调节蛋白β-arrestin 1与阿片受体样受体羧基末端相互作用的研究

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1、上海医科大学硕士学位论文调节蛋白β-arrestin1与阿片受体样受体羧基末端相互作用的研究姓名：李惠明申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：马兰20000501中文籀葵阿片受体样受体(ORLl)是1994年发现的[¨，16，旧，20。211，自从1995年在动物组织中提取到其内涎性配体孤唼肢以隶117，搪1，对英结构与功能进行了深入的研究。英基本特征与经典阿片受体完全捆同，是具有七次穿臌结构的G蚤白偶联受体，介导对腺苷酸环化酶的抑制，激活G蛋白，激活K+通道，抑制Ca2+通道，但与经典阿片受体的众多特异性瓤体只具有很低的亲和性[1,4,

2、121。适今为止，虽然没有关于OgL．受依介导产生依籁或成瘾的报道，但是长期给予孤啡默阉样可导致细胞[22,23,25．26．27．311及动物水乎上[24,28,29,30]的耐受现象，耐受是指机体在外界刺激的长期作用下，其反应性降低，因此要达到最初的效果，必须提高刺激的强度，受体介导的脱敏被认为是耐受的机制之一，也就是多次的、持续的激动荆刺激，引起受体反应性降低【刘。研究发瑰，大鼠魅室反复注射瓠啡膝，它产生的翱量依籁蛙的水平及垂直运动能力损伤随着给药次数的增加很快减弱[241，热板法实验中对抗吗啡的镇犏作用逐渐消失1301，脊髓反复注射孤啡

3、肽，其对热和机械刺激的镇编作用明显减弱128,291，表明大鼠产生耐受。此外，在细胞水平上，孤啡肽持续作用可导致受体介导的对腺苷酸环化酶的活l}生的抑朝馋躅减弱[22,23,26]，蓝斑神经元中其激活弑+逶道璐程度显著降低f4'2朝，对海马神经元及NGl08．15细胞土电压依赖性钙这遥的抑制作用降低【3I】。可见，ORL，受体可发生脱敏，但其机制目前还不清楚。以艮．肾上腺素受体为模型研究G委白偶联受体的阀源性脱敏发王霓，调节簧白Arrestins在其中起着重要的作用，它可缝合到磷酸纯的受体上，进一步导致G蛋白激活的减弱并干扰GPCR余导的其它反

4、应Ⅲ一9t31。迄今为止，已经发现Arrestins家族的六大类成员【5】中在抠神经系统分布最丰富的3-arrestin1和B。arrestin215,6,7]的过量表达能够影响许多GPCRs所介导的细胞内信号反应，包括p，．肾土腺素受体，A莲，．乙酰；l袋碱受傣争Ⅸ科’g-上骧素受舔酗，¨1。然而，对于13-arrestinl在ORL．受体脱敏反应中的作用及其分子调节机制，目前尚未见任何报道。鳗此，在本研究工作中，我们首先以』,-M--肾HEK293细胞为貘翟，共转染§．arrestinl季口ORL，受俸，分别通过WesternBlot和免疫

5、荧光标记证实他们表达后，采用『35S]GTP?S结合分析法测定p—arrestin1对受体介导的G蛋白的激活的调节作用，发现垫一arrestinl可明要减弱舔唼袋载激强ORL；受体与G蛋叁的氆联。对大多数GPCRs的成员来说，受体的第三个胞内环和C末端是信号起始争终止秘关捷部位【2—1，因此我们透一步麓建了ORL，受体e末端与谷光甘肽硫转移酶(GST)的融合蛋白质粒，经IPTG诱导表达后，采用GSH，sepharose4B纯化以获取大量的纯化蛋白；同时体外诱导表达13一arrestin1，经Heparin．SepharoseCL。6B、Q．se

6、pharoseFF亲和照析柱纯化，获得纯化的13-arrestin1；进一步采蠲GST拖曳实验测定ORL．受体C末端与p。arrestinl是否存在直接的结合，结果表嬲ORL，受体C末端能够与体外纯化妁13-arrestin1直接结合。同样的实验也证臻ORLl受体C未璃可与SK．N．SH细胞内源表达的§。arrestinl结合，提示3-arrestinl可能通过与ORL。受体C末端直接结合而调节受体的脱敏。本瀑题照其弛成员最近对经典阿蔗受露的研究表明，§．arrestin1能选择性调节KOR、DOR、MOR的反应性，能够明显减弱KOR与DOR介

7、导的G蛋白的激活和腺苷酸环化酶的抑制，但却不影响MOR的反应眭f21，本研究采用GST拖曳实验发现，移◇RC未璃与ORL，受体C末端一样，都可与镶外纯化的以及细胞内源表达的8一arrestini直接结合，但它们之间存在着差异，表现为ORL．受体C末端与D-arrestint的亲和性比DORC末端与13-arrestinl亲和性低，在100．200mM确NaCl釜离子浓度下帮可发生解离，而DORC未臻与3-arrestint的解离需要的盐浓度较高，在200．350mM间，这些研究结果可以部分解释，在相同条件下不同难型阿片受体会发生蔗异性脱敏【2，

8、14]。已有臻多证据表胡，缀典阿片受体c来璃秘潜在砖篓氨酸，苏氨酸磷酸化位点突跫后能抑制受体的脱敏[32,33,34】，为了确定ORL，C末端中哪个f