杨树npr1基因的克隆及功能验证

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安徽农业大学硕士学位论文杨树NPR1基因的克隆及功能验证姓名：邵元华申请学位级别：硕士专业：园林植物与观赏园艺指导教师：项艳201205 摘要杨树作为林业生产巾的模式植物，因其生长速度快、适应性强和丰产等特性在世界各地广泛种植。然而，杨树病害多样，传统的抗病措施存在局限性，抗病机制的研究及分子育种具有很大的发展前景。系统获得性抗性(科stenlicacqu№dresis切nce，SAR)是一种植物主动防御机制，由局部感染引起的天然免疫反应，可保护植物体免受细菌、真菌及病毒的侵染，具有广谱抗病性。朋啵J基因是植物sAR信号途径中重要的调节因子，在水杨酸或病原体激发下可诱导艘基因。过量表达NPRl类基因可有效增加植物自身的抗性。本文利用生物信息学的方法，根据杨树基因组数据分析了M哏J『基因的特点，在此基础上克隆和确定了南林95杨中的M唿J同源基因，构建其系统进化树，利用多重序列比对分析锚蛋白重复和BTB／POZ构域的分布，同时开展了AM强J．，亚细胞定位研究。构建pBll21+PtNPRl．2过量表达载体，对杨树进行遗传转化，并对转化植株进行了抗生素筛选和PCR鉴定。获得了如下主要结果：(1)克隆得到杨树两个M唿J的同源基因P删凇J．j(JQ231218)和P舯RJ．2(腰732893)。(2)AM飧J『．J和AM飧J．2相应的蛋白序列和进化关系分析表明其与拟南芥朋唿J基因结构及功能上高度的同源性。(3)构建了PINPRl．1．GFP融合表达载体，转化拟南芥原生质体表明P删豫J『．J『的亚细胞定位在细胞质中。(4)AⅣPRJ．J和P蹦PRJ．2的组织特异性和诱导表达分析表明杨树朋唿』基因没有组织特异性并且受外源SA的诱导。(5)克隆了AM豫J．J和AM飧J『．2的启动子，并进行分析表明含有与SA信号途径相关的顺式反应元件＆W1A叮和W|-boxes。(6)构建表达载体pBIl21+PtNPRl．2，采用农杆菌介导的叶盘法对南林95杨进行遗传转化，经抗生素筛选获得2株转基因植株。关键词：杨树，NPRl，启动子，亚细胞定位，遗传转化 AbstractAstllemodelplantinforcstproduct，poplariswidelycllltiVatedinthewoddbecauseofllighra：teof伊啉他，s呐ngadaptabil蛔andllighyield．However，也ereareVari01lspoplarmse嬲esand位ldjtionzLlresistantme邪uresareimperf-eCt．ResearchesonresiStancemeclla血sm觚dm01ecularbree幽唱arepmrnising．Systeln_licaCqujredresistallce(SAR)isaplant证衄：uneresponsematis删1y础cedbylocalin]fectiontoproteI旺也eplantag血stbaCt耐all，向n92Ll觚dViralin=fectionSa11ditisreco蛐zedtoproVidee伍cientbroad一哦舳dise弱eresistallce．Thenon-expresserofpattlogenesis—relatedgene1㈣J)isasi咖ficantre叫atorofs)rsteInicac倘dresistaIlceinpl锄如wmchinducesPRgenes诹m衄gge咖gofSAorpa．吐logeIls．OVer-eXpressionofⅣP尺Zresultsinelll]岫cedbacterialand缸ngalresista=nce．Intbjs咖dM细ohomologouspoplargeneswereidenlifiedbybioinI．ornlatics删ysis蠲dcloned任omP叩”蛔沈加泌cVⅣ口以Zi玎95．Aphylogenetic仃eew弱gen蹦眈d丘omaJi蛐ntsofP蝌PRlproteinsequencesandNPRl一l“(egenesiIlotherplal】皓．Mmtipleprotc．m2Lli罂衄entSwercalsocons仉lctedtoanalyze也edistributionof咖cialdomaills．At也esametime，t11eoVer—e)【pressionVectorwascons仇lctedand仃mlsf0衄ed血opoplar．T．瑚sfo皿edpl锄tswercfilteredby蛆曲iotic锄dcon丘衄edbyPCRaIl由sis．nemaillresultsaI．e翻卫nnlarizedasf-0llow：(1)TwohomologouSpoplargenes，RM飧J．J(JQ231218)趾d删J．2(JF732893)，Ⅵ，er℃cloned(2)Proteinsequencesandphylogentic吼alysisof尸t^愀J．J『锄dAM碾J．2shov陀dhi曲homolog)rwimM唿Jinmabidopsis．(3)ThePtNI’R1．1-GFP觚ioneXpressionvectorwereconS价lcted弛dexpressedinArabidopsismesopbyllprotopl嬲tS，Whereitlocalizedtotllecytopl嬲m．(4)Ana岭sisof臼anscdptionleVelsreVealedexpressionpatt咖sof尸霸V：PRJ．Jand删J．2wc：renon-tissue-Specificexpression如d洫duCedbyeXogenousSA．(5)PromoterSofAⅣ凇J．JaIld_P删P发J．2wereclonedandcis．elementan出sisrcvealedthatthcP小田R1promoterscontaillRAVlAATandW七oxesmotifs，bomofw11ichare玉mowntorelatcdtoSAsi弘alpathway．(6)rnleoV*cXpressionVectorPBll21+P悄PRl．2waSco船叽ctedandtr踟【lsformedinto‘Nanlin95”．2m哪f．omedplaultswereobtajned盘rscreelling．K田words：popl碣NPRl，promoters，subcellularlocalizatioIl，genetic廿ansfomationn 1文献综述杨树，杨柳科杨属落叶乔木，是世界上分布最广、适应性最强的树种，主要分布在欧洲、亚洲、北美洲的温带、寒带及地中海沿岸国家与中东地区。属下通常分为5个派，白杨派(Sect．尸印”胁)、大叶杨派(Sect．k“cDf如s)、青杨派(Sect．勋c口朋砌口c口)、黑杨派(Sect．彳fj孵的s)和胡杨派(Sect．死r口醒口)I¨。我国约60种，主要分布在北方、西南及华中等地区【2】。杨树具有生长速度快和丰产等特性，已被广泛地作为短期轮伐的造林树种，在生态环境治理和解决木材短缺方面均占有重要位置。杨树中的代表品种毛果杨(尸叩甜蛔护砌D删)，是第1个开展全基因序列测定的树种，第3个开展全基因组测序的植物【3J，其基因组(480m)较小，相当于水稻基因组大小【4】。杨树作为林业上的模式植物，具有优良的实验特性，容易进行种间杂交和无性繁殖【5'6】。随着杨树组织培养及转化技术的日趋成熟，在抗虫、抗病和抗逆境胁迫等抗性的改良方面发展显著【7】。此外，杨属植物有着丰富的遗传多样性【8J，是林木遗传研究的良好材料。大力发展杨树产业，对于我国增加森林资源，改善生态环境，优化农村产业结构，促进农民增收，都具有十分重要的意义。根据2010年11月29日发布的《安徽省人民政府办公厅关于加快杨树产业发展的意见》，到2015年，全省杨树林单位面积年生长量翻一番，每甫蓄积的年均生长量达到0．8m3，累积增加蓄积400万m3。可有效提高林分质量，增强杨树抵抗各种自然灾害的能力，为全省提供生态保障。然而，杨树是多年生且易感病的树种。据不完全统计，危害杨树的病菌全世界共300多种，我国大约有130余种。安徽杨树栽植面积呈快速增长趋势，杨树病害问题也日趋严重。危害较为普遍或严重的有黑斑病、杨叶锈病、拟茎点溃疡、水疱性溃疡病、腐烂病、根腐病等19J。主要的综合治理包括选用抗病品种、培育健壮苗、科学造林、加强栽培后管理及喷药保护等方法。而传统的抗病措施存在着周期长、对环境造成污染等一系列的局限性。随着分子生物学的飞速进步，重组和基因克隆技术的建立，抗病基因的克隆，抗病机制的研究及分子育种技术也随之发展。1．1杨树的抗病性研究进展杨树功能基因的研究主要集巾在木材形成、休眠与开花及杨树与病原物相互作用等生物学过程的相关基因【10】。杨树生长周期长，在时间和空间上更可能受病原侵害，因此研究多年生木本植物与病原微生物之间的相互作用具有重要的理论意义。林木抗病育种的主要应用途径有选择抗病树种、种源和单株以及通过杂交或生物技术引入抗病基因。而后者具有显著的优势和广阔的前景。 杨树锈病是杨属植物常见的病害，其致病菌是活体营养型真菌施帅D阳sp．。抗性位点的定位研究利用了群体分离分析法(BSA)和局部作图，定位了两个抗锈病位点MER和MXC3位点，分别来源于美洲黑杨和毛果杨【11，12J。通过对MER位点95kb区域进行测序和注释，发现了该区域内编码的15个抗性基因【l引，同样对MXC3位点附近的基因组测序则发现了6个抗性基因【l41。使用寡核苷酸全基因组芯片分析杨树对M．1arici-populilla的应答性，结果发现抗性杨树应答基因数目明显高于敏感性杨树(6倍)，而且在抗性杨树rfl发现多个防御相关基因被剧烈上调表达，例如瑚J，豫2(编码beta一13葡聚糖酶)，瞅3(编码酸性几丁质酶)，擞5(编码甜蛋白类似物)，胤8(编码碱性几丁质酶)和瞅JD(编码核糖核酸酶)，这些酶都证实在抗真菌巾具有一定功能，并是SA信号途径巾的标记基因。杨树黑斑病是杨属植物中另一种重要病害，其致病菌为半活体营养型真菌(^缸r，，D刀f咒口)。^缸rs，D以切口在侵染杨树的早期呈现活体营养型真菌特征，宿主细胞超微结构不发生明显变化，而在侵染后期呈现死体营养型真菌特征，杨树体内茉莉酸信号传导途径相关基因表达ll51。自1992年第一个植物抗病基因克隆成功至今，众多抗病基因和病原菌无毒基因从拟南芥、番茄、水稻rfl等植物rfl被克隆，有些基因的结构、功能及作用机理己明确并在分子育种中得以应用，而杨树相关抗病基因的确定和研究尚未成熟。1．2植物抗病基因的研究1．2．1病原菌与植物相互作用关系植物对病原体有一套天生的防御系统，包括本身的物理和化学防御，即细胞壁的结构障碍和具有抗病功能的化学成分，以及植物受侵染后对病原体的抗性反应【l引。植物对病原体的抗性可分为本底抗性(B嬲alrcsis伽∞e)，种属特异性抗性(Race—specificresistance)和系统获得性抗性(sySternjcacquiredresistaIlce，SAR)。自然界巾，植物和病原菌之间存在着相互识别的机制，通常植物针对于大多数病原体而言都是非宿主(NonhoSt)，这种情况下病原菌无法进入其非宿主的细胞壁侵染植物细胞，这是一种非宿主抗性(NoIlhostRcsistallce)，是整个植物种群对病原菌种群rfl所有基因型的一种非特异性抵抗。这种抵抗包括三个方面：一是植物对于病原菌渗透的抵抗；二是植物对病原菌进入植物细胞内部的阻碍；三是病原菌进入植物细胞后产生的抗性。非宿主抗性和本底抗性可能存在共同的一些信号途径。而当植物是某些病原菌的宿主(Host)时，病原菌可侵入植物细胞，此时根据植物和病原菌的相互关系，可分为活体营养型(Bio缸ophy)病原，半活体营养型(HeIllibio仃ophy)病原和坏死营养型(Necr0仃ophy)病原t17J。2 病原体侵染植物细胞后，可以产生一些水解酶，如多聚半乳糖醛酸酶、果胶降解酶等，这些酶作用于植物细胞的细胞壁，使其降解成为寡聚糖。与此同时，植物细胞水平上也会发生一系列相应的生理生化反应。被侵染的植物细胞产生一些水解酶，如B．1，3一葡聚搪酶、几丁质酶等，可以降解病原体的细胞壁，直接抑制病原体的生长和传播，并生成寡聚葡萄糖、几丁寡糖等产物。来源于植物和病原体细胞的寡聚糖都可激发植物抗性反应的活性。这些寡聚糖作为可以诱导植物抗性反应的激发子，在植物与病原体相互作用的过程rfl起着极其重要的作用【l引。植物细胞对寡聚糖激发子的识别，因寡聚糖分子的来源和组成的不同而异。当植物体受到病原体的侵染后，在侵染点可产生H202。H202可迅速破坏病原体及相邻的植物细胞，促进植保素的合成，从而抑制病原体的生长和传播，为植物体产生其它防御反应提供时间【191。寡聚糖也是诱导植物细胞产生H202和O‘2的有效激发子，抑制由寡聚糖引起的Ca2+离子浓度的变化，可阻止细胞周围H202浓度的剧增，还可影响植保素的合成与积累。Ca2+离子内流是植物抗性信号传导途径rfl的一个的重要步骤。此外，蛋白质的可逆磷酸化也是植物细胞发生抗性反应的重要过程。寡聚糖激发子的活性可抑制磷酸酯酶的活性，提高蛋白激酶的活性。GTP结合蛋白是动物细胞跨膜信号转导的第二信使，在植物细胞的抗性信号传导路径中也扮演了重要的角色。1．2．2抗病基因的作用机理1．2．2．1基因对基因假说1971年，Flor根据亚麻对锈菌小种特异抗性的研究提出了基因对基因假说【20】。其基本内容是：病原体与寄主的关系可分为亲和与不亲和两种类型，亲和与不亲和病原体分别含毒性基因(Ⅵr)和无毒基因(Aw)，亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和抗病基因(R)。只有当携avr基因的病原体与携R基因的寄主相互作用时，二者表现不亲和，寄主表现抗病性；另外三种组合则表现为亲和，即寄主感病。这一假说为病原体无毒基因(aⅥgene)和植物抗病基因(Rgene)的克隆提供了理论基础。’rang【2lJ的Pt0一avrPt0研究以及Jia【22】对Pi协avrP妇的研究都为基因对基因假说提供了直接证据。Nimchlll【等【23】的研究表明无毒基因avr]Pto蛋白通过细菌致病分泌系统Ⅲ进入植物细胞，并且与Pt0蛋白直接结合。转基因技术研究发现往带有抗病基因Pto的番茄中导入无毒基因aⅥPto，该植物就出现超敏反应(hypersenSitivereaction，m)和自身荧光反应【24J。抗性基因从识别病原体到产生抗性通常需要几种蛋白质的参与，如NBS—LRR类的抗病基因瑚玎识别芜青皱叶病毒外壳蛋白(CP)的过程巾需要一种媒介蛋白(TIP)参与，形成CP．rrIP．}玎玎复合体从而产生抗性【251；Cf9。A、呐 介导的对番茄叶霉病的抗性则需要地幅S(Hi咖柚丘nnybindillgsite)的参与口q。1．2．2．2．Avr蛋白与R蛋白的相互作用机制R-Avr蛋白相互作用起初的最简单模式是受体．配体模式。进一步的研究发现，R蛋白与A眭蛋白的识别很可能并不是简单的受体一配体模式。由于很难检测到R蛋白和Aw蛋白的直接相互作用，因而提出R蛋白“jl{【控”与Aw蛋白作用的植物寄主靶蛋白(G1lardee)的假设，即一旦骼测到Avr．g啪rdee的相互作用，就会启动脚其他防御反应。研究表明Avr蛋白通过Ⅲ．型分泌系统直接转运到寄主细胞的特定部位，这一系统在进化过程rfl相当保守。被转运的A．Ⅵ蛋白在氨基末端会发生十四烷酰化和十六烷酰化，而这些烷酰化基团可将Ⅲ一型效应蛋白牵引到膜上。十四烷酰化对于Aw蛋白寄主细胞的质膜上的定位是必需的，对于寄主启动防御反应也十分重要【27J。1．2．2．3R基因的信号传导近几年来，以拟南芥突变体为主要研究对象的研究逐步深入，R基因的信号传导的研究也取得了重要进展。实验表明，PBSl、NDRl、EDSl、PAD4和PBS2的突变阻断了某些R基因调控的基因对基因抗性。例如，突变PBSl可以影响RPS5，PBSl的编码产物可能为寄主靶蛋白，可以被RPS5和相应的A、柙phB所识别。在已知的I灌因信号传导rfl，需要NDRl的R基因属于CC小mS．LRR亚类，需要EDSl的R基因属于r兀R．NBS．LIU冱类；同时，需要EDSl和需要NDRl的R基因分别需要PAD4和PBS2瞰J。这些证据均证明了Aans等【29】的假说，即被R基因启动的下游信号传导途径有两条，R蛋白的结构决定了所需要的下游信号因子的类型。最近有研究表明，RPP7和RPP8，不需要EDSl或NDRl，说明在R基因信号传导中至少还存在第三条途径。RPPl3调控的抗性不需要EDSl、PAD4、PBS2以脚Rl，在edsl、ndrl双突变巾完全不受影响，且不能被nahG所阻断【30】。已克隆的RPP8和I心P13基因的编码产物均为CC-NBS．LRR类蛋白，相互之间很相似，而它们的信号传导途径却与cC-NBS．LIu谈基因不符，这就表明至少存在三种R基因的下游信号传导途径，一种是NDRl依赖型，第二种是EDSl依赖型，第三种则尚未报道。促使R基因选择不同的信号传导途径的具体机制仍不清楚。目前，调控I选因信号传导的几个基因已经被克隆，NDRl编码的蛋白质预测含有2个跨膜结构域，这一结构很可能可以促进R蛋白靠近膜，EDSl和PAD4编码的蛋白质与三酰基甘油酯酶很相似，可能在信号分子的合成和降解中起作用。nahG编码的蛋白质为水杨酸羟化酶。4 1．2．2．4防卫假说防卫假说由‰derBiezen等【3l】提出，认为在病原体侵染植物并营造有利环境时以适合其生长，病原体会把植物体内的一种蛋白——卫兵(G1】ardee)作为靶子并加以改变，这种改变是植物受到病原体侵害的信号。相对于此的植物抗病基因蛋白(Guard)可以检测到这种信号，可能是通过检测卫兵蛋白与病原体毒蛋白形成的复合体的途径。当植物抗病基因蛋白发现其卫兵发生变化时，就会激活抗病性，这整个过程可能并不需要抗病基因蛋白和无毒基因蛋白间的直接的相互作用。防卫假说中植物的抗病基因蛋白不仅能识别无毒基因蛋白，还能监视被病原体毒性(致病蛋白)作为攻击目标的重要植物蛋白(复合体)。l。2．3植物系统性获得抗性根据植物对病原侵染的反应，植物的抗病性分为细胞程序性死亡、诱导抗性、非寄主抗性等形式。诱导抗性指植物在外源生物或非生物因子的作用下，植物自身防御体系被激活，产生了对病原物的系统抗性的现象。其中系统获得抗性(systeInicacquiredresis切nce，SAR)和诱导系统抗性(iIlducedsysteInicresistance，ISR)研究得比较透彻。SAR是植物由局部感染引起的天生免疫反应，保护植物体免受细菌、真菌及病毒的侵染【32'331。SAR显著区别于其它抗病反应的两个特点是：对病原菌具有广谱抗性以及诱导PR蛋白的表达【34'351。SAR是一种天生的免疫防御机制，从植物发生过敏反应到系统获得抗性的产生，需要一系列信号的传导。SAR信号途径的发生需要水杨酸(salicylicacid，SA)的积累，并且调控PR基因的表达。这些PR基因编码小的分泌或液泡目标蛋白，从而激活抗菌活性【36．391。SA作为一种重要的内源信号分子，其作用已在拟南芥、烟草和黄瓜等植物中得以证实。在未感染病原物的植株体内SA含量很低；感染病原物后，感染植株的韧皮部sA含量急剧增加，所增加的内源SA足够诱导PR蛋白的表达【40，4¨。体内SA标记研究表明，感染烟草花叶病毒(tabaccomoSaicvims，TMV)的烟草叶片后产生SA并被转运到植物全身，在未感染部分也有较多的累积【421。然而，也有报道表明，SA并不能进行长距离的信号传导【43l。外源SA及其类似物的应用同样可以激活PR基因的表达，如2，6．二氯异烟酸(INA)，S．甲基苯并【1，2，3】噻二唑．7．硫代羧酸酯(BTH)等【32，38，441。此外，另一个防御信号传导途径ISR则受茉莉酸(JA)或乙烯(ET)的调控产生对昆虫和腐殖质病原体的抗性【45却】。1．2．4M飧J基因及其作用机理1994年，Cao等【481在分析SAR信号传导途径时分离得到一株缺乏SA、mA表 达的拟南芥突变株，这是携带单隐性突变基因的突变株，即nprl突变株。1997年克隆得到的M啊J(non．expresserofpamogenesis．relatedgene1，也称NIM1或SAI1)，是拟南芥中依赖SA信号途径中一个重要的调节因子(如图1—1)。NPRl蛋白包含一个两侧的核定位序列，一个锚蛋白重复结构域，两个蛋白．蛋白互作结构域和一个BTB／POZ(BroadcomplexTr锄昀cka11dBric-a．brac／Poxvilllsa11dzillcfmger)结构域【49】。研究表明，NPRl通过与TGA转录因子的相互作用调控PR基因，尽管缺少一个典型的DNA结合结构域【50-531。酵母双杂交系实验发现与NPRl发生相互作用的是含有碱性区域的亮氨酸拉链(bZIP)转录子的TGA亚类家族成员(AHBP．1b和TGA6)。最近的研究表明NPRl基因的表达受DNA结合蛋白WRKY的调节。在朋啊J『的启动子区域，发现有WRKY识别的W二盒序列。突变W．盒序列，导致启动子不能激活下游的报告基因，丧失了防卫基因表达和抗病反应的能力【541。PRl启动子研究表明，NPRl受多个正向和反向的顺式反应元件调控【55】。朋啊J是组成型表达，其表达量在SA处理下增加2倍，表明其在蛋白水平上受调控【56】。细胞质内的NPRl还可以调节SA和JA信号途径的通路及SA和JA信号问的拮抗作用【，71。M啮J的活性受特定氧化还原体系的调节。研究表明朋噙J在细胞质中以二硫键结合的寡聚体形式累积，并转化为单体形式进入细胞核，在SA或病原体的激发下诱导PR基因【58’59】。两个高度保守的半胱氨酸残基(C82和C216)在寡聚体形成过程中起着极其重要的作用。根据相关的报道，在拟南芥、水稻、番茄、小麦及葡萄中过量表达拟南芥朋嚏』(彳洲擞』)基因可以增强对细菌和真菌的抗性【56，60‘631。爿棚J的同源基因也在多个物种中克隆并分析，如水稻164】、苹果【65】、香蕉【66，671、棉花【68】、葡划691等，这些同源物具有与彳洲瞅J相似的功能和结构域。～UnInd∽●dBSy-t●mIc-cqulr●d憎●I-¨nc●气一，当赢盘孙一l意。溉?”|f_⋯，。’，opLw“一_“韶～／”““8l＼勰戮、nn。婴穗两盛l、矗＼差矗赫武I峨、l“”Ⅶ“9《案。溢泣喘一；图1．1NPRl的降解及植物防御反应㈣Fig．1·lNPRldegradationandplantdefensereSponse86 2引言杨树是世界上巾纬度地区广泛种植的树种，在改善生态环境和解决木材等方面起着极其重要的作用。作为林木中的模式植物，毛果杨的全基因组测序的完成为同源基因的发现、克隆以及一系列的生物信息学分析奠定了重要的基础。随着杨树组培快繁体系的完善，通过基因工程的手段改善杨树抗病性，培育新品种具有重要的理论及应用前景。此外，杨树是根癌农杆菌的天然寄主，可利用根癌农杆菌介导对其进行遗传转化【．71。731。杨树重要抗病基因的克隆，结构、功能和作用机制的分析，不仅在林木病理学和抗病育种基础理论的研究上也具有重要作用，在解决生产实际问题上具有广泛的应用价值。2．1本课题的研究意义杨树的病害是制约杨树产业发展的重要因素。传统的化学防治不仅成本高，还会对环境造成严重的污染。由于杨树的遗传杂合性高，传统的育种手段不但周期长，也很难定向培育出具有目标性状的新品种。在基因对基因假说巾，植物由于不能适应自然界中病原菌不断的变异，抗病基因存在着很大的局限性。而SAR可以抵抗多种病原物的侵害，并能够使植物产生系统持久的、安全的抗病性。NPRl是调控SAR反应的重要基因。研究表明过量表达NPRl基因可以有效激活&娘反应，提高对多种病原菌的抗性。利用生物信息学的方法，找到杨树中的NPRl同源基因，对克隆基因进行特征与功能分析，确定其结构和功能上与拟南芥NPRl基因的高度同源性。同时构建过量表达载体，对杨树进行遗传转化，直接提高杨树的抗病性。本研究不仅有效控制林木病害提供了一条新途径，更为NPRl基因在SAR信号途径巾的作用机制的进一步研究提供理论依据。2．2本研究的内容、目标2．2．1研究内容(1)利用生物信息学获得杨树朋啮J一娩候选基因。(2)R■PCR克隆2个候选基因(nM啊J『．J和尸删凇』．2)，并对蛋白序列进行结构和进化关系分析。(3)克隆AM飧J．J和RM啊，．2的启动子并进行分析。(4)对RM飧J．J和RM飧J．2进行组织特异性和诱导表达分析，并对凡M噌J．J进行亚细胞定位。(5)构建表达载体pBll21+PtNPRl．2，采用叶盘法对南林95杨进行遗传转化。7 (6)进行转化子的筛选和转基因植株的分子检测及抗病性能测定。2．2．2研究目标(1)从杨树rfl筛选并克隆得到2个M豫』同源基因(2)通过序列和表达模式分析确定M啵J—Z池基因结构和功能上的保守性。(3)克隆得到尸揪J．J和AM飧J．2的启动子并进行分析其巾SA相关的反应元件。(4)构建GFP融合表达载体，对RM飧J『。J进行亚细胞定位。(5)构建表达载体pBll21+PtNPRl．2，使用优化的遗传转化体系对南林95杨进行遗传转化。(6)获得转基因植株并进行分子检测。2．3本研究采用的技术路线克结构利用生物信息学获得杨树朋豫Jf—Z画b候选基因I提取南林95杨总RNA，抗病性能检测 3．1实验材料3．1．1植物材料3材料与方法南林95杨(尸叩材触如加胁cvN砌iIl95)组培苗为本实验室已建立的组织培养快繁体系。3．1．2菌株和质粒根癌农杆菌(彳g加6口沈，．fz删f姗l乞72配fP珊)EHAl05(具砒f、SF抗性的Ti质粒，pBll21表达载体均由本实验保存。质粒转化受体菌大肠杆菌EcD如DH50【，载体质粒pMDl8一T购于大连宝生物工程有限公司。pC舳队1302载体由安徽农业大学生命科学院作物遗传改良实验室惠赠。S打强，GUSfu嘲onIunctIon：—j泣豇一‘)也atBimHTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTCAGTCCCTTATGTTA⋯·____l-。◆图3一lpBIl2l载体示意图Fig．3—1MapofthepBIl2lvector9 拢1@mj㈣spo’虹T-&’—时似ft}鼬Ⅱ㈣pa嘲B狐{30210S孳垒姊一堋，’pB嗽州球垌322bam朔kIpl嘲蚪副呷图3．2pC^MB认1302载体示意图Fig．3—2Mapofmep㈨BIAl302vector3．2主要仪器设备和试剂3．2．1主要仪器设备PCR扩增仪(Biome仃a，梯度PCR仪)、U帅凝胶成像系统、琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一厂)、电泳槽(DY_III)、小型高速离心机(HemaTGL一16H)、高速冷冻离心机(Mikr0，220R)、恒温水浴(Wn9403E)、恒温振荡摇床、-20℃低温冰箱(美菱，BC口．262N)、一70℃超低温冰箱(SaIlyo)、制冰机(Sanyo)立式压力蒸汽灭菌器(Hir研锄a)、超净工作台(苏州净化设备有限公司，SW王J_1BCU)、紫外分光光度计(UV_754)、移液器及其它分子生物学实验常用设备，组培容器、光照培养箱及其它组培实验常用设备。lO 3．2．2主要试剂工具酶和生化试剂：砌DNA聚合酶、“鲫聚合酶、斛即s、MgCl2、PCRb心r、T4DNALig勰e、限制性内切酶丑蜊HI、朐口I、跏I购自大连宝生物(瑚 田4·9pcI址m瑚302伸姗R|．1■切奠证l、2：pc怂佰认1302+p咖PRl．I一切囊蕾；3：PⅫD18-T+P吐oRl．1一切曩带：M：Dl叮AM捆·k玎(200bI)h削a·)Fig4．9Di窖薛钯d、．．ct吖ofpCAhmnd302+pINpRl．1I、2：Dj到瓣ed厅agln蜘ItofpCAMBIAl302+PINPRl．1：3：Di妒跏d如粤眦mofpMDl8．1．+PtNpRJl：M：DNAM铀br<200bpL：-dde-·>PtNPRl1．tlFf(：}FPt：11llL：uorlll、。llhIel·业e‘图4-10尸fM飧，．，的亚细胞定位F唔4-lOSubcellul别ocalizationof凡M飧J．，4．5PtNPRl．1昶PtNPRl．2的轰达分标组织特异性表达分析表明RM飧，．J『和AM哏J．2的表达没有组织特异性，在叶、茎和根中都有表达，而叶的表达量最高。两个基因在外源SA和MeJA诱导下的表 达水平基本一致，在SA的处理下有明显的升高。这种表达模式与报道的拟南芥彳￡~!瞅J『相似，彳WP尺J在SA处理下表达量提高2倍酬。但在MeJA的处理下，RM啊J．J『略有上升，P￡M飧J．2的表达量并没有明显的变化，这说明了其反应机制的复杂性，包括SA对JA信号途径的拮抗作用，或者MeJA反应发生得更为迅速(图4—11)。PT、PRl．1P1弋pRl．2nActinPtⅫR1．1PD—R1．2nActin4．6载体构建验证LeafStemRootCKSAMeJA图4．1l尸fM阳，．，和RM飧』．2的表达分析Fig．4一l1ExpressionprofiIesofJpZ^V’尺，．，andPf^(PR，．2将测序正确的PW凇J『．2基因全长连接到pBll21载体上，连接后进行PCR验证，电泳结果如图4．12。对重组载体进行筋口I、曰口mHI双酶切验证，电泳结果为4．13，均含有P洲凇』．2大小的片段，表明基因正确连入表达载体。30 二【mUbp1000bp■4·12pBn2l+PtI羽RJ．2Pcld■证■l、3、．I：食纠》喇n．2片曩的■■质糖；M：DNAM柚|【玎(2∞bpL“def)FiI．4·12Pc!Rm毋sisofp丑ln2l蝴伽隙1．2l、3、4：、wI螂c彻鼬Pt}m赳2；M：蹦AM赳|【玎(200bl，LIdd盯)J(Hf吣bpic幔Ibp¨小lbp_¨．13pⅢ12l+l畸硅倦tr2■切■证l：pml2l+瑚娜R1．2一切■证；2；PⅫD18．T+P帅．2■切■征；M：DNAM衄k仃(2∞bpLIdd盯)量k．4．13Di牡咖d、．ect村ofpBn2l+l恤ⅢPRl．2l：D嘛s|。d疳a—neI■ofpBn2l+P心IPRL2；2：D面rtstcd矗a掣llcnIofp量．|D18．T+P日qPRl．2；M：IINA^Ia，I【盯(200bpLadder)4．7重组质粒导入农杆菌的验证及转基因植株的获得4．7．1农杆菌中pBll2l+PtNPRl．2的PCR验证pBll2l+PtNPRl．2质粒导入农杆菌后，从活化的农杆菌中提取质粒作为模板，PCR扩增得到P悄PRl．2基因片段(如图4．14)，与大肠杆菌中的阳性质粒对照大小相同，证明了重组质粒己成功导入农杆菌中。二()()()bplO(}()bp图．1．¨P(．1浦蠕Um2l+PtⅫ·lu．2导入农杆蕾l一、6：含有Pt奎硼R1．2的质粒；8：阴性质粒；9：阳性质粒；M：DNA^IaIker(200bpLaddeI)Fig．-．-¨P(R柚ab竦ofpBn2l+PtNPRl．2iIlA蟹obactcI·iI眦tI蛐cfacicllsl一、6：、℃ctorscont晒IPINPRJ2；8：m妨哦．c、．ector；9：posi嘛．e、-ectoI．M：rINAM献c『(200bpLaddcr) 4．7．2目的基因的转化和转基因植株的PCR检测对农杆菌介导的遗传转化体系进行优化后，用含pBIl21+PtNPRl．2质粒的农杆菌侵染南林95杨，通过卡那霉素筛选获得3株转基因植物(如图4．15)。对经卡那霉素筛选获得的转基因植物进行PCR检测，扩增的35S片段为555bp。电泳结果(图4．16)表明，有2株含有目的片段，与阳性质粒大小一致，而非转基因植株中则没有，初步证明PtNPRl．2基因整合到南林95杨中。氧／图4．15杨树遗传转化Fig．4一l5GenetictransfIo肿ationofpoplarA叶片预培养：B、c、D、E抗性不定芽的分化；D生根苗APreincubationofleaves：B，C．D，EDiff-crentiationofresistantadventitiousbud：DRootseedIings 脚l咖750bp一5∞印一一555却图4-16转基因檀株PCR结果l、7：转基因檀株：+：阳性质粒：-：阴性对照：M：DNAmarker(DL2000)Fig．4一I6PCRresultof自阻nspl锄tsl，7：T砌splants；+：positiVepla湖id；-：negatiVecontml；M：DNAm枷【er(DL2000)33 5．1结论5结论与讨论(1)利用生物信息学的方法筛选并克隆得到杨树两个ⅣP尺J『的同源基因的全长，分别为P小沪尺J．J(JQ231218)和尸趴纡碾J『．2(JF732893)。(2)对删J．』和删J．2相应的蛋白序列进行结构和进化关系分析，表明这两个基因与AtNPRl基因结构及功能上高度的同源性。(3)克隆RⅣP尺J．J和RⅣPRJ．2的启动子并进行分析，发现启动子区域与SA信号途径相关的顺式反应元件。(4)GFP融合表达载体转化拟南芥原生质体表明R?＼7：f啊J．J『的亚细胞定位在细胞质中。(5)P￡7v础J『．，和R7v擞』．2的组织特异性和诱导表达分析表明杨树NPRl基因没有组织特异性并且受外源SA的诱导。(6)构建表达载体pBll21+PtNPRl．2，采用农杆菌介导的叶盘法对南林95杨进行遗传转化，获得2株转基因植株。5．2讨论5．2．1杨树M啊J基因的特征分析删啊J是位于多重防御途径交汇点的重要调控元件【841。么删凇J『同源基因已在多种植物中确定并分离，然而尚无在杨树中的功能分析。本文中两个典型的NPRl类基因的全长序列从南林95杨中克隆得到。P洲瑚J『．J『和P删凇J．2预测的氨基酸序列与彳洲擞J『有着高度的同源性，包括锚蛋白重复结构域和BTB结构域。其中R7v=2啊J．J与彳洲瑚J7有着更高的同源性，而尸删础J『．2在外显子．内含子结构上与么洲凇J『有着更高的相似性。进化关系表明P￡_7、7：P尺J．J属于么删瑚J『所在的亚类，而RM啊J『．2属于另一个亚类，包含彳悯3和彳揪彳。彳脚，在依赖SA的表达中是一个正调节因子，这种表达在SAR途径的发生及对有毒病原菌的基础防御中是必需的【84】。相反，彳洲P尺3和么tⅣP尺4则在植物防御系统中为负调节因子【85】。因此RM絮J．J提升SA水平，从而抑制杨树中JA途径，在细胞质中实现对SA和JA调节的拮抗性调控。和爿洲瑚3、彳删豫4相近的P￡M碾J．2可能调控着JA诱导的基因或处于依赖SA和JA信号途径的通路上【86J。为了阐述杨树中M豫J基因的调控机制，克隆得到基因1000bp的启动子并通过顺式反应元件分析确定其包含W七ox和凡w1丸盯基序。有报道表明NPRl启动子中34 W|_b0X的突变体抑制朋哩2对SA的感应。WRKY蛋白也与拟南芥rfl朋呕J的调控有关，用芯片技术分析表明几个WRKY蛋白，例如At愀Y18和A愀Y58，都是N】PR的对象【97】。帆KY和TGA启动子在伪批职J基因对SA反应巾起着重要作用，可推测杨树朋嘧J『基因也可以被生物诱导子、SA或其类似物及病原菌诱导，这点与么洲凇J和伪讹职J相类似。与彳删豫J和仇朋啮J相同，P洲凇J．J亚细胞定位于细胞质。基于以往的研究，AlNPRl．GFP在SA诱导因子处理或病原菌侵染后核定位发生转移，Os]船R1．GFP也在二硫苏糖醇(DDT)的处理下转移到细胞核陬691。在P￡N：豫J．J的蛋白序列中存在两个保守的半胱氨酸残基(C82和C216)，且在P小职J．J和A^7：I飧J．2的C端有假定的核定位信号(NLs)，因此表明AM飧J．J在特定的激发因子下会受氧化还原反应的调节。5．2．2杨树M啮J基因的功能研究为研究M嘧J『基因在调节PR基因表达的特殊作用，近年来的研究对其在整个防御网络巾的作用提供了一些新的线索。在R基因突变体s—cJ和雕群巾发现独立于NPRl的基本的抗病性【88，船】。然而，在番茄巾沉默NPRl基因可激活内P甜如册D嬲吵咖弘Ppv-幻m口幻(PstDC3000)病毒携带无毒的批基因引发病症，而通常情况下则表现出砌调控的抗病性【9Ⅲ。这表明朋唿J与下游的几种蛋白(如TGAl羽TGA2．2)在m调节的抗性巾发挥作用。也可能J、7：I飧J『沉默的植物巾发生更严重的病状是由于缺乏对PstDC3000病毒携带无毒的洲炉fD基因的本底抗性。关于诱导抗性途径，SAR和lSI透径相互独立却对^；：2唿j有共同的需求【911。最近，M飧J在ISR巾的作用再次被确认。ISR开始于根部，而SAR反应开始于叶子，这两种反应也许并不是在竞争M飧Z。而当SA和JA同时作用于叶子时，SA则会抑制JA的合成及传导，这种抑制在，矿J突变体巾有所减轻∥71。有趣的是，NPRl的细胞核定位对于这种抑制的发生并不重要。NPRl核定位序列的突变体编码的蛋白对于PI堪因的调控是缺失的却依然能够抑制JA信号途径【5引。在细胞质中，SA诱导的NPRl也许会与JA信号途径巾的整调节因子结合从而阻止其输送到细胞核。根据相关的报道，在多种植物巾过量表幽f^微J基因可以增强对细菌和真菌的抗性，包括杨树【921。只有通过转化将外源基因导入杨树中，才能进一步验证其功能，从而获得光谱抗病的新品种并通过组培快繁技术获得一定数量的抗病植株。本文巾，克隆得到的两个杨树NPRl基因rfl，P删凇J．2在组织特异性表达分析巾各个部位的表达量都高于P删凇J．』，所以构建pBll21+P1NPRl．2的过量表达载体，用于对杨树的转化。 由于杨树生长周期较长，转入外源基因的转基因植株需进行soutllemb10恤g检测和接种病毒的抗病性能检测，同时炼苗移栽后观察其表型性状，以确定转基因杨树的功能和受到的影响。同时，尸删mJ．2对烟草的遗传转化也在进行巾，以验证克隆基因的异源表达情况。36 【1】[2】[3】【4】[5】【6】【7】【8】[9】【10】【11】[12】[13】[14】参考文献徐纬英．杨树嗍．黑龙江人民出版社，1988．秦光华，姜岳忠．中国和外来杨属种质资源叨．山东林业科技，2007，(6)：60-63．GailT．Popllllls：Arabiposisforfores缸y．Doweneedamodd仃ee阴．AnnalsofBotally，2002，90：681．Bm衄erA．M．，BusovVB．，S昀_IlssS．H．Popl盯genomesequence：Fllnctionalgenomicsin姐ecologicauydo面nantpl锄tspecies明．1’rendsinPlantScience，2004，9(1)：49—56．亿k粕GA．，DiFa西oS．，JaIlSsonS．，酣口，．Theg髓omeofblackco仕onwood，popullIstrichocarpa(to玎．&gray)叨．Science，2006，313(5793)：1596—1604．王世绩．杨树研究进展咖．中国林业出版社，1995．郑进，刘凯于，洪华珠．杨树抗性转基因研究进展明．湖北林业科技，2004，(1)：31-33．尹春英，彭幼红，罗建勋等．杨属遗传多样性研究进展【J】．植物生态学报，2004，28(5)：7ll一722．束庆龙，陈超燕，张欢等．安徽杨树病害种类及其危害特征研究[J]．安徽农业科学，2005，33(007)：1193．1195．程强，潘惠新，徐立安等．杨树基因组计划及其分子生物学研究进展叨．南京林业大学学报：自然科学版，2009，33(001)：131．135．ZhangJ．，SteenackersM．，StomeV，甜讲．Finem印pingandidentific撕onofnucleotidebindingsitc／leucme—richrepeatsequencesatthemerlocllsinpoplduSdenoides’s9—2’叨．Phytopamolo趴2001，91(11)：1069-1073．S甜吨B．，NewcombeG，vrebaloVJ．，甜讲．SupprcssedrecombiIla：tion啪啪dmen1)【c3locus，am旬orgeneforresist觚cetopoplarleaufmst[J】．Theoretical吼dAppliedGen舐cs，2001，103(8)：1129—1137．LescotM．，Ro耐bautsS．，Zh强“，甜口，．A皿。协onofa95一kbpopllluSdeltoidesg饥otnicsequ阴cereVealsadiseaseresistaIlcegeneclllsterandnoveldaSsi锄dcl嬲sii衄1sposableeleme如[J]．111eoretical锄dAppliedGen甜cs，2004，109(1)：10．22．Y．mT．M．，DiFa2ioS．P-，QmterL．E．，甜口，．Genetic弛dphysicaLlmappingofmel锄psoramstresis切ncegenesinpopmuSalldcharaCterizationoflinkagedisequili丽啪锄dnankinggeno血csequence[J]．NewPhytologist，2004，164(1)：37 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[27】【28】【29】【30】【31】【32】【33】【34】[35】【36】【37】【38】BoyesD．C．，N锄J．，D趾lglJ．L．Theam．bidopsisthali锄arpmldise弱eresista】∞egeneprodllctisaperiphemJpl嬲mamembr砒1eproteinthatisdegradedcoincidentwim也ehyper∞璐itiveresponse田．ProcNauAcadSciUSA，1998，95(26)：l5849—54．Ⅵ‰骶：nR．F．，HenkA．，Mowe巧P．，甜口，．AmlItationwi蛐theleuc洫e—richrepeatdom抽oftheara．bidopsisdise笛eresistancegene印s5p枷allysuppressesmlll卸lebac矧al舭dd0、唧砌dewresistancegenes唧．111ePl纽tCenOnline，1998，10(9)：1439—1452．AartsN．，MetzM．，HolubE．，ef口，．Di妇FerentrequiI．ementsforcdslandIl(1r1bydiseasercsistaIlcegenesdef．meatleast佃orgene—mediatedsi野Ialingpa：凼waysiIl撒bidopsis[J】．ProcNadAcadSciUSA，1998，95(17)：10306-11．Bi饷er-EddyP．D．，BeynonJ．L．The加labid叩sisdownylnildewresistaIlcegene，聊1’3一nd，mnC廿oIlsind印enden廿yofndrl柚dedSl锄ddoesnotrequ的也eaccumlllationofsalicylicacid叨．MolPlamMicrobeInter∞t'200l，14(3)：416—21．vaulderBiezenE．A．，J0nesm．111enb—arcdom洳：AnoVelsi驴拙gm砸fskdbyplantresis．tancegenepmductS觚dre刚atorsofceUdeathiIlanimals叨．Currentbiolog)r：CB，1998，8(7)：l也26．L跏怕nK．A．，Fde血chL．，HuntM．，甜口，．BenzothjadiazoleiIlducesdise嬲eresistanceill砸bidopsisbyactiV撕onofthes)，stemic∞啦drcsistancesi罂lal缸a【lsductionpa吐rway【J】．P1antJ，1996，10(1)：71-82．SticherL．，Mauch—ManiB．，MetrauxJ．P．Syste血cac叫rcdresistance叨．mmuR-evPhytopathol，1997，35：235—70．PicterseC．M．，vanW色esS．C．，HomandE．，甜口Z．systeInicresiS恤cein眦出idopsis：inducedbybiocon仃olbacteriaisi11d印endentofsalicylicacidaccu玎血ation锄dpa血ogemsis-rclatedgeneexpression阴．PlantCell，1996，8(8)：1225．37．RyalsJ．A．，NeuenSch帽IlderU．H．，WillitSM．G，eta1．SystemicaC恤dresis伽∽e叨．PlantCell，1996，8(10)：1809—1819．QdheyT．，FriedrichL．，VemooijB．，甜口，．Requirementofsalicylicacidfort11eillductionofsystemicac叫redresistallce叨．Science，1993，26l(5l22)：754—6．M6tra愀皿SigllerH-，RyalsJ．，甜讲．IncreaSeiIlsaljcylicacidatⅡ1eoIlSetofs)rste面cacq血edresist锄ceincucumber[J】．Science，1990，250(4983)：1004．W缸dE．R．，UhesS．J．，W．1li撇sS．C．，Pf口，．CoordinategeneactiV时inresponSetoage鹏缸latiIlducesysteInicacquiredresistance川．Pl趾tCell，199l，3(10)：39 [39】[40】[41】【42】[43][44】【45】【46】[47】【48】[49】[50】[51】1085-1094．MaJ锄yJ．，CarrJ．P．，ⅪeSsigD．F．，甜讲．Sdicylicacid=AlikelyendogenouSsi印ali11吐Ieresi北mceres】pollSeoftobaccotoViI试iI疵ction[J】．Science，1990，250(4983)：1002—4．LnmesS．，W．mterA．M．，DelaneyT．，ef口，．Bi0109icalinductionofs)rstenlicacq妇dresistanceinArabidopsis叽砌Ⅶ-MolecularPlantMicrobeInteractio璐，1993，6(6)：692-698．Ⅶp砌N．，SilVemanP．，硼sonT．M．A．，甜a，．SaJicylicacidisas)rStelIlicsi叫弛d锄inducerofpa吐109enesis-relatedproteinsi11VirllS·iI疵ctedtobaCco叨．ThePlantCellO讪．me，1991，3(8)：809—818．SⅥaeVV，LeonJ．，I己嬲kjllI．Issalicylicacida仃anslocatedsignalofsyste血cacq恤dresistamceiIltobaCco?[J】．PlantCell，1995，7(10)：1691—1701．RyalsJ．，LawtIDnK．A．，DelaneyT．P，Pf甜．Sigllal呦sductioniIls)，stemicacquhdresistallce[J】．PmcNaⅡAcadSciUSA，1995，92(10)：4202—5．M6仃auX皿A11lG0yP，StaubTH，Pr以Induced趼st锄icresistallceincuc瑚1berinresponSeto2，6一dicllloro-isonicotiIlicacid孤dpa血ogens叨．CurrentPlantScienceandBiotechnolo斟ill钾icudtIIrc烈emerl锄dS)，1991．Du玎aDtW．E．，DongX．sySteIIlicacqu沁dresis协ce叨．A曲uRevPhytopamoI，2004，42：185—209．GfellerA．，“echtiR．，F锄aerE．E．心abidopsisjasmonatesi叫迦pa也way【J】．SciS11KE，2006，2006(322)：cml．KesslerA．，Bald池I．T．Plantresponsest0缸ectherbivo巧：111eeme玛迦molecularaIlalysis[J]．AnnuI沁VPlan_tBiol，2002，53：299—328．Ca0H．，BowlingS．A．，GordonA．S．，Pf口，．Cbaract舐zationof阻加abid叩sismutanttllatisnonresponsiVetoiIlducersofs)rstemicacqlliredresistance[J]．PlamCell，1994，6(11)：1583—1592．Ca0H．，G1azebrookJ．，ClarkeJ．D．，ef口，．The加-abidopsisNPRlgenethatcon乜．0lssysteIIlicacqlliredrcsistanceencodesanoVelproteinconl茹n洫g砒山y血repea：ts明．Cell，1997，88(1)：57-63．DespresC．，DeLongC．，GlazcS．，“甜．nle心abidopsisnprl艋m1proteiIlenllallcestlleDNAbindillgaC曲时ofasubgroupoft11eT(认f缸1ilyofbzip眦scriptionfactors【J】．PlantCell，2000，12(2)：279—290．KimH．S．，DelaneyT．P．OVe卜expressionofTGA5，whichencodesabzip勺r趴scriptionf．actormatmeracts、析mniml／hpl，conf打ssar-ind印e11dent 【52】[53】【54】[55】【56】【57】[58】【59】[60】[61】[62】rcsi妣lnceinarabidopsismali锄t0pcronoSpo豫par觞itica【J】．Pl狮tJo啪al，2002，32(2)：15l一163．2缸旺培Y，F觚W，硒nk锄aM．，甜讲．Interactionofnpfl丽thb踮icleucinezipperprotein仃aI塔crip60nf-actorsⅡlatbindsequencesre恤dforsalicylicacidj妇du州onof廿1ePR-1gene川．ProcNatlAcadSciUSA，1999，96(11)：6523．6528．ZhouJ．M．，1HfaY，SilvaH．，甜讲．Nprldj妇融ren_tiallyin_teracts谢thme玎曲erSof也c蟾舶bf觚lyof仃anSc啷tionfactors曲tb砒anelementofmePR-1genere叫redforindu嘶0nbysaliCylicacid[J】．MolPlantMicrobeme托lct，2000，13(2)：191—202．ⅥlD．，ChenC．，Ch肌Z．酾dencefor趾证11)0na皿tmleofwd哆DNAbiIldingproteinsinmereglll撕onofNPRlgeneeXpression【J】．ThePl觚tCeIlOIllm，2001，13(7)：1527一1540．LebelE．，Heifb亿P．，ThomeL．，甜讲．Functi伽山衄alysisofregIllatorysequenCescon仃ollillgPR-1geneexpressioni11arabidopsis四．PlantJ，1998，16(2)：223-233．caoH．，Lix．，DongX．Generationofbroad—spectn：吼diseauseresistancebyoverexpressionof龃es∞而alregulato巧geneiIlsystemicacquiredresi幽mce阴．Proceed堍sofnleN撕onalAcademyofSciences，1998，95(11)：6531-6536．SpoelS．H．，K00mneefA．，Claes眺sS．M．C．，ef口，．NPRlmo姒atescrosS．tall【betv旧ensalicylate—arIdj懿monate-d印endentdefensepathways也mu曲ano、^elf．unctioniIlmeCytosol叨．PlantCell，2003，15(3)：760—770．Kinke撇M．，FanW：，DongX．Nuclearlocaliz￡畸onofNPRlisreq血dforactiVationofprge鹏expression阴．PlamCell，2000，12(12)：2339-2350．MouZ．，FallW，DongX．InducersofplantSysteInicaCquhdresis伽1Ceregulatenpfl劬ction廿lroughredoxch锄ges叨．Cell，2003，113(7)：935—944．ch咖M．S．，Fi魄删dH．A．，h岫R．C．，Pf讲．EVidenceforadise嬲e—resista】∞epa．凼、ⅣayindcesiIllilart0Ⅱ1eNPRl-mediatedsignalingpa吐lⅥ，ayin心abidopsis叨．P1锄tJ，2001，27(2)：101—113．LeHen孤仃G，F卸rineS．，瞄e位卜MazetF．，甜口，．ⅥtisvinjferaVvNPRl．1isme凡nctionalomlologofAlNPRl蛆d如overeXpression洫铲apev证e仃iggersconstitIJtiveacdV撕onofPRgenesandeIlh觚cedresistaIlcetopowde巧Injldew叨．PlaIl‰2011，234(2)：405—417．LinWC．，LuC．F．，WhJ．W，甜4，．Trallsgenictomat0pla鹏expressingmearabidopsisNPRlgenedisplayenll觚cedresist锄cetoaspecmmlof矗mgaland4l 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[77】【78】【79】【80]【81]【82】【83】【84】【85】【86】【87】[88】(place)d刮油ase：1999卟NucleicAc池Res，1999，27(1)：297—300．PreS臼噎趣eD．S．Si盟alscan：Acomputerprogr锄matscallsDNAsequencesforeukary嘶c衄1scri皿oIlaleIeme鹏叨．ComputAppIBiosci，1991，7(2)：203—206．Y00S．D．，choY．H．，sheenJ．缸abid叩sismesophyllprotoplasts：AVerS撕lecell$stemf．0r衄璐ientgeneexpression蛆出sis叨．NatProtoc，2007，2(7)：1565-1572．蔡诚．杨树CCR基因RN加表达载体的构建及其转化研究[D】．安徽农业大学。2008．丑舶gX．，ZongJ．，LiuJ．，甜讲．Genome莉de趾alysisofwoxg∞e伽：nilyinrice，so唱hum，m2Lize，加馏lbidopsisandpopIar[J]．JInte伊PlantBiol，2010，52(11)：1016．1026．RyalsJ．，W|eym锄K．，LawtonK．，甜口tTheArabidopsis血n1proteinshowSho啪lo斟t0也em锄nali锄衄sc喇onfactor城bitori皿appa】b川．111ePlantCeUOmm，1997，9(3)：425—439．ChenC．，ChenZ．Pote瓶a廿onofdeVelopmentaj时reglllatedplantdefellSeresponsebyAtW℃KⅥ8，apamogen—iIlduced锄bidopsistr锄1Sc邱tionfactor叽Pl趾tphysiology，2002，129(2)：706—716．、ran砌otoS．，NakanoT．，SuzIlkiK．，ef口LElicitor-induaedactivationof仃a璐cri皿onviaW也ox-relatedcis—actil培elements丘omab丛iccmtill嬲egenebyWRKY的11Scrip缸onf-actorSintobacco[J】．BiochiInBiophysAc饥2004，1679(3)：279．287．DongX．N．NPRl，aLll廿l：．mgsconSidered阴．Cun-entOpillionillPlalltBiolo既2004，7(5)：547—552．2m趾gYL．，ChengYT．，QuN．，甜讲．NegatiVereg山a：cionofdefenSeresponsesin缸abidopsisbytwoNPRlp批gs【J】．PlantJo啪al，2006，48(5)：647-656．LiuGS．，H01ubE．B．，灿onsoJ．M．，Pr口，．Am嘲bidopsisNPRl一likegene，NPR4，isrequiredfor击se硒eresistance[J】．PlantJoumal，2005，4l(2)：304—3l8．W抽gD．，Amoms螂anitchN．，DongX．Agenomicapproachtoidenti匆regulato巧nodesinthe仃aIlScriptionaln舐ⅣorkofsySte血cacq岫．edresistallceinpl衄tS[J】．PLoSPa吐log，2006，2(11)：e123．ZI船gY，GoritschlligS．，DongX．，甜口，．Again—of二矗mctionmutationiIlapl锄tdiseauseresista]ncegeneleadst0constitutiVeactiⅥ血onofdow【lstreamsi印al仃anSductionpaⅡ1waysills配p陀嬲D，矽印r，一J『，cD删删vPJ『叨．Plantcell，2003，15：2636．2646．43 【89】Sllir锄oY，‰hrooP．，ShahJ．，甜讲．Ag血-of．劬ction删onin匝彳阳6泐猡括TbUIIlterlelll【iIllreceptor．nucleotidebilldingsite—leucine—richrepeat够peRgenetriggerSilefeIlSereSpoIlSesandresultsi11eIlllanceddise弱eresistaIlce阴．P1antcell，2002，14：3149—3162．[90】EkengrenS．K．，LiuY，Sclli行M．，甜讲．TwoMAPKc硒cades，NPRlandTGA缸蛐scriptionfIaCtorSplayarolem尸胁一mediateddiseaLseresistanceintomat0【J】．Pl锄tJo啪al，2003，36：905—917．【91]vanWreesSCM，deSwartEAM，V狃PeltJ．A，甜耐．E11h姐cementofiIlduceddiseaseresistaIlcebys砷【llltaneousactivationofsalicylate一孤djasmona_te—d印∞dentdefellsep甜1waysi11彳厂口6坷哪括彻加撇[J】．ProcNa廿AcadSciUSA，2000，97：8711．8716．【92】魏国．两种植物NPRl基因的克隆及其对杨树转化的研究【D]．安徽农业大学，2010． 附录A：中英文缩写与注释6-BA：6．be越可laminopu血eAmp：AmpicillinAS：Acet0掣血goneC心压V35S：35SpromoterofcaulmowerInosaicvirIlSCn姐l：Ce够ltrime廿1ylaⅡlInoniumbromideddH20：Distmed锄tdeionizedV，aterEII强C：Die廿1ylpyroc砷ona_teDMSO：Dime廿1yl刚f0)【idedNTP：DeocyribonucleosidetriphoSphateE．coli：EscherichiacoHmA：3一Indolebu留ricacidK匝：K锄锄叫cinLB：Lllria-bertanimem啪MS：Mu均shige锄dSk009me出啪NAA：NaphdlylaceticacidNaAC：SodiⅧn∞etateOD：Opticaldens时PR：Pamogenesis—rel曲甜proteinPCR：Polymer嬲echainrea商onPVP：Polyv埘lpy仃0Hdonem￡砒缸npicinRT-PCR：Reve璐e饥吣cIipta：帆ePCRSAR：Syste血c∞q毗dresistanceTris：Tns(Hydro巧me也y1)舭血ome也aneYEP：、飞：astexn。actandpeptonemedium456．苄氨基嘌呤氨苄青霉素乙酰丁香酮花椰菜花椰病毒35S启动子十六烷基三乙基溴化铵双蒸水焦碳酸二乙酯J¨、I，y、h■^·侧H二甲基亚枫脱氧核糖核苷三磷酸大肠杆菌3．吲哚丁酸卡那霉素LB培养基MS培养基萘乙酸醋酸钠光密度病程相关蛋白聚合酶链式反应聚乙烯吡咯烷酮利福平反转录PCR系统获得抗性三羟甲基氨基甲烷Ⅵ三P培养基 附录B：杨树Ⅳ豫J．J基因序列1a_tggataaCaggattl蛩gtlmct(旭a_cI|ctaacgagatcagcaatggaagk唱cacttgc61蟾catag姐actccctc盟cttca缸gccttt‰龃acccag勰attgcagctc仕C砚121c勰ctatcagg强acc屹aagccatcn屯actcccaaga：ttt船ac删gc唔at181gcca猢tcac龃gctcca酬【acaccc垂g船垂cccagttcacagg蟾c酬枷ct241gcgagaagtccttttttc强ga垂gttttctcgagtcc培蟾gct{遗agacagaagtggg301gtggcaaagtttgaattgaaggaa_ttggctaaggac魄a：蚍ga吡ga位cactt361atgacagtcttgggtta砒gtatt寸gggaaa昏gaggccttggcct{mga蜒乒仳垂421gctt垂垂gga蟾atgattg讹cca龇gc仕gcaggcc蟾ca酬【gatctcc培act481gagg讹tt魄cctctttl№attccag触agttgg蟾gc删cagagg541caccta_t魄ac甜c魄acaag垂骶舱ctgatgacatcttgg培a仳c魄cagtt601gcaaac砒lt垂g垂gaagctt垂gagagattgc纰屺龃ga蟾cg魄agatta嚼g66laaatcaaa士{争：tga诅ttgttactctggataaagccttgccgcaa_ta【catt垂gaagaaa721a位吨gattctc垂吨gaact嘻gtt吨删gcc蟾agaacagtaacttactagat781aa蜀【cat昏锄agagaatacatcgggctC谵gactcggatgat垂喀agcta星乒tagaatg84lctactgaaagaggcacatactaatctagatgatgcgca蟾cactCcac协唔c蟾ttgca901tactg屯a蟾c勰agactacaactgag舭t蟾撕gatt；agctgat舒t磁ctgc961aga柏ttc彻ggggttaCaccg蟾c屯catgtcgc蟾c锄蟾cgg粕agatcctaaga_tt102latag瞰ctctcttaacgaagggagctcggc啦agatcttactttagatggtaggaag1081gctctgcagatatc啪acgacttaC龃gggccatgg批at醐舀caacagaggaa141ggaaaagcttctcccaagg乏曙cgcttgt|gta．tagaaa龇ggaacaagcagaaaggagg1201gatcc舭魄gagaggc仕ctCtttctcttgctatggc蟾群ga培acc蟾cgaatg1261aaa．ttgttgtaccttgaaa2Ltagagttggac蟾gcgaagctcctt仕tccca_tggaagca1321aaagttgcgatggatattgctcaagt蜒；atggtacttctgagtttccattagctggcatc1381aggcccagcatcttgtc谵g噜ccca飙ggggagc谵培gact唔雅cgaggcacctttc1441ag龃培cacgaggagcatctaaataggatgagagcactctc切g龃c哟gaac魄gg1501aaacg萨ttttcccacgttgctcagacgtactcaaca粕atcatgga屯c蟾atgaccta1561tcacgga：tagctcatttaggg跗瞎砚ac讹agaggaacgacttg嘻aag龃acagaga162lcacangaactccaggaagctctaagc彻ggcattcaatg勰gata髓c龃gagttcgac168lag酏tgtcatatcatC讹atcatccacca呼caattggcacggcgagglct锄船gg174laagct眦gacatgg昏g蹴gtcattag 附录C：杨树Ⅳ豫J．2基因序列latggct锄：ttl：ctCtgagcc觚cgtCatctc姆agctat∞仕CatCttctcatttatca61柏堍ctc硇化Igtcacaacatatcc锄ctcctcagg蟾c培aggcgggaactagtctt121gaggtgaHagtcl凇嗍ctgagctc诬删【髂agcagc倒衄attgaCtccauct181tgtga岫gtga嘻c谵砒岫gt(gtcgagg豇accgctattggcg讹accgat班241attttaggtg曲唱g楚：ta雒触tcc∞ga醣gtttaggagag锄肋gggat|cttCa301gagaaag勰ggaaaaccaaagta：ttgcttgag蜒乒l：tttgttaacttg蟾gaaaggngga361tatgaagccttcctaa：ttttcngagcta：吡垂ataC蟾ga脚国ctcaagccatctcca42la啦粕粤ctcaacat醇gttgac勰t醇at垂gccca唔a培c群垂agaCc蟾c锄：tt481锄：ttl：tgc呼gg衄地a培诅tgcatC昏ccata僦c嬲gtaccagagctggtttca541cttttccagagacgcc位caga∞ttt跳gg姐agct酬蹴gaag吨Itgattcca601atCcttgtggttgcc位cca：吨cc觚tt砚垂cagcttgtCacacaat醇酣g心崾ra661atagcacggtc蟾atct唔∽aacat鼬ctattgag龃ggagcttcccca培atgt蟾ca721g始勰aHa勰c屯ctccg∞gc删ctatttc旭a姆aaga勰∞勰c∞agaggct781gtggatgcctIgc蹴柏a乏唔ag龃tc粕gaggattcacatggcattagactccga蟾at841gttgaaCt唔唔a碰地位ctcc蟾actg锄似gatataaccttagatga蟾ctaacgct901ctccatca．唔c培catc酉∞tgtg酏c魄gtCgtgtc培agg蟾cttagcctcg氍961ctIgc培砷皿：砚tctlaga龃ncacgag时taCaca酣ctccaucangc屯c醐蟾1021cgaaaagaaccatcag唔a：t￡崾；tg“：aatgctggcgaaaggagczLtc蟾ctttgc龃t蟾1081acatcagatgggcaaagtgctgttag嘲cgaaggt唔acaaggccaaaagactat1141ca蟾cta龃acagagcaagggcaggaagcgaac龃ggacag垂ta蟾cat唣atatCtta1201gagaggg褫a培ag龃ggaatccaa：tj昭c蟾gg甜唔cctccatcac讹cc如lC雒蟾l261酵瞎a蟾atc蟾caca呜aagc蟾cta：tacctggagaacag缮ggc批gcaag砷cal321ttt口tccctac蟾aagccaagctagccatggacattgc∞a唔c蟾caaca∞accag砚1381tt蟾c蚺ttgc培catcaaaaggttct勰cgggaatttgagggaggttgacctaaatl2珥1gagacacc彻taatgcagaac彻柏gaCttcgttctaggatggaagccc似ga硼旧ca1501g位gaaa嘻ggccgacgatacttcccc桃ctc蟾aag蟾ctcgat醐．gttca蟾gag1561ga唔acc讹c蟾砷魄ttttaccttg砚砚gg酗accccaga蟾aac龃agaatcaag1621aggacacgtttcatggagcttaaagagga：tg妣acagggcatttacc勰ggac勰ggct1681gagactaacctcac蟾纳峰tcttcctc舭atcctcatc讹tcta蛆agatg舢m1741雄；taac龃actcagg锄眦a蟾a47 致谢在毕业论文完成之际，回想这三年的研究生生活，感慨良多。首先我要感谢我的导师项艳教授。毕业论文的每一个过程都凝结着项老师的心血，从选题到答辩的每一步，都离不开项老师悉心的指导。项老师不仅有着耐心、认真、严谨的治学精神，精益求精的工作作风，在我实验、学习做科研的每一步，为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，切实站在我的角度帮助我思考问题，鼓励我不断坚持，不断自我完善。而且项老师和蔼、宽容、睿智的做人态度，三年里在我生活的方方面面给予我无微不至的关怀，让我如沐春风，受益匪浅。再次向我的导师项艳教授表示深深的敬意和感谢!感谢在研究生学习期间给我诸多帮助的胡蕙露副教授和王勤老师!感谢安徽农业大学生物物理实验室的程备久教授、朱苏文教授、范军教授、江海洋老师、甘德芳老师为我的学习提供实验条件和技术指导!感谢实验室的沈周高、吴大强、王雯雯、程明珠、魏国、卞林玲、胡翔、王方明、杨茹、闰年、汪玲、何红升、董庆、龙甜甜、张红梅、任洁、章翠琴、赵华琳、李薇巍、王婕、王玉福、赵阳、刘艳等师兄、师姐、师弟、师妹们的鼎力协助，实验室良好的科研氛围是我试验得以顺利完成的重要保证，在实验室中有你们陪伴的每一天，都将成为我一生中最美好的回忆!感谢我的家人，你们是我生命巾永远的依靠和支持，尤其是我的父母，你们无微不至的关怀和包容，是我永远的心灵港湾，你们一如既往的信任和鼓励，是我迈向新征程的前进动力!感谢身边所有的同学和朋友，和我在一个寝室生活三年的方丹、姚雪晗、刘天天，能和你们分享生活中的点点滴滴，是多么弥足珍贵的回忆。无限的给予，汇成此文。值此论文草成之际，向所有关心、理解、支持和帮助过我的亲人和朋友们致以最诚挚的谢意! 个人简介邵元华，女，1987年9月生于安徽合肥，巾共党员。2005．2009年就读于安徽农业大学林学与园林学院园林专业，获农学学士学位：2009年9月至今就读于安徽农业大学研究生院园林植物与观赏园艺专业，研究方向为园林植物遗传育种。成果清单1．Yuanh聃Sho，GuoWei，L吨毗mg，Q迦Dong，Y啦Zh∞，BeijiuCheng，Y抽Ⅺ锄g．Genome-晡de姐alysisofBURPdomain-con蛐genesiIl鲫“加护矗加oc明勉励艄枷矿拥招伊咖pZ册f6面如∥，2011，53，743—7552．L通gW抛，YuaⅡhuaShao，YangZh∞，HongshengHe，BeijiuCheng，Y．觚Xi趾g．(knome一丽de趾alysisofFK506-bindingproteiIlgenesm尸咧玩，鲥幽Dc叩口．尸五册f肌D跆c以矿6扬地眇唧Drfe，．，2012(doi：10．1007／S11105—011—0405-3)3．H0ngshengHc，QingDong，YlIanhuaSh粕，HaiyangJi肌g，SuwenZIuBeijiuCheng，Yn)(iang．Genome-widesun，ey吼dch啦ct耐zationofthe形隧】，genef越lyin脚材船姚庇Dc明嘏尸切盯卯玎心印m，2012(doi：10．1007／s00299-012—1241—0)49