桑叶降糖活性物质dnj分离纯化及其体外药理活性研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名塑日期：己。l午年r月710FI关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子

2、版，允许被查阅和借阅。本人授权广')'Hrll医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名塾!望论文导师签名日期：zol(f年F月摘要目的：1．采用高效液相色谱一蒸发光检测(HPLC—ELSD)法建立一种稳定、可靠、重现性好的桑叶生物碱DNJ(卜脱氧野尻霉素)含量测定方法；并且以DNJ含量为评价指标，在单因素实验基础上，运用响应面分析法(ResponseSurfaceMethodo

3、logy)优选桑叶生物碱提取工艺：2．以DNJ含量为评价指标，筛选分离纯化桑叶生物碱效果最优的阳离子交换树脂，并考察其上柱液流速、洗脱液浓度及洗脱液流速等影响因素，进而得到最佳分离纯化工艺：3．考察桑叶生物碱对淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶体外抑制活性试验方法；同时，进行酶活性抑制反应条件优化及酶动力学研究，考察桑叶生物碱对其酶活性抑制药理活性。方法：1．采用高效液相色谱一蒸发光检测(HPLC—ELSD)法建立桑叶中生物碱含量检测方法，通过单因素及响应面分析法实验，考察乙醇浓度、pH值、料液比及浸提时间

4、4个因素对提取率的影响，得到桑叶生物碱的最佳提取工艺；2．以DNJ生物碱含量为评价指标，进一步筛选出分离纯化效果最佳的树脂类型；通过考察上柱液流速、洗脱液浓度及洗脱液流速等三个因素，得到桑叶生物碱最佳分离纯化工艺：3．体外模拟Q一葡萄糖苷酶反应体系，应用三种Q一葡萄糖苷酶，即淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶试剂盒，分别进行桑叶生物碱的酶活力抑制率测试实验，利用Lineweaver-Burk双倒数做图法，进一步确定最佳反应体系及酶抑制动力学类型。结果：1．采用HPLC-ELSD法，以DIKMAPlatisi

5、lNH2(4．6mm×250ram，5um)为色谱柱，流动相为乙腈一水(90：10)、流速为1．Oml·min-1、ELSD漂移管温度40℃、及载气流速为3．5×105Pa等条件建立生物碱含量测定方法；方法学考察结果显示0．3562．8481．tg·mL。1范围内质量浓度与峰面积呈良好线性关系、同时精密度RSD=O．54％、稳定性RSD=O．98％、重现性RSD=I．46％、平均加样回收RSD=2．75％等各项指标均显示此种方法不止精密度高，稳定性和重现性优，且加样回收率亦显示此种方法可行：采用H

6、PLC-ELSD方法来测定桑叶生物碱的含量，确定桑叶生物碱提取的最佳工艺参数为乙醇浓度66．53％、pH值为6．66、浸提时间2．73h；在此条件下，桑叶生物碱实际提取量为0．1946％，较以前的文献研究提取量有明显提高，并且通过3次重复验证试验，结果显示桑叶生物碱DNJ平均提取量为0．1967％，RSD为0．23％。2．通过工艺考察，筛选出001×7型阳离子交换树脂作为分离生物碱的树脂类型。其最佳分离工艺为：上样液生物碱浓度1．75mg’IⅡL～、洗脱液浓度为氨水乙醇浓度(80：20)、洗脱液流

7、速1．5m]／min进行洗脱效果最佳，经001×7型阳离子交换树脂处理后的桑叶生物碱DNJ在浸膏中含量可达29％以上，并且通过方法学考察实验得到此工艺精密度高，重复性及可操作性强。3．体外活性试验表明，桑叶DNJ抑制三种Q一葡萄糖菅酶活性作用中，其仅对蔗糖酶的抑制作用显著，并且随着DNJ浓度增加抑制率呈正相关递增；考察最佳反应体系实验表明在酶用量为20pL、反应时间为llmin和55mg·mL’1底物浓度时为最佳反应条件；另外，Lineweaver-Burk双倒数做图法结果显示DNJ提取物对蔗糖酶

8、抑制反应类型为非竞争性抑制。结论：l-HPLC—ELSD法建立的测定桑叶生物碱方法结果重现性好，稳定可行；2．稀酸稀醇溶媒浸提桑叶生物碱的二次多项数学模型，说明根据Box—Behnken模型、采用响应面分析法得到的桑叶DNJ提取优化工艺准确可靠；3．001X7型阳离子交换树脂能够用于分离纯化桑叶生物碱，且效果佳得率高；4．桑叶生物碱DNJ对蔗糖酶活性抑制明显，且为非竞争性抑制。关键宇：桑叶；生物碱；DNJ；响应面分析法；阳离子交换树脂；Ⅱ一葡萄糖苷酶；酶活力抑制率ⅡIsoIatio