预测，在SYBYL-X2.0软件中对D5与G蛋白进行对接，结果显示D5与G蛋白对接的氨基酸残基是第71位赖氨酸（LYS71）、第154亮氨酸（LEU154）和第490位酪氨酸（TYR490）（图5-7）。这些预测结果可能揭示了D5对SVCVG蛋白的直接作用，然而，其中的具体机理还需要进一步研究。图5-7香豆素D5与SVCVG蛋白对接模型。（A）对接复合物的3D构象；（B）对接位点。Figure5-7ThedockingmodeofcoumarinD5andGproteinofSVCV.(A)The3Dimageofthepredicteddockingcomplexsubstance;(B)Dockingsite.5.3.2细胞自噬与病毒的关系细胞自噬广泛存在于真核细胞内，是一种由溶酶体依赖性降解途径所介导的、用来清除细胞内受损、衰老细胞器进行自我保护的机制（Nakatogawaetal.2009；XieandKlionsky2007）。生理性自噬有助于细胞的生长发育、分化以及维持细胞内稳态（Lietal.2014；vanderVosetal.2012）。此外，细胞自噬针对病原微生物的侵害对宿主具有保护作用，其能够将存在于胞质内的病毒粒子运送至溶酶体中，降解病毒；也可以通过胞内感受器激活宿主天然免疫系统，并将病毒抗原呈递给MHCⅡ类分子激活适应性免疫，发挥抗病毒作用（陶冶和任晓峰2013）。近些年来，越来越多的研究表明一些病毒可以诱导宿主细胞自噬，并利用细胞自噬达到躲避宿主抗病毒反应的目的（Dornetal.2002；Jacksonetal.2005），例如脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）诱导宿主细胞内自噬小体数量上升而利于自身病毒粒子的释放（Suhyetal.2000；Tayloretal.,2009）；同样的，HCV在细胞内切断自噬小体与溶酶体的融合，促进自噬小体的积累，从而激发HCV的复制（MarlèneDreuxetal.2009；Siretal.2008）。Liu等（2015）研究发现SVCV在感染EPC细胞后能够诱导细胞自噬，更重要的是，SVCVG蛋白在细胞自噬过程发挥重要作用，而自噬的发生有利于促进SVCV的扩增和释放。我们的研究同样发现SVCV诱导的细胞自噬现象：透射电镜照片发现大量受损的线粒体和自噬小体的出现，这将有助于延长细胞存活时间，利于SVCV复制；一旦在病毒感染过程中细胞自噬作用被抑制，SVCV在EPC细胞中的增殖将会受到显著影响，而香豆素D5即具有此抗病毒作用。5.3.3PI3K-Akt-mTor信号通路对细胞自噬的调控作用在细胞中存在多种自噬调控的分子机制，受到主要关注之一的是PI3K-Akt-mTor信92 号通路。PI3K是该信号通路起始因子，含3个亚型；Akt也被称为蛋白激酶B，也包含3个亚型；mTor属于Ser/Thr激酶，包括雷帕霉素敏感型mTORC1和非敏感型mTORC2。其中，mTORC1通过调控ULK1-Atg13-RB1CC1-C12orf44/Atg101复合体的磷酸化水平负调控自噬小体的形成（Wanetal.2014），而mTORC2利用激活Atg1蛋白抑制自噬发生（Chengetal.2013）（参见图5-8）。在PI3K-Akt-mTor通路激活过程中，PI3K首先被激活，催化PIP2转化为PIP3，PIP3活化的PDK1将Akt磷酸化，随后磷酸化的Akt再活化TSC2因子，使其从而TSC1/2复合物中分离，最终激活mTor（TarantinoandCapone2013）。先前的研究表明，SVCV感染EPC细胞通过抑制mTor磷酸化达到诱导细胞自噬的作用，这个过程可被Erk蛋白调控（Liuetal.2015）。目前，有关活化Erk信号通路正向调控自噬的作用逐渐受到人们的重视。实验结果表明Erk信号通路在活化情况下，一方面促进LC3和P62表达上调引起自噬（Kimetal.2014），另一方面可导致LAMP1和LAMP2蛋白表达量下降，阻止自噬小体和溶酶体的结合，防止自噬小体的降解（SivaprasadandBasu2008）。例如倪振洪等（2012）发现左旋棉酚能够激活Erk诱导淋巴瘤细胞发生自噬；王雪和张评浒（2017）研究结果显示薯蓣皂苷对A549细胞、大豆皂苷对HCT-116细胞以及苦参碱对HepG2细胞等均通过活化的Erk通路促进细胞自噬的发生。在本章研究中，我们利用Erk的两个抑制剂研究Erk蛋白对EPC细胞mTor通路和细胞自噬的作用，结果表明Sorafenib和U0126具有抑制Erk1/2蛋白磷酸化的作用，继而增强Akt和mTor的磷酸化水平，抑制细胞自噬的发生。此外，我们发现D5不仅对SVCVG蛋白功能有影响以降低病毒诱导细胞自噬的发生率，并且同样可以通过抑制Erk1/2的磷酸化作用活化Akt-mTor通路，从而发挥抗细胞自噬的作用，阻碍SVCV在EPC细胞内的增殖。图5-8mTor信号通路介导细胞自噬调控模式图（李乐兴和戴汉川2015）。Figure5-8ThesimulatedimageofmTorsignalingpathwaymediatingautophagyregulation.5.4小结本章研究结果显示香豆素D5在病毒感染前期对SVCV增殖有显著的抑制作用，并对SVCVG蛋白功能存在一定影响，可阻碍SVCV识别EPC细胞以及病毒核酸释放入93 细胞质。另外，香豆素D5显著地抑制Erk1/2的磷酸化，激活Akt-mTor通路，减少EPC细胞内自噬小体的数量，最终对SVCV的复制和病毒粒子的释放产生抑制作用。94 第六章香豆素C4、D5在体抗SVCV活性研究前章的研究证实：香豆素C4、D5具有良好的体外抗SVCV病毒活性。为了更进一步系统和全面的反映香豆素C4、D5抗病毒效果和作用机制，本章研究着重从药物体内抗SVCV活性、鱼体干扰素免疫应答以及抗氧化反应方面入手，首先确定C4、D5对斑马鱼的安全用药浓度，然后以感染SVCV的斑马鱼为研究对象，通过注射方式对鱼体内脾脏、肾脏进行病毒及相关生理指标变化的测定，最终确定这两种香豆素在体抗病毒活性，为其今后在实际应用方面提供重要的参考数据。6.1材料与方法6.1.1病毒和实验鱼病毒同2.1.1。斑马鱼（Daniorerio）：性成熟的斑马鱼（4000尾）购自杨凌青青水族观赏鱼店，鱼的全长和体重分别为3.20±0.15cm、0.44±0.07g。斑马鱼在实验室条件下用干燥的红虫（天津水立方宠物饲料有限公司）饲养1个月（温度28.0±1.0℃、pH7.5±0.4、硬度6.3±0.2°DH以及溶解氧7.6±0.4mg/L），光照周期为光照:黑暗=12:12h。实验前一周，将斑马鱼养殖温度下调至18℃，其余养殖条件不变。6.1.2药物香豆素C4、D5同2.1.2。6.1.3病毒攻毒浓度检测用M199细胞培养基稀释SVCV病毒液，根据第二章在EPC细胞中已检测的病毒滴度，配成1×、10×、100×、1000×和10000×TCID50/0.1mL，对斑马鱼按10μL/尾进行腹腔注射，对照组则注射M199细胞培养基。每组40尾斑马鱼，在盛有25L水（已进行紫外消毒）的塑料箱中饲养，保持18℃的水温，溶氧量>6.5mg/L。每隔12h观察并记录斑马鱼死亡情况，直至第14d。6.1.4香豆素C4、D5在体抗病毒活性检测6.1.4.1香豆素C4、D5对斑马鱼保护率检测母液浓度为50mg/mL的香豆素C4、D5用M199细胞培养基稀释至0.25、0.5、1、2、4和8mg/L，每尾斑马鱼腹腔注射10μL稀释药液，每个处理10尾鱼，3个平行，持续7天观察斑马鱼死亡情况，记录分析。根据上述毒性实验结果，选择香豆素C41.0mg/L和D51.0mg/L作为目的浓度，与新鲜配置的100×TCID50的病毒稀释液混合后，立刻用腹腔注射方式对斑马鱼进行注射（10μL/尾，每组共20尾斑马鱼），每12h观察并记录斑马鱼死亡情况，直至第14d。与此同时，另外一组相同处理实验在药物-病毒注射后的第3、6和9天各采集5尾斑马鱼，按10倍单位体重加入M199细胞培养基进行95 冰上组织匀浆，6000g、4℃离心20min后取上清液，依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤，最后按照2.1.4（细胞培养、病毒增殖及滴度检测）方法对病毒滴度进行检测。6.1.4.2香豆素C4、D5诱导干扰素、抗氧化应答检测病毒感染和药物处理同6.1.4。在香豆素后处理的第1、4和7天对斑马鱼进行采样，每个时间点5尾斑马鱼，采集脾脏、肾脏提取总RNA和可溶性蛋白，分别检测SVCVG蛋白的相对表达量、免疫-抗氧化基因的表达和抗氧化酶活力。总RNA提取步骤、反转录和qRT-PCR的体系和详细步骤同2.1.6（香豆素抗SVCV活性初筛检测）。SVCVG蛋白的定量引物参见表2-3，斑马鱼免疫基因的定量引物参见表6-1，实验中以18S基因为内参基因（Varelaetal.2014；Cobbinaetal.2015）。本实验使用GSH测定试剂盒（微板法）（南京建成）、超氧化物歧化酶（SOD）WST-1法测试盒（南京建成）和过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（南京建成）进行检测，实验均按照试剂盒说明书进行操作，产物利用全波段酶标仪进行检测。表6-1引物序列Table6-1Sequencesofprimerpairs基因名称引物序列（5'—3'）GenesPrimersequences(from5'to3')18SForwardACCACCCACAGAATCGAGAAAReverseGCCTGCGGCTTAATTTGACTIFNγForwardATGATTGCGCAACACATGATReverseATCTTTCAGGATTCGCAGGATNFαForwardGCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTAReverseTGTGAGTCTCAGCACACTTCCATCRIG-1ForwardTTGAGGAGCTGCATGAACACReverseCCGCTTGAATCTCCTCAGACIFNφ1ForwardGAGCACATGAACTCGGTGAAReverseTGCGTATCTTGCCACACATTIFNφ2ForwardCCTCTTTGCCAACGACAGTTReverseCGGTTCCTTGAGCTCTCATCSOD(Mn)ForwardCCGGACTATGTTAAGGCCATCTReverseACACTCGGTTGCTCTCTTTTCTCTSOD(Zn/Cu)ForwardGTCGTCTGGCTTGTGGAGTGReverseTGTCAGCGGGCTAGTGCTTGPxForwardAGATGTCATTCCTGCACACGReverseAAGGAGAAGCTTCCTCAGCCCATForwardAGGGCAACTGGGATCTTACAReverseTTTATGGGACCAGACCTTGG6.2结果与分析6.2.1SVCV攻毒模型构建结果斑马鱼感染不同滴度SVCV的生存率如图6-1所示。结果显示斑马鱼在感染102、96 103和104TCID50SVCV的第1天至第2天之间开始出现死亡，最后第14天的累积死亡率分别为55%,75%和100%。相比之下，感染100和101TCID50SVCV的斑马鱼在第3天至第6天之间出现死亡现象，最后的累积死亡率为15%和35%。通过对斑马鱼死亡率和感染的病毒量之间的线性相关关系进行拟合预测，我们预测其线性回归方程为y=21x+14（R2=0.997）。AB图6-1SVCV对斑马鱼致病性。（A）斑马鱼在18℃环境下感染100-4×TCID50SVCV后的生存曲线；（B）斑马鱼死亡率和感染病毒浓度的相关系数，破折线表示线性回归线。Figure6-1PathogenicityofSVCVagainstzebrafish.(A)Survivorshipcurvesofzebrafishintraperitoneally0-4TCID-1injectedwithSVCVat1050fish;(B)CorrelationofzebrafishmortalitiesandinfectedSVCVdoses.ThebrokenlineindicatesaregressionlineformortalityrateandinfectedSVCVdose.6.2.2香豆素C4、D5在体抗病毒活性检测结果香豆素C4/D5在体抗SVCV活性结果如图6-2所示，其中无药病毒感染组的累积死亡率为57.5%；相比之下，C4处理组斑马鱼的累积死亡率减少17.5%，D5处理组减少20%。病毒组的死亡现象持续至第9天，C4和D5处理组的斑马鱼均在第8天停止死亡（图6-2A）。通过对斑马鱼脾脏和肾脏内SVCVG蛋白的表达进行检测，我们发现香豆素C4/D5在注射处理下表现出显著的抗病毒效果，在第1天和第4天两个组织中G蛋白的表达均明显低于无药病毒组。另外，药物对SVCV复制的抑制作用再第1天要比第4天显著，其中，C4处理下脾脏和肾脏中SVCV的相对量分别为病毒组的43%和49%，D5处理下脾脏和肾脏中SVCV的相对量分别为23%和50%（图6-2B）。此外针对全鱼体内病毒滴度的检测发现，药物处理组的病毒感染力在第3天下降显著（图6-2C），而随着感染时间的增长，病毒滴度出现不同程度的上升，这可能与药物在斑马鱼体内的代谢有关。上述实验结果说明，香豆素C4、D5在SVCV感染斑马鱼前期（1~4d）对病毒的扩增能够起到明显的抑制作用。97 ABC图6-2香豆素C4、D5在体抗SVCV活性。（A）感染102×TCID50SVCV的斑马鱼香豆素处理后的生存曲线；（B）斑马鱼脾脏、肾脏中SVCVG蛋白相对表达量；（C）药物处理后斑马鱼体内病毒滴度。Figure6-2CoumarinC4/D5againstSVCVinvivo.(A)Survivorshipcurvesofzebrafishintraperitoneally2TCID-1injectedwithSVCVat1050fishaftercoumarintreatment;(B)TherelativeexpressionofSVCVGproteininspleenandkidneyofzebrafish;(C)Theviraltiterinzebrafishaftercoumarintreatment.6.2.3香豆素C4、D5诱导干扰素基因表达检测结果不同时间处理下香豆素C4/D5对EPC细胞内干扰素相对表达的影响如图6-3所示。香豆素处理细胞1d时，各干扰素基因的表达出现不同程度的上调，其中在香豆素C4处理下，IFNγ和TNFα的表达上调最显著，相对表达值分别达到29.6和39.1；而在香豆98 素D5处理下，IFNφ1上调比例最高，达到39.1。在4d时，除RIG-1外，其余各药物处理组干扰素基因的相对表达与对照组相比无显著性差异。图6-3香豆素C4、D5对免疫基因的相对表达量的作用。Figure6-3EffectofcoumarinC4/D5ontherelativeexpressionofimmunegenes.6.2.4香豆素C4、D5在体抗氧化检测结果香豆素C4/D5对EPC细胞抗氧化系统的作用结果如图6-4所示。病毒感染组和药物处理组的4个氧化基因在1d时都出现显著上升，相对应的，酶的活性也显示了相同的变化趋势。通过对比，我们发现SVCV对斑马鱼肾脏的氧化系统影响较大，酶活性的A99 B图6-4香豆素C4、D5对抗氧化基因的相对表达量（A）和酶活性（B）的作用。Figure6-4EffectofcoumarinC4/D5ontherelativeexpressionofantioxidativegenesandenzymeactivities.变化幅度要超过脾脏组。随着感染时间延长至4d，SVCV对鱼体氧化系统造成明显的损伤，基因的表达和抗氧化酶活性均出现急剧的下降；而通过香豆素注射处理过的斑马鱼维持了相对平衡的氧化反应。上述结果同样说明C4、D5能够在病毒感染前期保护鱼体免受氧化损伤。6.3讨论本章研究通过构建斑马鱼病毒感染模型发现病毒的初始接种量与斑马鱼最终的死亡率之间存在直接联系。利用这个模型，我们可以选择合适滴度的病毒进行后续的实验。尽管由于药物对斑马鱼毒性较高，即香豆素C4和D5在注射情况下的使用浓度（1mg/L）要远低于处理细胞时的活性浓度（10mg/L），实验结果表明这两种药物依然能够显著的降低斑马鱼的死亡率。此外，我们发现斑马鱼在SVCV注射感染的第2天至第5天死亡率急剧上升，这说明病毒在这个时间段内的增殖处于急速增长期，而C4、D5最主要发挥抗病毒作用同样在此时间段内。由于SVCV主要在鱼的脾脏和肾脏增殖（Xiaoetal.2014），因此，对急速增殖期的脾脏和肾脏进行采样分析，有助于我们判断药物对SVCV、鱼体的相关作用。一般情况下，抗病毒药物可以通过激活或调控宿主抗病毒应答、细胞因子和趋化因子等来对病毒增殖产生作用（陈晓慧2017）。本章通过对斑马鱼组织内干扰素相关基因进行检测，判断C4、D5为何在低浓度时仍然具有一定的抗病毒作用。实验结果发现香豆素C4/D5在药物处理后的短时间内可以诱导干扰素表达急剧上升，有助于鱼体在病毒感染前期控制SVCV在脾脏、肾脏的增殖，在一定程度上降低SVCV的100 感染力。第四章的研究结果发现，SVCV诱导EPC细胞产生的ROS对胞内抗氧化系统具有很强的损害作用，而病毒感染引发的氧化损伤又会造成相应的组织损伤（Yuanetal.2012；Yuanetal.2014）。本章研究同样发现SVCV感染斑马鱼在1d时引起脾脏、肾脏中各氧化酶基因表达和活性的显著升高；在4d时，机体的抗氧化水平受到明显的抑制。因此，我们认为病毒感染鱼体一定时间后所产生的氧化压力远远超出机体原有抗氧化系统所能承受的界线，这有可能与病毒在鱼体内的增殖有关。而香豆素C4、D5可以在一定程度上恢复、维持鱼体的氧化平衡，有助于斑马鱼免受SVCV感染造成的氧化损伤。这个结果与前人的研究结果相一致，即含羟基的香豆素有着优良的抗氧化能力（李书慧等2002；倪奕昌等1999；Rajetal.1998）。6.4小结本章实验发现香豆素C4、D5增强斑马鱼鱼体的抗病毒免疫应答，并通过提高鱼体内的氧化酶活性维持被病毒破坏的氧化系统平衡，最终有效降低斑马鱼在感染SVCV后的死亡率。101 结论1.两种新合成的香豆素类化合物7-[4-（苯并咪唑）丁氧基]香豆素（C4）和7-[6-（2-甲基咪唑）己氧基]香豆素（D5）具有抗SVCV活性。2.香豆素C4、D5可有效调控病毒诱导的Caspase凋亡信号的启动，阻止SVCV诱导细胞凋亡的发生，降低病毒对宿主细胞的危害，实现药物对EPC细胞的直接保护作用。3.香豆素C4的抗病毒机制是通过PKCα/β亚基磷酸化作用启动Nrf2-ARE通路，促进下游靶基因HO-1的表达，诱导干扰素表达量升高，最终发挥药物抗病毒作用。4.香豆素D5的抗病毒机制是药物直接作用于SVCVG蛋白，潜在地影响病毒G蛋白功能，并通过降低Erk1/2磷酸化水平以激活Akt-mTor通路，抑制SVCV诱导的细胞自噬，从而发挥药物抗病毒作用。5.香豆素C4、D5具有在体抗病毒作用，在一定程度上降低感染SVCV的斑马鱼死亡率。102 参考文献艾琳,李坚.2004.病毒与细胞凋亡.自然杂志,26(3):78~81安伟,曾令兵,周勇,徐进,范玉顶,肖艺,2011.体外抗草鱼呼肠孤病毒药物筛选细胞模型的建立.中国兽医科学,9:972~978边琪,缪朝玉,楚正绪,苏定冯.2002.第1个反义药物——福米韦生.中国新药与临床杂志,21(5):300~303陈爱平,江育林,钱冬,陈昌福,李安兴,黄捷,杨冰,2010.鲤春病毒血症.中国水产,9:63~64陈晓慧.2017.和厚朴酚抗草鱼呼肠孤病毒活性及其作用机制研究.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学崔颖,郑继方,2010.抗病毒中草药及其活性成分的研究进展.黑龙江畜牧兽医,23:27~29付峰,刘荭,黄倢,蔡生力.2006.鲤春病毒血症病毒（SVCV）的研究进展.中国水产科学,13(2):328~334付云红.2012.鲤春病毒主要结构蛋白的原核表达及P蛋白单克隆抗体的制备.[硕士学位论文].长春:吉林农林业大学郭志勋,李卓佳,管淑玉,冯娟,文国樑.2011.抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)中草药的筛选及番石榴叶水提取物对WSSV致病性的影响.广东农业科学,38(21):129~131何立巍,李祥,陈建伟,2005.板蓝根抗病毒有效成分研究进展.中医药信息,22(5):37~40胡娟娟,杜冠华,2001.药物蹄选模型研究进展.基础医学与临床,21(4):302~305黄昌华,杨天武,肖凤平,林开春.2005.蛇床子素对植物病原菌抑制效果的测定.华中农业大学学报,24(3):258~260黄建.2015.鲤春病毒血症病毒和水霉菌诱导氧化应激发生的研究.[硕士学位论文].武汉:华中农业大学黄琪琰.1993.水产动物疾病学.上海科学技术出版社韩业晶.2014.香豆素及其衍生物的合成方法及其研究进展.广东化工,41(3):74~76韩兴梅,洪敏.1999.6,7—二甲氧基香豆素抗急性肾功能衰竭的作用机制研究.中国药理学通报,15(4):332~335季本安,朱文博,张成飞,姬祥,刘海涛,2017.水产养殖用药存在的问题及中草药的应用前景浅析.水产养殖,38(8):44~46简纪常,吴灶和.2002.中草药对建鲤非特异性免疫功能的影响.大连海洋大学学报,17(2):114~119孔令义.2008.香豆素化学.北京:化学工业出版社,2~4兰树敏,梅清华,林敬明,龚文菲,林茂锐.2010.蛇床子素内酯环完整性对抑真菌活性的影响.中国医药导报,7(24):20~21李冰.2012.Nrf2信号通路及其分子调控机制.国外医学医学地理分册,33(3):148~150李静,白玉梅.2003.病毒感染与细胞凋亡.山西师范大学学报(自然科学版),17(1):82~86李俊超,马杰,曾令兵,范玉顶,徐进,周勇,张辉,2014.抗锦鲤疱疹病毒的植物药物筛选及其效果比较.淡水渔业,3:62~67李乐兴,戴汉川.2015.细胞自噬调控的分子机制研究进展.中国细胞生物学学报,37(2):263~270李林虎,陈莉,夏玉凤.2013.抗肿瘤香豆素类化合物的研究进展.中国药科大学学报44(4):374~379李秋,王珊,2011.抗病毒药物的研究进展.医药导报,30(6),732~735李书慧,吴立军,殷红英.2002.祖师麻化学和药理活性研究进展.中国中药杂志,27(6):401~403103 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附录附录1主要试剂与试剂盒附录1.1本研究中所使用到的主要试剂见表F-1。表F-1试验使用试剂TableF-1Reagentsusedintheexperiments试剂（Reagents）公司（Company）试剂（Reagents）公司（Company）H2SO4西安三浦化工甲醇西安三浦化工冰乙酸西安三浦化工乙醚西安三浦化工石油醚西安三浦化工氯仿西安三浦化工尿素西安三浦化工NaCl西安三浦化工乙酸乙酯西安三浦化工HCl西安三浦化工Tris-HCl索莱宝多聚甲醛天津博迪化工25%戊二醛海曲化工色谱甲醇天津科密欧色谱乙腈天津科密欧氘代氯仿阿拉丁氘代DMSO阿拉丁Trypanblue碧云天生物技术吉姆萨染液Sigma-AldrichIPTGSigma-Aldrich多聚-L-赖氨酸博士德生物DMSO天津天力化学试剂吖啶橙Sigma-Aldrich咪唑Sigma-Aldrich胰蛋白酶Sigma-Aldrich氨苄青霉素Sigma-Aldrich二甲基亚砜Sigma-Aldrich链霉素Sigma-Aldrich焦碳酸二乙酯Sigma-Aldrich胎牛血清ZETA附录1.2本研究中所使用到的分子实验材料和试剂盒见表F-2。表F-2试验使用的实验材料和试剂盒TableF-2Testmaterialsandkitsusedintheexperiments材料/试剂盒（Materials/Kits）公司（Company）ApaI、EcoRI、HindIII、KpnI、XhoI内切酶宝生物工程（大连）有限公司pMD19-T载体（Simple）宝生物工程（大连）有限公司反转录试剂盒、定量PCR试剂盒宝生物工程（大连）有限公司DNaseI（RNaseFree）北京康为世纪生物科技有限公司His标签蛋白纯化试剂盒北京康为世纪生物科技有限公司T4连接酶NEB有限公司pET-28a(+)、pCMV-EGFP(+)Novagen公司FuGENE6转染试剂盒美国Promega公司脂质体2000转染试剂盒美国Invitrogen公司Opti-MEM®I无血清培养基美国Gibco公司M199培养基美国Hyclone公司细胞培养瓶、培养板美国Corning公司大肠杆菌DH5α感受态天根生化科技（北京）有限公司大肠杆菌BL21（DE3）感受态天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒美国MP公司DAB辣根过氧化物酶显色、ECL荧光显色试剂盒天根生化科技（北京）有限公司BCA、SOD、GSH、CAT试剂盒南京建成生物工程研究所Caspase3、Caspase8和Caspase9活力检测试剂盒碧云天生物技术研究所AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒诺唯赞生物技术有限公司120 DiI细胞膜染色试剂盒、DAPI细胞核染色试剂盒碧云天生物技术研究所细胞自噬检测试剂盒Sigma-Aldrich附录2主要仪器本研究中所使用到的仪器见表F-3。表F-3试验使用的仪器TableF-3Instrumentsusedintheexperiments仪器公司型号产地超纯水仪威立雅Classic中国超净台亚泰科隆YT-CJ-2ND中国超声清洗器昆山市超声仪器KQ-500DE中国充气泵海利集团ACO-500中国垂直电泳槽北京六一DYCZ-24DN中国倒置显微镜麦克奥迪实业集团AE30/31中国电磁炉美的C21-SH2131中国电热干燥箱上海市实验仪器总厂1010-3B中国电子天平赛多利斯ALC-1100.2中国电泳仪北京六一DYY-11B中国高速匀浆机良友实验仪器制造厂FSH-2中国核酸分析仪原平皓生物技术NANO-200中国恒温水浴锅特成机械HH-4中国灭菌锅上海精宏DHG-9140A中国水平电泳槽北京六一DYCP-31E中国水浴锅国华THZ-82中国生化培养箱宁波江南仪器厂SPX-280中国脱色摇床北京六一WD-9405B中国微波炉格兰仕WG800CTL23-K6中国微型植物试样粉碎机河北黄骅市新兴电器FZ102中国涡旋振荡器其林贝尔QL-901中国旋转蒸发器亚荣生化仪器厂RE-2000B中国循环水式多用真空泵郑州长城仪器SHB-B95中国多功能酶标仪BioTekSYNERGY美国凝胶成像仪Bio-RadUniversalHood美国PCR仪Bio-RadMyCycler美国qPCR仪Bio-RadCFX-96美国Western电转仪Bio-RadYrdimes美国微量核酸分析仪BeckmanCoulter美国CO2细胞培养箱ThermoForma3131德国-80℃超低温冰箱ThermoForma702德国高速离心机ThermoPico17德国高速冷冻离心机ThermoBiofugePrimoR德国电喷雾质谱仪ThermoLCQFleetTM德国高效液相色谱仪Agilent1260德国正置荧光显微镜LeicaDM5000德国移液器Eppendorf2.5-1000μL德国核磁共振仪BrukerAM500德国电子分析天平岛津AUY220日本数码相机NikonCoolpix995日本光学显微镜奥林巴斯BX41TF日本扫描电子显微镜日立HitachiS-4800日本121 附录3主要试剂盒原理说明1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能清除机体内产生的超氧阴离子等活性氧自由基，保护细胞免受氧化损伤。WST-1即2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四氮唑钠盐，其与黄嘌呤氧化酶（Xanthineoxidase）催化产生的超氧化物阴离子反应，产生甲臜染料（formazandye），该反应步骤可以被SOD所抑制，检测波长是450nm。2.过氧化氢酶（CAT）活性测定：过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢分解，防止机体细胞被过度氧化造成损伤。CAT分解H2O2的反应可以通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，可以计算出CAT活性。3.还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定：机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤生物膜，侵袭生命大分子，加快机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生。谷胱甘肽在人体内的生化防御体系起重要作用，具有多方面的生理功能。它的主要生理作用是能够清除人体内的自由基，作为体内的一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm处测定其吸光度即可计算出GSH的含量。附录4香豆素C4、D5核磁谱图附图1香豆素C4合成路线图Figure1SyntheticrouteofcoumarinC49008508001750HNMRspectrumofcompound1OOOH13CNMRspectrumofcompound1700650600550500450400350300250200150100500-50175170165160155150145140135130125120115110105100959085807570656055504540f1(ppm)附图2香豆素C4合成中化合物1氢核磁共振谱与碳核磁共振谱Figure21HNMRand13CNMRspectraofcompound1insyntheticrouteofcoumarinC4122 7.657.637.387.376.846.846.836.826.806.796.266.244.074.064.053.513.503.492.102.092.072.011.991.980.00162.16161.30155.97143.52128.90113.21112.95112.66101.4367.6133.3429.4027.741HNMRspectrumofcompound213CNMRspectrumofcompound2附图3香豆素C4合成中化合物2氢核磁共振谱与碳核磁共振谱Figure31HNMRand13CNMRspectraofcompound2insyntheticrouteofcoumarinC48.198.157.617.617.607.607.467.447.267.267.257.246.856.846.836.836.806.806.226.204.374.364.344.044.034.022.092.072.061.811.801.801.780.00163.72163.32157.04145.69144.66144.06142.45134.89130.36124.27123.75123.51120.15114.11113.98113.32111.47102.1869.0245.6827.5427.2613HNMRspectrumofcoumarinC413CNMRspectrumofcoumarinC4附图4香豆素C4氢核磁共振谱与碳核磁共振谱Figure41HNMRand13CNMRspectraofcoumarinC4附图5香豆素D5合成路线图Figure5SyntheticrouteofcoumarinD59004500850800OOOH40001750HNMRspectrumofcompound1OOOH13CNMRspectrumofcompound17003500650600300055050025004504002000350300150025020010001501005005000-508.48.28.07.87.67.47.27.06.86.66.46.26.05.85.65.45.25.04.84.64.44.24.03.83.63.43.23.02.8175170165160155150145140135130125120115110105100959085807570656055504540f1(ppm)f1(ppm)附图6香豆素D5合成中化合物1氢核磁共振谱与碳核磁共振谱Figure61HNMRand13CNMRspectraofcompound1insyntheticrouteofcoumarinD5123 1300045012000OOO400BrOOO11000Br1HNMRspectrumofcompound21335010000CNMRspectrumofcompound290003008000250700060002005000150400030001002000501000008.07.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0165160155150145140135130125120115110105100959085807570656055504540353025f1(ppm)f1(ppm)附图7香豆素D5合成中化合物2氢核磁共振谱与碳核磁共振谱Figure71HNMRand13CNMRspectraofcompound2insyntheticrouteofcoumarinD51500014000250OOO13000NN12000OOON20011000N1HNMRspectrumofcoumarinD51000013CNMRspectrumofcoumarinD590001508000700060001005000400030005020001000008.07.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0160150140130120110100908070605040302010f1(ppm)f1(ppm)附图8香豆素D5氢核磁共振谱与碳核磁共振谱Figure81HNMRand13CNMRspectraofcoumarinD5附录5琼脂糖凝胶电泳DNA回收使用天根（TIANGEN）公司通用型DNA纯化回收试剂盒（目录号：DP214）纯化PCR产物，依据说明书其操作步骤如下：（1）柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。（最好使用当天处理的柱子）。（2）将单一DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的1.5mL离心管中，称取重量。（3）向胶块中加入等倍体积溶液PC（若凝胶重0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPC溶液）。（4）50℃水浴10min左右，并不断轻轻摇动离心管，至充分溶解。（若胶块体积过大，可事先将其切成碎块）。（5）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。124 （6）加入600μl漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，弃废液（若回收的DNA用于盐敏感实验，例如直接测序或平末端连接试验，建议加入PW后静置2~5min再离心）。（7）重复步骤（6）。（8）12000rpm离心2min，除尽残余漂洗液。然后打开离心管盖子置于室温数分钟，彻底晾干。（9）将吸附柱CB2放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中央悬空滴加40μl的洗脱缓冲液EB（67℃水浴预热），室温放置2min后，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。（为提高回收效率，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放2min，12000rpm离心2min。最后为防止DNA降解，DNA产物应保存在-20℃）。附录6转化感受态细胞及阳性克隆的筛选（1）超净台上将10μl连接产物加入到100μl的E.coliDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。（2）42℃水浴热激90s，勿摇动，迅速冰上放置5min。（3）超净台上加入400μl无抗LB培养基，于37℃振荡培养60min左右（设置摇速180rpm）。（4）超净台上吸取100μl菌液均匀涂布在LB琼脂平板（含有100μg/mL氨苄青霉素或者卡那霉素）上，于37℃温箱正置20~30min后，将平板倒置培养16~20h。（5）无菌环境下挑取单克隆并稀释于40μl的ddH2O中，混匀后用菌液PCR法筛选阳性克隆。（6）选择其中3个阳性克隆，37℃摇菌培养6~10h之后送测序。125 致谢年华似水匆匆一瞥，多少岁月轻描淡写，不知不觉中我的学生生涯即将画上句号。回首十年在这杨凌小镇所经历的一切，恍若昨日，只轻叹那流年，弹指一笑间。曾经的我带着朦胧的梦想来到这里，喜悦而仿徨；而如今，那个曾经的梦想已在走走停停的日子里渐行渐远，唯留下一段难以磨灭的记忆，激荡在心间。蓦然回首处，早已没了旧事的踪迹，只留下离别的怅惘。人生最好的青春年华，我把它留在这里。终于为了那句“读万卷书，行万里路”，我也即将离开这个地方，去看看外面的世界，感悟全新的生活。十年的读书奋进中，虽然不像他人所讲的尽心竭虑，却也颇为耗费精神。若无良师益友的提携、帮助、扶持，想要从中淬炼出自己的多彩人生，必是十分艰难。每念如此，我即心有暖意，这一路走过，也心存感激。首先衷心感谢我的恩师王高学教授。博士论文从最初的选题、设计、试验、结果分析到最后定稿无不倾注着恩师的心血与汗水。恩师渊博的知识、严谨的科学态度、敏锐的观察力和开阔的思维，以及对事业的执着追求都将使我终生难忘，并时时鞭策我努力工作，在科学研究的道路上奋发向上。恩师这三年的教诲和指导不仅使我拥有了科学的思维方式，掌握了基本的科研方法，更重要的是明白了许多待人接物与为人处世的道理。对恩师这些年对我学术上的精心指导与生活上的关怀表示最崇高的敬意和最衷心的感谢！同样感谢凌飞教授和朱斌副教授在试验设计和论文写作过程中对我的建议、指导和帮助；感谢水产科学系的刘小林教授、王在照教授、吉红教授等在我开题论证和中期考核过程中提出的宝贵意见，使我的试验工作得以顺利开展；感谢水产科学系的各位任课老师，王立新副教授、刘海侠副教授、周继术老师、王涛老师、李杨老师、熊冬梅老师，正是有了他们的认真负责、悉心帮忙和支持，才使我能够很好的掌握和运用专业知识，并在试验中得以体现。特别感谢刘广路师兄，没有他合成的香豆素类化合物，我将无法顺利完成博士论文。当然，也十分感谢这些年来陪我一起度过的各位同门，余小波师兄、郝凯师兄、陈晓慧师姐，以及胡洋、朱松、黄爱国、单立鹏、戚晓舟、涂笑、宋晨光、薛明洋、张晨、吴小虎、宋凯歌、沈毓峰、查继伟、张雨、陈伟超、罗飞、赵昭、李健、崔海博等师弟们在实验中给予我的无私帮助，更感念他们与我一起分享这段灿烂的日子，与他们并肩而战的经历将是我人生中最难以忘怀的记忆！感谢大连海洋大学李强教授和中国水产科学院长江水产研究所曾令兵研究员在提供病毒毒株和细胞上给予的帮助！感谢西北农林科技大学化学与药学院李定老师在3D-QSAR和Docking实验中提供的帮助！最为感谢父母一直以来对我的支持和鼓励，他们的理解是我最为坚强的后盾，他们的期望是我读书奋斗的最大动力！感谢陈忱老师和高建操博士，是他们十年的陪伴，让126 我明白岁月匆匆，唯友情永蓄意中；特殊的谢意送予高晴老师，是她在我大学生涯的末尾带回最初的记忆，使我明白此时的离开只为梦想的开始，终有一别，未辜负相遇。在此向论文评阅和答辩委员会的老师们致以最衷心的谢意！感谢你们能在百忙之中抽出时间对我的论文进行审阅和提出宝贵的建议！也谨以此文，感谢培育我的母校——西北农林科技大学！最后，坦坦荡荡，潇潇洒洒，收拾行囊，挥手辞别，扬帆远航！刘镭2018年03月于陕西杨凌127 作者简介一、个人基本信息姓名：刘镭性别：男出生年月：1989年05月籍贯：河南武陟教育经历：2015年9月--2018年06月：西北农林科技大学水生生物学，获理学博士学位；2012年9月--2015年06月：西北农林科技大学水生生物学，获理学硕士学位；2008年9月--2012年06月：西北农林科技大学水产养殖学，获农学学士学位。二、博士期间发表论文情况（1）LeiLiu,YangHu,Yu-FengShen,Gao-XueWang*,BinZhu*.Evaluationonantiviralactivityofcoumarinderivativesagainstspringviraemiaofcarpvirusinepitheliomapapulosumcyprinicells.AntiviralResearch144(2017),173-185.(IF:4.27)（2）LeiLiu,XiaoTu,Yu-FengShen,Wei-ChaoChen,BinZhu*,Gao-XueWang*.ThereplicationofspringviraemiaofcarpviruscanberegulatedbyreactiveoxygenspeciesandNF-ĸBpathway.Fish&ShellfishImmunology67(2017),211-217.(IF:3.15)（3）LeiLiu,Yu-XinGong,Guang-LuLiu,BinZhu,Gao-XueWang*.ProtectiveimmunityofgrasscarpimmunizedwithDNAvaccineagainstAeromonashydrophilabyusingcarbonnanotubesasacarriermolecule.Fish&ShellfishImmunology55(2016),516-522.(IF:3.15)（4）LeiLiu,,Guang-LuLiu,FeiLing,Xin-YangLiu,KunHu,Xian-LeYang,Gao-XueWang*.InhibitionofdioscinonSaprolegniainvitro.FEMSMicrobiologyLetters362(2015),fnv196.(IF:1.77)（5）Yu-FengShen,LeiLiu,Wei-ChaoChen,YangHu,BinZhu,Gao-XueWang*.Evaluationontheantiviralactivityofarctigeninagainstspringviraemiaofcarpvirus.Aquaculture483(2018),252-262.(IF:2.57)（6）YangHu,LeiLiu,Guang-LuLiu,XiaoTu,Gao-XueWang*,FeiLing*.SynthesisandanthelminticactivityofarctigeninderivativesagainstDactylogyrusintermediusingoldfish.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters27(2017),3310-3316.(IF:2.45)（7）XiaoTu,LeiLiu,Xiao-ZhouQi,Wei-ChaoChen,Gao-XueWang*,FeiLing*.CharacterizationofToll-likereceptorgeneexpressioningoldfish(Carassiusauratus)duringDactylogyrusintermediusinfection.Developmental&ComparativeImmunology63(2016),78-83.(IF:3.22)128