高血糖激素(chh)在凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)生理代谢中作用机制的研究

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1、高血糖激素（CHH）在凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）生理代谢调控机制的研究高血糖激素（CHH）在凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）生理代谢中作用机制的研究摘要高血糖激素（Crustaceanhyperglycemichormone，CHH）是一类非常重要的神经肽激素，在甲壳类体内行使多种重要功能。本文首先克隆得到凡纳滨对虾高血糖激素基因的全长cDNA序列，重组表达其开放阅读框（ORF），然后将纯化的重组高血糖激素注射到凡纳滨对虾体内，以此来研究高血糖激素对对虾生理代谢调控的影响，主要包括方面的内容：⑴凡纳滨对虾高血糖激素基因的全长克

2、隆和原核表达；⑵注射重组高血糖激素对凡纳滨对虾鳃丝离子转运、血细胞防御、糖类代谢作用的研究⒈凡纳滨对虾高血糖激素基因基因克隆和表达分析通过RACE技术获得凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）眼柄高血糖激素（LvCHH）全长cDNA序列，全长846bp，GenBank登录号：HM748790.2。序列分析表明LvCHH基因含有65bp的5’端非编码区、436bp的3’端非编码区和345bp的开放阅读框，而且3’端非编码区含有保守加尾信号（AATAA）和poly（A）尾巴，开放阅读框编码114个氨基酸，信号肽长度为24个氨基酸，具有高血糖激素家族特有的标志肽段

3、。同源性分析显示，LvCHH与相近物种的同源性较高，其中与刀额新对虾（Metapenaeusensis）的同源性为76%，与斑节对虾（Penaeusmonodon）的同源性的为65%，与云斑厚纹蟹（Pachygrapsusumarmoratus）的同源性为53%，这些序列中都含有保守的6个半胱氨酸残基；由系统进化树分析可知，LvCHH与日本囊对虾（Marsupenaeusjaponicus）、斑节对虾、刀额新对虾聚为一枝，通过与同物种的不同CHH序列进行比较，推测LvCHH为CHH-A型中的一种基因；LvCHH基因在凡纳滨对虾腹神经、眼柄、心脏、肝胰脏和肌肉中均有表达，其

4、中心脏和眼柄中的表达量较高，肌肉中的表达量较低，而鳃丝中没有表达。通过构建LvCHH基因原核表达载体p32a-LvCHH，在大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21（DE3)中诱导表达含6个His标签的重组LvCHH融合2+蛋白，由带有His标签的Ni亲合层析柱纯化得到重组高血糖激素蛋白，经SDS-PAGE分析显示在20KD处有显著诱导条带，与预测的分子量大小基本一致，万方数据高血糖激素（CHH）在凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）生理代谢调控机制的研究Westernblot分析表明可以与anti-His抗体特异性结合，从而证明高血糖激素重组蛋

5、白在大肠杆菌中成功表达。在注射纯化重组高血糖激素后48h内，测定鳃丝++++Na/K-ATPase活力和血糖含量，结果表明，各处理组Na/K-ATPase活力在0-6h-1内呈峰值变化，均在1h时达到最大值，20和30μg纯化蛋白/shrimp处理组在1h时显著高于对照组水平（P<0.05）。2.注射高血糖激素对凡纳滨对虾鳃丝信号通路和离子转运的影响本部分研究了在注射重组高血糖激素对凡纳滨对虾鳃丝信号通路和离子转运的影响。实验共分为3个处理组（对照组、10μg纯化重组CHH蛋白/shrimp处理组、20μg纯化重组CHH蛋白/shrimp处理组），各处理组均设置3个平行，

6、取样时间：0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h。结果表明：注射高血糖激素后，各处理组鳃丝生物胺含量均有显著变化，但是变化最明显的是NE，DA只在6h，5-HT在3、6h时显著高于对照组水平，说明响应高血糖信号最主要的生物胺是NE，且不同处理组之间生物胺含量没有显著变化；各处理组cAMP含量只在1h时显著高于对照组水平，而cGMP含量在1-48h内均显著高于对照组水平，说明起主要作用的是cGMP，且存在一定的剂量效应关系；而响应cGMP的蛋白激酶主要是PKA；而三种离子转运酶首先响应的是++—Na/K-ATPase和HCO3ATPase，V-ATPase

7、活力在12h后才开始显著高于对照组水平。血淋巴渗透压也是在12h后开始显著升高。通过以上的分析，可以得出在注射高血糖激素后，信号传导的途径为：NEcGMPPKA和PKC三种离子转运酶血淋巴渗透压。3.注射高血糖激素对凡纳滨对虾糖类代谢影响本部分研究了在注射重组高血糖激素对凡纳滨对虾糖类代谢的影响。实验设计同上，结果表明，在注射高血糖激素后，肝胰脏cAMP和cGMP的含量表现基本一致，都是在3-48h内显著高于对照组水平，说明肝胰脏cAMP和cGMP响应高血糖激素的刺激在同一水平；肌肉中的糖原合酶活性没有变化而糖原磷酸化酶的活性