dec基因参与莫达非尼对小鼠睡眠-觉醒周期的调控及其机制研究

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1、第二军医大学博士学位论文Dec基因参与莫达非尼对小鼠睡眠--觉醒周期的调控及其机制研究姓名：褚澄申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：赵忠新201205Dec基因参与莫达非尼对小鼠睡眠．觉醒周期的调控及其机制研究摘要昼夜节律性是哺乳动物睡眠的显著特征之⋯’。昼夜1了律是指由内在生物钟(起搏器或震荡器)j托生的近24小时行为和生理学振荡。实际上，哺乳动物大多数行为和生理：常律受到昼夜节律和睡眠．觉醒双重调节。个体在特定时间的表现是生物钟与睡眠一觉醒之间整合的结果。时钟基因在许多脑区都有表达，这提示时钟基因表达的改变(独立于SCN周期机制)可能就是睡眠体系润控的基础。作为继c，

2、0ck、period、bmal和cry之后发现的第五大时钟基因，Dec基因在各物种中的生物钟调控的机制是这个基因家族的⋯‘大研究热点。目前已知钟基因Dec2在调控哺乳动物的睡眠长度上起关键作用。当该基闪突变后，睡H民时问将缩短。但这种生理和行为的异常是SCN还是生物钟昼夜1了律信号改变的结果，目前仍不清楚。不同昼夜：{了律表型与不同的昼夜1了律基凶有关，或源自某⋯特定生物钟基因不同等位基囚的表达。并且，该情况可能具有普遍性而非特例。莫达非尼有较高的安全性和较少的副作Jll，已被作为治疗发作性睡病的一线药物。与其它中枢兴奇药相比，莫达非尼毒副作用小而在临床广泛使用。目前对其机制的

3、研究多集中在肾上腺索、多巴胺、组胺和orexin能神经元及它们的相互作用方面。但莫达非尼的作川J0kNrl‘受争议，其确切分子靶点还不确定，而H关于它作用的神经解剖位点也存在很多争议。因此，研究生物钟基因表达的时空分布，尤其SCN以外的lX域与睡眠一觉醒周期的关系，以及药物干预作川有非常重要的意义。本课题旨在探讨Dec作为生物钟基因在莫达非尼介导的睡眠．觉醒中的作用及其其机制。研究主要从四个办面展开，并有如下结论。首先，探讨了正常昼夜节律下钏，基因Dec在小鼠不同脑区的表达及昼夜节律的变化，以及同时给予莫达非尼后钟基因Dec"表达的变化。本实验中，采用免疫组织化学、免疫印迹以及

4、实时荧光定量PCR技术，所选靶区为下丘脑、纹状体、海马及梨状皮层。结果显示，在埘照组的四个脑区，无论在蛋白质还是mRNA水平上，Dec2的表达均呈现出⋯。定的节律性变化；而在莫达非尼干预后，钟基因Decl、Dec2、Ckl的表达在部分时问点也郜有明显变化，且这种变化有⋯+定剂量依赖性。研究提示，钟基因Dec参与了莫达非尼介导的睡眠调控。其次，通过采取急性睡眠剥夺64,ft寸(CT8．CTl4)制作了1了律紊乱模型，进⋯‘步探讨Dec在’仃律紊i

5、jL模型中是否仍然参与了奠达非尼对睡眠的调控。通过免疫印迹发现，破坏昼夜节律周期后，在不同脑区Dec表达呈现不同的变化，考虑与昼夜i1

6、了律系统的等级性以及系统内和系统间振荡的同步化相关。而给予莫达非尼干预后Dec表达也呈现不同的变化，进‘步说明Dec"参与了莫达非尼对睡眠的渊控。第二军医大学博士学位论丈第三，通过反复睡眠剥夺制作了：钳律紊乱模型，研究钟基因Dec2在生物钟的重调定中表达的变化及莫达非尼干预的作用。免疫印迹结果显示，海马、皮层及小脑三个高丰度表达Dec2的脑区在睡H民剥夺及莫达非尼用药后，分别与对照组相比出现表达不同程度的变化。从而表明，Dec2参与了生物钟的重调定过程，其在海马区表达的变化提示与神经可塑性有关，可能参与了空间记忆的形成、巩固及消退过程。Morris水迷宫行为学实验进一步验证了上

7、述结果。研究还提示，反复睡眠剥夺可能对学习记忆认知能力有损害，且不能由睡眠恢复所补偿。通过反转平台实验发现，小鼠的再学习能力在睡眠剥夺后下降，而使用莫达非尼能有效改善相关的记忆损害。然而，在睡眠恢复期的反转平台实验中，用药组与环境对照组并无明显差异。有趣的是，在第二次睡眠剥夺后(即反复睡眠剥夺)，莫达非尼用药组优势明显，以上结果在空问探索实验中得到进一步支持。这提示，莫达非尼对认知的改善依赖于应激源的建立，而对无应激源或睡眠恢复期时不敏感。并且，反复睡眠剥夺后，莫达非尼用药组成绩提高明显。考虑到空间学习与水迷宫成绩都依赖于不同脑区间的相互作用，这些脑区组成了⋯个功能完整的神经网

8、络。因此，莫达非尼作用可能与应激源、记忆建立时程及不同脑区间相互作用反馈相关。最后，为进一步探讨莫达非尼干预对Dec转录因子表达的调控作用机制，建立了体外细胞模型。实验结果表明，在莫达菲尼刺激后的不同时问点，Dec2的表达出现了核浆转移的分布变化，这一现象在激光共聚焦及免疫印迹结果都得到证实，从而进⋯·步证实Dec参与了莫达非尼的调控机制。总之，Dec2作为一个转录因子，关于其自身的表达调控及转录调节的机制研究还不透彻。因此，探明其入核机制和调：常机制，将有助于在基因水平上深入认识睡目民障碍