哈茨木霉高产几丁质酶菌株的筛选及其基因的克隆

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1、安徽农业大学硕士学位论文哈茨木霉高产几丁质酶菌株的筛选及其基因的克隆姓名：王红梅申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：蒋立科20090601中文摘要木霉(Trichoderma．．渊属于半知菌类丛梗孢目，丛梗孢科真菌(Gloiosporae)是一种广泛存在于土壤、植物根际和叶面的腐生型真菌，对多种植物病原真菌具有拮抗作用。因而被当作为一种生防菌种进行使用，并引起了众多微生物学家和植物病害研究者的高度重视。一方面鉴于它能促进作物生长，另一方面因频繁的生化作用的不稳定性，迫使人们去探究原因，以促进木霉菌在植物生防领域和促作物

2、生长上的开发利用，为实现促进木霉在生产应用上提供充分的生物学依据。几丁质是自然界广泛存在的生物多聚体，是构成大多数真菌细胞壁的主要成分，而有些微生物分泌的几丁质酶有降解几丁质的作用，而达到防治真菌的目的。很多年来，农业和林业上遇到的病害很大部分都是由昆虫和真菌引起的，不难发现，这两大类有个重要的共同点，就是其外壳都是由几丁质组成的。所以，在发现了化学农药对环境和人类造成的不可弥补的重大灾难后，人们把注意力朝向了生物防治，因而催化几丁质分解的主要酶——几丁质酶就自然地成了研究的重点。因此，不断去寻找筛选产几丁质酶的微生物，并纯化

3、其所产几丁质酶，研究其性质、作用方式、作用效果及分子机理，以及转几丁质酶基因植物的研究发现，是目前生物防治研究中的一个新的热点。本项研究主要研究内容和结果如下：1．离子注入并筛选突变菌株：通过氮离子注入诱变哈茨木霉野生菌，再以透明圈法进行平板培养菌的初筛和复筛，DNS法测定液体培养菌的酶活，从中筛选出一株高产几丁质酶的菌株(编号为3．3)，确定为哈茨木霉新突变株(命名待定)。2．优化筛选木霉菌株生长条件：对所筛菌株进行单因素和正交试验发酵的条件优化。单因素分别是从培养基氮源、胶体几丁质浓度、发酵起始pH值、培养时间等方面进行，

4、实验结果表明，添加1％蛋白胨组的产酶量最高，1．0％胶体几丁质对菌体产几丁质酶的诱导性最强，初始pH5．5、培养96h时产酶量较高；正交试验综合分析表明，哈茨木霉H-13接种于1％蛋白胨为氮源、0．5％胶体几丁质为碳源、初始pH5．0的培养基，培养96h时，发酵液中的几丁质酶活可达至U731．69U／mE，高于单因素条件中的任一因素，比野生菌株酶活力提高1倍。3．对突变菌株几丁质酶基因克隆：哈茨木霉是重要的生防菌，对多种病原菌均有很好的拮抗作用，其作用之一就是产生多种细胞壁降解酶，尤其是42kD几丁质酶。根据GenBank上已

5、有的42kD几丁质酶编码基因序列设计适宜的引物，通过PCR技术，从哈茨木霉H一13基因组DNA中扩增到相应序列，通过GenBank进行序列比对，发现该序列同已发表的其他Trichodermharzianum42kD几丁质酶序列具有99％的同源性，因此确定该序列为42kD几丁质酶编码基因，碱基序列比对表明在编码区内有1l处碱基改变，导致6处氨基酸发生改变。4．进行了对所筛选菌株发酵产物的应用：在蚌埠怀远所进行了大棚蔬菜种植实验，其莴笋、番茄增长30％以上，水稻育秧状况表现出较对照组的明显旺盛。综上可知，本研究首次采用离子注入诱变

6、的方法并获得高产几丁质酶的木霉菌株，表明此方法的可行性，对于其发酵产物对植物增长的事实，为木霉在促进植物生长和生物防治方面的研究提供了支持和依据，几丁质酶基因的成功克隆，为转基因植物的发展提供了理论依据。关键词：哈茨木霉；氮离子注入；几丁质酶；产酶条件；基因扩增II英文摘要Trichoderma．SPPbelongstoclusterstemcohortofDeuteromycetes．Gloio．,poraefungus．ItisakindofgenerallyexistentFunguswhichisatypicalrot

7、fungianditisarlantagonisticbacteriumofAgaricusspawndistresspathogensinthesoil，plantrootzoneandleafsurface．Trichodermaisattractedbymanymicrobiologistsandlearnersforit’SbiocontrolfactorsOilplantdiseases，positiveeffectsonpromotingplantgrowthandinhibitplantdiseases．Itis

8、necessarytostudyTrichodermaforit’Susefulfacts．．Thechitinisakindofbiopolymerwidespreadexistenteinthenature，whichisprincipalingredientstomak