小麦持久抗条锈品种里勃留拉抗条锈基因的分子标记

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甘肃农业大学2008届硕士学位论文2．2．2非整倍体法非整倍体法主要是应用单体分析法将抗病基因定位在染色体上。单体分析是普通小麦基因定位的最常用方法，具体步骤为：分别以21个单体为母本，与被检测的抗病品种杂交，用对抗病品种无毒性的病原菌单孢菌系接种鉴定各杂交组合的杂种Fl单体植株和来自Fl单体植株的F2代群体，根据其抗性分离表现确定抗性基因所在的染色体。自1954年美国人Sears应用小麦品种中国春成功地创造出所有可能的21种单体、缺体、三体和四体小麦非整倍体材料，人们就立即应用其为小麦抗病基因的研究提供依据。利用非整倍体小麦作为研究工具，可以将目的基因准确地定位于染色体乃至染色体臂上。单体分析是普通小麦基因定位的最常用方法，具体步骤为：分别以21个单体为母本，与被检测的抗病品种杂交，用对抗病品种无毒性的病原菌单孢菌系接种鉴定各杂交组合的杂种Fl单体植株和来自Fl单体植株的F2代群体，根据其抗性分离表现确定抗性基因所在的染色体。1959年印度的Swaminathnan首次用单体分析了小麦品种Klein．cometa的抗条锈性遗传，定位了三个隐性基因，它们分别分布在4，6，9染色体上【8】。Sears继续创建了整套的小麦双端体，通过端体分析可将基因进一步定位在某一染色体臂上，并测定基因与着丝粒的遗传距离。之后，人们应用该方法不断取得成果，目前已成功地将已正式命名的31个Yr基因中的26个定位在染色体或染色体臂上。非整倍体法可将基因定位于不同染色体上，结果可靠，但对于一个品种中包括有几个基因而这些基因间连锁或具有其它相互作用关系时，该方法难以应用。同时该方法必需具有一整套非整倍体系统。2．2．3基因推导法基因推导分析方法是以经典分析和非整倍体分析为基础，以一套抗锈单基因系或已知基因品种作为标准品种，接种一系列已知毒性基因或基因组合的锈菌菌系，比较待测品种与标准品种相对应的侵染型组合，推导其是否具有与标准品种相同的抗锈基因和基因组合。Browder(1985)19】提出了初步的抗病基因推导方法，并应用13个抗叶锈近等基因系在5个重要品种中推导出Lrl和LrlO两个基因。牛永春等Ilo】利用该方法推导豫、鲁、皖三省50个重要小麦生产品种所具有的抗条锈基因，发现Yr9所占比例最大，其次为Yr2、y，J基因。Loegering【11—2】等利用该方法对69个品种的抗病基因进行了推导并指出结果对育种有用。但随后Ready指出，这种方法不能鉴定出互补基因，反而会引起品种中含有累加基因而造成混乱(郭爱国，1993)：Johnson指出，4 甘肃农业大学2008届硕士学位论文该方法必须结合系谱进行分析，否则容易出错。Dubin在前人工作基础上完善了基因推导法则，提出了抗病基因推导的六条原则【131。朱桂清等114】根据Statler基因推导方法设计出计算机程序用来推导小麦抗锈基因，这就进一步简化了基因推导方法且大大加快了分析速度。该学说对于揭示寄主抗病基因与病菌致病基因相互作用的关系、监测病菌生理小种变化动态、指导抗锈基因的合理利用、培育抗病品种起到了重要作用。基因推导法快速简便，一次性检测品种量大，能在4"-8周了解常规杂交方法需要2．-一3年才能得到的遗传信息。然而该方法也存在一定的不足。基因推导不适于鉴定成株抗性，并且其准确性易受温度、供试培养物、鉴别能力和人为因素的影响。也没有考虑基因之间存在的相互作用，寄主或病原物基因型的杂合性以及遗传背景等因素的影响，在应用上有很大的局限性。该方法不论怎样发展，仅仅是一种假说，不能代替常规遗传分析。2．2．4分子标记技术分子标记是指生物基因组DNA经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应(PCR)扩增或两者结合等措施处理后电泳，检测到的反映基因组某种变异特征的特异性DNA片段。在真核生物中，基因组中存在着大量的不编码DNA序列，它们的变异不受或较少受自然选择的制约，因此，分子水平上的多态性较高。目前在小麦分子标记研究中，应用较多的是RFLP、RAPD、SSR和AFLP技术。分子标记是传统遗传标记的补充和发展，但与传统的遗传标记相比，分子标记技术具有其独特的优越性：(1)直接以DNA的形式表现，在植物的各个组织、各器官以及各个发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，也不存在表达与否的问题，有很高的准确性和稳定性。(2)分子标记数量多，遍及整个基因组，检测位点几乎无限，这是形态学标记、细胞学标记和生化标记所无法比拟的。(3)多态性高，自然存在的许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料。(4)分子标记不影响目标性状的表达，表现为“中性”，与不良性状无必然的连锁。(5)分子标记大部分表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息【15，161。这些特点使分子标记技术已成为当今最理想的遗传标记，也决定其能得到迅速5 甘肃农业大学2008届硕士学位论文发展和广泛应用。目前分子标记技术已广泛应用于植物遗传图谱的构建、遗传多样性分析、分子标记辅助育种选择(MAS)、指纹图谱构建等方面。这四种小麦抗条锈基因分析方法的特点见表2。表2几种不同研究方法的特点比较Table2Comparisonofdifferentresearchingmeans3分子标记的应用3．1分子标记在小麦抗条锈研究中的应用20世纪80年代以来，分子生物学的飞速发展，使分子标记技术成为继形态标记、细胞学标记、生化标记之后的一种新的遗传标记。与过去人们利用的表型标记、生化标记相比，分子标记因不受环境影响、多态性高、数量大、显性及不影响生物性状表达等优点而广泛应用。抗病基因是许多植物育种项目和遗传图谱研究的重要目标，传统的基因定位追踪困难、周期长。利用DNA分子标记技术可对与抗病基因连锁的基因组区域进行分析，鉴定染色体上特异的DNA片段，找出与抗病基因连锁的分子标记，进而确定其在染色体上的位置，大大提高抗病育种的效率，为以标记为基础的选择和分离抗病基因打下基础【17】。目前，在小麦抗条锈研究中利用较多的分子标记有：I疆LP、RAPD、SSR和AFLP。3．1．1限制性片段长度多态性标记RFLP(restrictionfrgmentlengthpolymorphism)，限制性片段长度多态性，作为遗传分析的工具开始于1974年，从80年代开始应用于植物。是较早被广泛应用的一类分子标记。是以Southern杂交技术为核心的一类分子标记。产生RFLP的分子基础是DNA中特定酶切位点上碱基对的变异，反映了DNA序列中核苷酸排列顺序的差异性。DNA在限制性内切酶识别位点发生单位碱基突变、结构重排及甲基化等，6 甘肃农业大学2008届硕士学位论文均可导致限制性片断长度的多态性。只要限制性酶选择得当，均可鉴定到DNA限制性片段长度多态性。Autrique等㈣利用普通小麦与人工合成六倍体小麦杂交的单粒传F7世代的114个株系，把抗条锈病基因Yrl8定位于7D染色体的短臂。Sun[191等以NILs为材料，利用RFLP技术对来自野生二粒小麦的抗条锈基因Yrl5进行定位，找到了1个RFLP标记Norl，遗传距离为11cM。Peng等【20】建立了Yrl5、YrH52的RFLP标记Norl，遗传距离分别为2．6cM和2．0cM。由于小麦RFLP多态性低，而且该技术对DNA多态性检测的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区，而且周期长、程序复杂，通常要使用放射性物质。因此限制了RFLP技术在小麦上的应用。3．I．2随机扩增多态性RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)，是由Williams等【2n、Welsh和Mccelland【22】分别发展起来的一种分子标记技术。RAPD是以聚合酶链式反应为基础，以单一的10碱基随机引物对模板DNA进行扩增，产生不连续产物(通常可检测到5"-'9条带)经染色后即可鉴定多态性。这些多态性是由引物结合位点的突变引起的，或由引物结合序列之间的差异产生的，属于显性标记。Olivert231筛选到与Yrl7连锁的RAPD标记OPYl5．580，并将其转化为稳定的SCAR标记SC．Yrl5。牛永春等【24】用普通小麦Lee与“Taichun929’’及“铭贤169”为材料，采用近等基因系(NIL)的方法找到了与抗条锈基因YrLee连锁的特异性片段OPR．7，其长度约为465bp。Sun等【25】采用近等基因系，利用340个引物扩增出6个多态性核苷酸片断，其中一个片断OPB13．1420与抗病基因连锁，然后利用顺序OPB13．1420．Yr15-Nor1将Yrl5基因定位在染色体1B上。Chague等t26j仓,j建了与Yrl5连锁遗传距离约5cM的RAPD标记UBC199．700，与标记OPBl3．1420(遗传距离27．1cM)相比，其连锁程度更为紧密。RAPD技术没有物种特异性的限制，对DNA质量要求不高，操作简便，但其重复性、可靠性差，通常需要将RAPD标记转化为特异性强、稳定性高的SCAR、STS标记。但其的最大缺点是稳定性及可重复性差。为提高扩增反应的特异性和稳定性，有人提出将RAPD标记转化为SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)标记，可获得较好的效果。SCAR标记具有更高的重现性，通常是共显性遗传。7 甘肃农业大学2008届硕士学位论文3．1．3简单序列重复SSR(simplesequencerepeats)简单序列重复，又称微卫星DNA，所有真核基因组中均含有一类DNA碱基序列，被称为微卫星【271它是由一类1-6个碱基组成的基因序列串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，不同等位基因间的重复数存在丰富的差异，因而是许多真核基因组中普遍存在的遗传标记来源【281。微卫星DNA广泛分布于真核生物基因组中，大约每隔分子长10---50bp就有一个微卫星DNA，由于微卫星核心序列重复次数和重复程度的不完全而造成每一个位点的多态性，但微卫星DNA两端的序列多是保守的单拷贝序列。寻找其中的特异保守区，由此设计l对位点专一的引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，进行琼脂糖凝胶电泳分离(或聚丙烯酰胺凝胶电泳)，当利用1对引物扩增不同基因型中的SSR位点时，可检测出SSR核心序列的长度多态性即为SSR标记。在小麦基因组中，重复序列可以占到其总量的83％1291。SSR较早应用于人类和哺乳动物的研究，在主要的栽培作物中SSR的分布也非常丰富，在大豆、水稻、拟南芥、大麦、小麦等植物中SSR均比RFLP的多态性高。在小麦中，SSR已被证实是一种非常有效的分子标记。Roder等【30】在1998年构建了包含279个标记位点的小麦微卫星图谱，为小麦目的基因的定位和标记建立，特别是已知基因的标记建立提供了极大的方便。Peng等【31】利用SSR标记技术获得3个与抗病基因YrH52连锁的微卫星标记，其中标记Xgwm413、Xgwm273a与YrH52的遗传距离分别为1．3和2．7cM。Bomer等【32】在Lgst79．74上获得一个距离Yms．B1基因21cM的SSR引物Xgwm493。Plaschke等【33】用23个SSR标记对40份欧洲小麦品种进行检测，共发现142个多态性位点，平均每个SSR标记能检测到6．2个多态性位点。马渐新等【34】筛选到两个与小麦抗锈病基因Yr26连锁的SSR标记XgwmJJ以8、Xgwm413，遗传距离分别为1．9cM和3．2cM，并将该基因定位在1BS上。林凤等【35J以近等位基因系Taichun929*6／HeinesVII与感病的背景亲本Taichun929构建F2分离群体，筛选出一个与小麦抗条锈病基因Yr2紧密连锁的SSR标记WMC364．207bp／201bp，其与Yr2基因之间的遗传距离为5．6eM。SSR标记具有RAPD标记的所有优点，且多态性丰富，克服了RAPD的缺点【361，具有较高的稳定性、遗传上呈共显性、DNA用量小、操作简便、重复性好‘37，38·391，是进行品种指纹分析、研究目的基因连锁关系和构建遗传图谱的理想标记，但要获得SSR引物需要进行大量克隆、测序和杂交验证工作。目前已经在小麦基因组作图、小麦种质资源遗传多样性分析、构建小麦指纹图谱、小麦品系鉴定和基因诊断等研8 甘肃农业大学2008届硕士学位论文究领域展示出较大的应用潜力。3．1．4扩增片段长度多态性AFLP(AmplifideFragmentLengthPolymorphisms)，扩增片段长度多态性是1993年由荷兰KeyGen公司的科学家Zabeau等【401发现，并有Vos等【411发展起来的一种新的DNA指纹技术。其基本原理是利用两种或两种以上的限制性内切酶切割基因组DNA，形成不同酶切位点的限制性酶切片段，在所得的酶切片段上加上双链人工接头，作为PCR扩增的模板。引物由3部分组成：从5’．3’依次为与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、3’端选择碱基序列。3’端选择碱基的种类、数目、顺序决定了PCR特殊性，使酶切片段被选择性扩增。在AFLP中，如果DNA片段遗传特性发生改变，酶切片段数目、长度发生变化，在测序胶的电泳图谱上就会显示出多态性。既有RFLP技术的可靠性，又有PCR技术高效灵敏等特点。Peng等【42】建立了20个与抗条锈基因YrH52连锁的AFLP标记，显著增加了该基因周围的标记密度。Smith等【43】人利用AFLP技术对Yrl、Yr5、Yr7进行定位研究，并将所得标记用于鉴定纷基因缺失突变体。邵映田等m】筛选到一个与YrlO基因连锁的AFLP标记PT0502，并将其转化为稳定的SCAR标记SC200，遗传距离仅为0．5cM。邓志勇和曹张军【45J采用AFLP技术并结合SSR方法对普通小麦材料Qzl80中的一个未知的抗条锈病基因和一个来自华山新麦草的新的抗条锈病基因进行了分子标记定位，为这些抗源材料和抗病基因的进一步利用奠定了基础。AFLP实质是RFLP和PCR技术的结合，既结合了RFLP的稳定性和PCR技术的高效性，同时又避免了RFLP受探针限制的因素，方便快速，只需少量DNA，而且受模板浓度的影响比较小，不需要预先知道DNA的序列信息，试验结果稳定可靠，可以快速获得大量信息，因而可以产生丰富而稳定的遗传标记。目前，AFLP技术已经被成功地应用于小麦种质资源研究中。3．1．5各种分子标记在小麦抗病基因研究中的优缺点在上述4种分子标记中，RFLP是应用比较普遍的一种，其稳定性较好，目前绝大多数分子遗传图谱都是用RFLP分子标记构建的，但是由于RFLP在小麦品种(系)内品种(系)间本身的多态性低，且操作技术复杂，成本高，需要接触放射性同位素，从而限制了RFLP在小麦中的广泛应用。分子标记技术RAPD是方便经济的分子标记，操作简单，引物通用，检测位点多，但是其重复性和稳定性较差，况且RAPD在小麦中检测的多态性仅仅能与RFLP相比。AFLP的综合信息量大，9 甘肃农业大学2008届硕士学位论文在作物特别是小麦遗传资源的研究上有着广阔的应用前景，但其技术较复杂，需要同位素操作，受专利保护，因而使得这种分子标记技术在小麦种质遗传研究中的应用受到一定限制。分子标记技术SSR操作简便，稳定性好，其具有较高的多态性、共显性分离、位点转化性、标记覆盖整个基因组、分布均匀、DNA样本用量少等优点M。比RFLP和PAPD标记更能有效的揭示遗传多样性，特别适用于其它类型标记所揭示变异水平低的物种，SSR不仅能有效地进行品种鉴定，而且能较好地揭示品种间的亲缘关系1471。大量研究表明，SSR标记是研究小麦种质遗传资源的有效分子标记之一【48“91。RFLP、RAPD、SSR、AFLP分子标记的特点详见表3。表3RFLP、RAPD、SSR、AFLP分子标记的比较Table3ComparisonofthemolecularmarkersRFLP,RAPD，SSR，ISSR，AFLP3．2分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种(Molecularmarker-assistedselection，简称MAS)是现代分子生物学与传统遗传育种相结合的新育种方式和手段。借助分子标记可以对育种材料从DNA水平上进行选择，从而达到作物综合性状的高效改良【50】。通过分子标记辅助的回交转育可以减少回交次数和回交群体，理论上只要回交3代就可选到10 甘肃农业大学2008届硕士学位论文理想的材料。因此，分子标记辅助选择育种可以快速明确育种目标，累积目标基因，提高育种选择效率，从速度、效率和方便的角度考虑，以PCR为基础的MAS受到人们的普遍重视。由于作物新品种选育涉及质量性状及数量性状两个方面，从而决定分子标记辅助选择育种在作物育种上的应用主要包括如下三个方面：(1)分子标记辅助选择育种在回交育种中的应用。回交育种对带有个别不良性状的品种改良是一种较好的选育途径，由于利用分子标记既可以鉴别目标基因(即前景选择)，又可对轮回亲本基因组进行选择(即背景选择)，因此分子标记辅助选择用于回交转育可以提高选择效率，加快育种进程。用分子标记辅助选择可以快速有效的选出带有目的基因的单株，以轮回亲本基因组为遗传背景的单株以及与目标基因附近发生重组交换的个体。(2)分子标记辅助选择在基因聚合中的应用。基因聚合是将多个有利基因通过选育途径聚合到一个品种之中，这些基因可以控制相同的性状，也可以控制不同的性状，基因聚合突破了回交育种改良个别性状的局限，使品种在多个性状上同时得到改良，创造更有实用价值的育种材料。基因聚合常用于抗性育种中，育种专家将多个控制垂直抗性的基因聚合在同一品种中，可以提高作物抗病的持久性。(3)分子标记辅助选择在数量性状改良中的应用。育种实践证明，分子标记辅助选择为传统的育种提供一种有力的辅助手段。刘志勇等【5l】对小麦抗叶锈基因Lr9，Lr24进行了分子标记诊断，结果在17份材料中筛选出与Lr9基因连锁的0．35kb的DNA片段。Tablertl52】等用与抗小麦条纹花叶病Wsml连锁的RAPD标记克隆测序后合成了转化引物，该引物使Wsml的抗性在实验室进行大批量早代选择，进而加速了Wsml导入生产品种的进程。毛龙等【531应用RAPD技术对小麦一黑麦易位系中的抗条锈基因进行了分析，筛选出OPE．12在易位系M8003中存在，而在栽培小麦中不存在，进一步证明了分子标记技术在杂交育种中检测抗锈基因的价值。Robert(2000)t”J等人利用与Yrl7基因连锁的SCAR标记SC．Y15检测面包小麦中的抗条锈基因Yrl7，并以表型检测作对照。结果发现，98％的被检品系其标记检测与表型检测一致。但仍有少量差异，推测原因可能是由于分子标记与目标基因之间的连锁断裂。尽管如此，随着大量抗条锈基因分子标记的不断发掘及精确定位，标记辅助选择必将在常规抗条锈病育种中发挥愈来愈重要的作用。现阶段分子标记辅助选择的应用还存在一定的局限性：(1)目前的分子连锁图 甘肃农业大学2008届硕士学位论文谱几乎全是用RFLP标记构建的，该标记的成本较高，很难在植物育种领域普遍应用，并且分子标记筛选和应用的费用较高。因此，还需进一步探索价格低廉，操作简单的新的分子标记。(2)标记的基因数目非常有限，以PCR为基础的分子标记数更少，因此还需进一步构建更为饱和的分子标记连锁图谱。(3)对产量、抗逆等性状的QTL分子标记研究相对薄弱，因此还需进一步对于控制数量性状的数量基因或QTL进行精确定位；(4)分子标记鉴定工作主要集中抗性强的基因上，忽视了对一些小种已丧失抗性的基因的分子标记鉴定，在有利基因标记定位的速度仍较慢。分子标记辅助育种可以大大缩短抗病育种的年限。国内外许多学者致力于小麦抗病基因分子标记的研究。小麦抗锈基因的分子标记筛选始于20世纪90年代，应用较多的是RFLP、RAPD、SSR、AFLP等，借助分子标记技术，已找到了一些抗条锈基因的分子标记(表4)。表4部分被标记的小麦抗条锈病基因Table4Taggingofsomemajorstriperustgenesinwheat4小麦对条锈病抗性的研究4．1小麦对条锈病抗性的分类所谓抗病性是指寄主植物与病原物之间相互作用所表现出来的抗病或感病的现象，是二者相互作用的结果。Vanderplank[55，56，571从群体遗传学角度，根据寄主植12 甘肃农业大学2008届硕士学位论文物抗性变化和病原物变异的相关性，把植物抗病性分为垂直抗病性(verticalresistance)和水平抗病性(horizontalresistance)，他认为垂直抗病性在遗传上一般由单基因控制，而水平抗病性在遗传上一般由多对或多个微效基因所控制，按照Vanderplank的观点，在垂直抗病系统中，抗病性是相对的，是小种专化的，对于同一小种或株系而言，有的品种表现为感病，有的则表现为抗病；另一方面，一品种对此小种或茵系表现感病，对彼小种或菌株则表现抗病。而在水平抗病系统中，抗病性是非小种专化的，只有强弱之分，而无有无之别。Vanderplank的工作促进了植物抗病性、遗传基础、利用方法等研究的深入发展。这个理论在植物病害流行学和抗病育种中仍具有十分重要的指导作用【5引。4．1．1垂直抗病性(verticalresistance)在生产上，这种抗性表现为高度抗病或免疫，由主效基因或寡基因控制。在这类抗性基因中大部分属于苗期抗性即全生育期抗性，只有少(Yrll。Yrl4,Yrl6,Yrl8等)属于成株期抗性。小麦垂直抗病性基因的遗传方式基本都属于质量性状遗传，大部分为显性遗传方式，少数表现为隐性遗传方式，也有个别基因属于半显性遗传(如Frl8)。这类抗病性容易观测，并且在育种过程中容易操作，是目前主要的抗源材料，但这种抗性容易因小种发生变化而表现为感病，因而抗病性是不稳定和不能持久的。目前，鉴定出的大部分抗条锈基因属于此类。4．1．2水平抗病性(horizontalresistance)1963年Vandcrplank提出垂直抗性与水平抗性的概念，在植病和育种界引起很大震动，但真正经典的水平抗性可能只是理论上的概念。根据VanderPlank(1963)的定义【59J水平抗病性一般是由多基因即多个微效基因(minorgene)制的，也有由单基因控制的，这种抗性表现为中度抗病。水平抗病性的表现可因环境条件不同有较大差异，一般不会因小种区系的变化而改变，这种抗性对所有小种的反应都一致，因此是稳定和持久的。在这一方面国内进行了有益探索和研究，并提出了准水平抗性概念和鉴定方法，但快速简便、可供育种学家实际采用的鉴定方法尚在研究中f60，6I】o4．2小麦持久抗条锈病的研究小麦条锈菌具有高度的寄生专化性和变异性，育成的抗病品种大面积种植后，常导致相应的条锈菌致病小种的产生和危害，从而丧失抗性【62】。在条锈病常发易变区，小麦大部分抗病品种短则2～3年，长则7～8年即由抗病变为感病。品种抗性保持时间短，已成为生产和育种上的一个突出问题。自Johnson提出持久抗性的概 甘肃农业大学2008届硕士学位论文1鼍曼鲁皇詈!曼曼曼!曼鼍詈詈兰鼍鲁皇皇曼鼍葛皇曼量量皇!曼鼍鼍喜量曼詈詈詈皇皇鼍曹鼍鲁曹暑吕皇!曼量皇!詈皇皇曼!鲁曼暑詈詈曼皇曙鼍!鼍寡皇!皇窟皇!毫曼曼鼍念后【“64]，有目的地选育与利用此类品种已引起重视，并取得了进展【6量66]。4．2．1持久抗病性的概念持久抗病性确切含义经历了由模糊、不确定到逐渐明确的过程。最初认为这种抗性，泛指具有低水平的、正向的、明显的侵染率的抗性。它对所有生理小种均有效，属水平抗性，由多基因控制【6‘71。但具有这种抗病特点的品种抗病性很不稳定，而具有持久抗性的品种在广泛种植的条件下仍能保持良好抗性。鉴于上述事实，Johnson在1983年正式提出了持久抗性的概念【6引，这一概念从基本上统一了水平抗病性的不同概念。持久抗性确切的定义是指某些品种在相当长的时间内，在利于害病发生的环境条件下，大面积多代连续或长期栽培某一作物，其抗病性仍能长久保持不变，则称这种抗性为持久抗病性，但并不意味着永久不变【69，701。半个世纪以前育成的美国抗秆锈病的Hope，乌拉圭抗叶锈病的Americano44，巴西的Universal2和Frontana，于30年代和40年代广泛种植，都表现出高水平的非小种专化性抗性。50年代，诺贝尔奖获得者Borlaug将Hope和Frontana的抗性导入CIMMYT的小麦杂交育种实践中，培育出并推广了一系列具有持久抗性的小麦品种，从而使“绿色革命’’得以诞生并获得成功【7l，721。4．2．2持久抗病性的遗传在农作物中，持久抗病性具有复杂的遗传基础。目前普遍认为持久抗病性的遗传学原因分为两类：一类取决于抗病基因的数目，基因越多越持久，即通常说的水平抗病性：另一类取决于抗病基因的质量，有些基因由于其结构、机制复杂，病菌克服时需较大的变异，这类基因称之为主效基因，少数甚至单个主效基因控制的抗病性也可能持久。有人认为持久抗性至少是由3个基因控制的，也有人认为由不同类型基因控制。根据现有的研究和报道，持久抗病性的遗传有单基因方式、寡基因方式、多基因方式、主效基因与微型基因共同控制等多种。4．2．2．1单基因方式单基因方式是最简单的持久抗病性遗传方式，多为完全显性，少数是隐性，不完全显性的情况目前尚不能确定。在单隐性方式中，有表现小种专化性的，但抗性持久。同样也有由单基因控制，却不表现小种专化性，其抗性持久【731。杨华安等【74】人认为我国小麦品种绵阳系在条锈病重要流行区应用，保持良好抗病性达10多年并成为当前生产支柱品种，其持久抗条锈性就是由单个或少数成株抗病基因控制的。Johnson(1978)研究认为CappelleDesprez的抗性由Yrl6控制【75】。Singh(1993)指出成株抗性基因Yrl8提供了Anza和其衍生品种(系)所具有的持14 甘肃农业大学2008届硕士学位论文久抗性。这一抗性组合(Yrl8complex)通过CIMMYT育种家的努力，现已广泛地分布在其培育的小麦种质中，在世界各小麦种植区表现对条锈病良好的抗病性【761。4．2．2．2寡基因方式这是由少数几个主效基因控制的持久抗性，基因间作用比较复杂，有累加作用。Green和Campbell研究指出，加拿大小麦品种Selkrik的抗秆锈基因由St6，Sr7b、跏财、Srl7、Sr23等5个基因控制的，进一步研究发现，其持久抗性归因于对Sr6，毋财基因有联合致病性的病原菌系稀少，是其抗性基因累加效应的结果。还有非等位基因之间的互作，如对一些持久抗锈性小麦进行遗传分析发现，几个等位基因位于不同的染色体上。至于其他基因之间的互作形式，如互补作用、上位性等，在持久抗病性遗传中未见报道。王殿波(2004)对持久抗病性小麦品种小偃6号进行遗传分析结果表明，其抗病性是由一种温度敏感型基因控制的，但不属于温敏微效基因。4．2．2．3主效基因和微效基因共同起作用有的持久抗病性品种是由主效基因和微效基因共同发挥作用的结果。温敏微效基因在使抗条锈病主效基因持久性方面有其保护和协作的作用，兼有主效和微效基因的品种往往具有良好的持久抗性。如小麦持久抗条锈病品种EI．178383，除主效显性基因外，还有三个微效隐性基因。单体分析表明，主效基因是在1B染色体上，而微效基因可能分别在5A、5B和5D上。Sharp[771认为微效基因对主效基因有修饰作用。万安民等(2000)对在我国对条锈病保持抗性达20年之久的繁6及其衍生系研究发现，繁6既含有主效抗条锈基因，又含有温敏微效基因【7引。徐世昌等(200t)通过对小麦品种京核891．1品系的研究发现，该品系至少含有两对显性主效基因和一对隐性微效抗条锈基因f791。4．2．2．4多基因方式多基因控制的持久抗病性表现形式多样，往往控制病害的数量变异，如反应型、潜育期、侵染率等，属数量遗传的范畴，有些类似“水平抗性"。如燕麦抗冠锈病品种RedPustproof在很长时期内，生理小种变化并未引起抗性变化，其锈病发展比感病品种晚14天，虽然后期对几个小种感病，但无明显的产量损失。Milus和Line(1986)通过对Gaines、Nugaines和Luke这三个持久抗病性品种的遗传分析表明，这些品种对条锈病的抗性是由微效基因控制的，并且估计了各个品种的抗性基因数目、基因间互作方式、遗传力等，并发现存在超亲遗传现象。 甘肃农业大学2008届硕士学位论文4．2．3小麦持久抗病性品种的选育和应用Johnson等人认为具有持久抗病性小麦品种(品系)是持久抗条锈性育种的最好亲本。因此选育具有持久抗病性的小麦品种，首先需获得具有持久抗病性的抗源材料，利用抗源材料通过各种育种途径和方法培育具有持久抗病性的品种。实践证明，引种是获得具有持久抗病性的遗传资源最简单而收效快的方法，我国自30年代先后从国外引入许多优良抗病小麦品种作为抗源在生产上直接应用。例如，南大2419、阿勃、阿夫、墨沙、洛夫林10号、山前麦等品种，这些抗性品种引入后，可直接用于生产种植，性状优良的抗性品种推广面积已达到几千万亩。但多数引入品种是作为抗源亲本，通过系统选种和杂交育种等途径育成新的品种后，进行推广种植。16 甘肃农业大学2008届硕士学位论文第二章研究的目的意义与路线小麦是世界第二大粮食作物，1998年Braun认为2020年小麦的产量要达到10亿吨，才能满足市场的需要，小麦的稳产、高产是实现这一目标的前提。条锈病是小麦生产的主要制约因素之一，200年小麦条锈病在我国大流行，受灾面积约660万hm2，造成小麦大面积严重减产，有些地区甚至颗粒无收，筛选和培育抗病品种是防治小麦条锈病害最为经济、有效和利于环境保护的途径。采用常规育种方法培育抗病品种虽然可以有效控制该病的发生与流行，但耗时耗力，难以适应条锈菌生理小种的变化速度。分子标记辅助育种可有效缩短育种进程，加快新品种的培育和利用，从而达到有效控制小麦条锈病发生的目的。近年来，分子标记特别是微卫星标记技术已广泛应用于作物遗传育种的各个研究领域。微卫星(microsatellite)又称SSR(simplesequencerepeat)，分布于小麦的整个基因组中，且在小麦中能够检测到比较高的多态性。R6deretal(1998)构建了包含279个标记位点的小麦微卫星(Simplesequencerepeats，SSR)图谱[30l，为小麦目的基因的定位标记提供了极大的方便。甘肃陇南是我国小麦条锈病的常发易变区和新小种的主要策源地。我国条锈菌新小种80％以上都是在这一带首先发现或聚集起来的，尔后才蔓延到我国广大麦区，是我国条锈病控制的关键地带。在这一地区研究、选育和种植具有持久抗病性特点的小麦品种，对我国小麦条锈病的控制具有战略意义。本研究以持久抗病品种里勃留拉为实验材料，寻找与持久抗病性紧密连锁的分子标记，以期为小麦持久抗条锈性分子标记辅助选择育种提供理论依据。具体研究技术路线如下：17 甘肃农业大学2008届硕士学位论文技术路线：18 甘肃农业大学2008届硕士学位论文第三章里勃留拉抗条锈基因的SSR标记本研究是在对小麦品种铭贤169X里勃留拉的F2分离群体抗性鉴定的基础上，建立抗感基因池，利用分子标记SSR技术，筛选与条锈病抗病基因紧密连锁的分子标记。实验分析方法和研究结果如下。l材料与方法1．1供试材料供试材料为小麦持久抗病品种里勃留拉，感病品种铭贤169，实验材料由天水农科院中梁种子站提供。2004年种植抗病品种里勃留拉，感病品种铭贤169并配制杂交组合，即铭贤169×里勃留拉，2005年得到Fl代，继续种植Fl代种子；2006年得到由Fl代中的一株单株繁衍而来的F2群体，共126株。材料种植在自然发病条件较好的天水市农科所中梁实验站，杂种后代稀植点播。1．2试剂与仪器1．2．1试剂1)本实验所用化学试剂均为市售。2)本实验化学试剂的配制参见《分子克隆实验指南》【82】；3)SSR引物由北京塞百盛生物工程有限公司合成；4)PCR扩增反应试剂(10×PCRBuffer、dNTP、Taq酶)均购白天为时代兰州百澳生物公司。1．2．2主要仪器设备1)Tgradient型PCR仪：德国WhatmanBiometra公司制造；2)5804R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司制造；3)EPS301稳压稳流电泳仪：瑞典AmershamBiosciences公司制造；4)紫外凝胶成像分析系统：美国GEHealthCare公司制造：5)JY--CX2B序列分析电泳槽：北京君意东方电泳设备有限公司制造；6)JY5000电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司制造。19 甘肃农业大学2008届硕士学位论文1．3研究方法1．3．1取样在小麦苗期返青后取样，于F2代各单株上部取3"---4片新鲜叶片，并单株挂牌标记，取下的新鲜叶片装入保鲜袋中，用冰盒带回实验室，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。．70"C冷冻保存，DNA提取前一天转入．20。C冰箱。1．3．2苗期抗性鉴定田间自然发病，当感病对照品种铭贤169的普遍率和严重度均达100％时，即可调查后代材料单株侵染型。调查标准是传统的6级划分标准，即0型，O；型，1型，2型，3型，4型。各侵染型的描述见表5181,82】。根据侵染型级别及各级侵染型数目确定抗、感类型的划分标准。。表5．小麦条锈病苗期侵染型分级标准Table5．TheclassificationstandardofWheatStripeRustinfectiontype1．3．3基因组DNA的提取及纯度的测定1．3．3．1DNA的提取1．准备工作：1)将洗干净的研钵、研杵预先放进冰箱冷冻室预冷，可减少液氮用量。2)田间采取的新鲜叶片放入装有冰的冰盒中备用。3)将无水乙醇、异丙醇放入冰箱预冷。4)在CTAB抽提液(100mM"Iris．HCIpH8．0，20ramEDTA，1．4MNaCl，2％C曰圆)中加入0．巯基乙醇，使溶液终浓度达到2％(v／v)。5)将加入B．巯基乙醇的CTAB抽提液及CTAB／NaCl溶液(10％CTAB，0．7MNaCl)放在恒温水浴锅中65℃预热2．提取步骤：20 甘肃农业大学2008届硕士学位论文由于SSR检测对DNA模板的质量要求不是很高，而且每次PCR反应的DNA用量可少至10ng，因而可以采用Dellaportaet．a1．(1983)1831的高盐CTAB提取法，简单快速，具体步骤略作修改。1)取约0．5克的新鲜叶片，叶片称重后剪成lem长，放入预冷的研钵中加入液氮迅速研磨成为细粉状，并快速转移到2ml离心管中。2)在装有叶片粉末的离心管中加入800ul预热的CTAB抽提液，用力颠倒震荡混匀溶液。3)将加入CTAB抽提液的离心管放入恒温水浴锅，65"C水浴30min，每5min颠倒混匀一次。4)加入800ul氯仿／异戊醇(24：1，v：v)，摇匀使其充分混合，冰浴静置5min后，于4℃，75009条件下离心5min后回收上层相约400ul。5)在回收的上层相中加入40ul，65。C预热的CTAB／NaCl溶液，颠倒混匀。6)用440ul的氯仿／异戊醇抽提，充分混匀，冰浴静置5min后，于4。C、75009离心5min后回收上层相约300ul。7)重复步骤(6)。8)加入300ul的CTAB沉淀液(10％CTAB，50mM"Iris．HClpH8．0，10mMEDTApH8．O)，颠倒混匀。如果沉淀可见继续步骤(9)，否则65"C水浴30min。9)于4"C，5009离心5min后，移出上清至另一离心管中。10)在除去上清的离心管中加入300ul的高盐TE缓冲液(50mMTris．HCl，1MEDTApH8．0，1MNaCI)重悬沉淀。如果沉淀难于重悬，于65℃水浴30min。重复至所有的或大部分沉淀溶解。11)加入180ul异丙醇沉淀核酸，温和混匀后于4。C，75009离心15rain。12)用300ul80％的乙醇洗涤沉淀1．-一2次，充分干燥。注意不要使沉淀滑出离心管，沉淀中既不能有残余的乙醇，也不能过分干燥，否则难以重新溶解。13)加入50ul的TE缓冲液，于4"C下静置，溶解沉淀，不要振荡，高分子量DNA溶解可能需要几个小时，溶解时间的长短依DNA完整性和多糖类污染而定。14)如果基因组DNA24小时仍不溶解，一般是由于在乙醇中时间太长或者材料叶片较老，多糖含量较大，可以加入TE缓冲液后65℃水浴，待沉淀充分溶解后．20℃保存。1．3．3．2DNA纯度及浓度测定为保证所提取DNA的质量能用于后续实验，必须检测DNA的纯度和浓度，检2l 甘肃农业大学2008届硕士学位论文测方法如下：1．1％的琼脂糖凝胶电泳检测1)1％琼脂糖凝胶的制备：O．49琼脂糖中加入40ml的1×TAEbuffer，微波炉加热至融化，待冷却至50．60"C时加入约l“l的10mg／mlEB溶液，摇匀后缓缓倒入胶槽中，使胶液形成均匀的胶层，差入梳子。待胶完全凝固后拔出梳子，然后向电泳槽内加入1×TAEbuffer至液面恰好没过胶面。2)点样：取2plDNA样液，加入适量的6×LoadingBuffer混匀后，加入样品槽点样孔中，电泳电压120V，电泳至溴酚蓝带快到达胶的另一侧。3)观察，照相：取出凝胶放在紫外透射仪下，于紫外凝胶成像分析系统中进行凝胶成像，观察分析DNA的条带。DNA条带若呈现一条迁移率很小的整齐条带，表明所提样品较纯。如果在溴酚蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存有RNA杂质，若所提总DNA在琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明DNA已严重降解。2．紫外吸收法测定取5ulDNA样液，加超纯水至lml，混匀，置于石英比色杯中，以超纯水为空白对照，在紫外分光光度计下分别测量260nln、280nm、230nm的OD值。1)纯度判定：纯的DNA溶液，其OD260／OD280值应在1．6．1．9之间，大于1．9时，表明有RNA污染，小于1．6时表明有蛋白质或酚污染；OD260／OD230应小于2．0时，表明溶液中有残存的盐或小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。2)浓度计算：DNA样品浓度(1ag#d)=OD260XNX50／1000注：双链DNAOD260=1．0时溶液浓度为50I．tg／ml，N为稀释倍数。根据浓度分析结果，将样品DNA浓度统一配制为20ng／lal的DNA样液。1．3．4SSR扩增稳定性探索实验1．3．4．1SSR反应体系优化为了得到高效的扩增产物，在进行SSR扩增前，DNA扩增的条件首先需要优化，最终实现扩增可重复的SSR图谱。我们在前人研究的基础上，分别对SSR反应体系(模板浓度、lOXTaqBuffer、Tag聚合酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度)进行了摸索研究：1)将模板设计成0．5I_tl、llil、1．5}tl、2．0I_tl4个不同梯度，选择PCR反应的最 甘肃农业大学2008届硕士学位论文佳模板的量；2)将10XTaqBuffer设计成1．0p1、1．59l、2．09l、2．59l、3．09l的5个不同梯度，选择10XTaqBuffer最佳反应量；3)将lmmol／L的dNTPs设计成1．09l、1．59l、2．09l、2．59l、3．09l的5个不同体积梯度，选择反应最佳的体积；4)将2．5U／glTaq酶设计成0．19l、0．59l、1．09l、1．5p1、2．09l的5个不同体积梯度的找出适宜的TaqDNA聚合酶体积范围：5)将10弘mol／L的引物设计成O．1pl、0．5pl、1．0p1、1．59l、2．0p1的5个不同体积梯度，找出适宜的primer体积范围；1．3．4．2PCR扩增条件探索对扩增条件逐一进行微调，每次保持其它条件不变，只改变其中一个因素，确定最优的反应条件。1)将变性温度及时间分别设计成：(D94。C，95℃；②60s、50s、10s、5s2)将退火温度及时间分别设计成：①退火温度依据不同引物而定②90s；50s，3)将循环次数设计成：①30次、②35次、③40次、④45次4)将延伸时间设计成：30s，lmin，2min1．3．5SSR引物的选取根据Rc；de等【30】建立的具有279个位点的小麦微卫星遗传连锁图上确定的微卫星位点，随机选取引物共100对，分布在小麦的3个染色体组(A、B、D)21条染色体上。1．3．6SSR引物多态性筛选用所选取的100对微卫星引物对抗病亲本里勃留拉和感病亲本铭贤169进行扫描，筛选出在两亲本间具有多态性的引物。1．3．7SSR扩增产物检测1．3．7．1变性的聚丙烯胺凝胶电泳检测．1)玻璃板的清洗：用洗涤灵把玻璃板清洗干净后，用蒸馏水反复擦洗，将洗干净的玻璃板用95％的乙醇均匀擦拭。干燥后，用亲和硅烷试剂(49l亲水硅烷(repel)，49l冰醋酸，929l双蒸水，19009l无水乙醇)均匀擦拭平板，用剥离硅烷试剂(2％疏水硅烷(binding)，氯仿配制)均匀擦拭凹板，操作过程中，注意防止两块玻璃板相互污染。待玻璃板彻底干燥后，将处理好的玻璃板中间加入间隔片，用夹子均匀夹紧玻璃板边缘。 甘肃农业大学2008届硕士学位论文2)凝胶的配置：在65ml的6％丙稀酰胺溶液中加入1201al的10％过硫酸胺，60I．tlTEMED，快速摇匀。3)灌胶：将两玻璃板倾斜成20。角，将摇匀的胶沿灌胶口缓缓灌入，并轻轻敲打玻璃板，以防混入气泡，当胶灌至玻璃板上部时，在灌胶口缓缓插入鲨鱼齿梳子，并注意防止梳子底部产生气泡。若有少量胶漏出，应及时补加聚丙烯酰胺溶胶。将灌好胶的玻璃板水平放置，室温让其聚合lh以上。4)预电泳：将鲨鱼齿梳从制好的胶中拔出，胶板安装到电泳槽上。加入l×TBE缓冲液，恒功率70W，电泳30min左右。5)变性：取51alPCR扩增产物与2ulLoadingBuffer(甲酰氨98％，pH8．0EDTA10raM，溴酚兰0．25％，二甲苯青0．25％)均匀混合，95。C变性处理5min，取出冰上冷却，待点样。6)电泳：预热的变性胶面，用吸管冲去点样孔中的尿素，插好洗净的鲨鱼齿梳，制出点样孔，取5lxl变性好的PCR产物上样。恒功率70W电泳1．5．2h。1．3．7．2银染显色银染方法参照Sanguinetii等【跗】的方法，部分步骤略做改进。银染全部过程在摇床上进行。1)固定与脱色：将电泳后的胶放入固定液(150ml无水乙醇+10ml醋酸+1340ml蒸馏水)中，平行摇动20"'30分钟，直至指示剂的颜色褪去为止。固定液可多次利用。2)水洗：用蒸馏水水洗10"--15min。3)银染：把胶放入染色液(39AgN03+1500ml蒸馏水)中，轻轻的平行摇动20--一30min。钔水洗：蒸馏水迅速水洗5s。5)显影：将胶放入显影液(22．59NaOH+1500ml蒸馏水)中轻轻平行摇动，直至条带出现，清晰为止。6)定影：用步骤(1)的固定液即可，定影约3"--5min。7)水洗：用蒸馏水水洗2"--'3min。8)观察、统计：室温干燥后，以pBR322DNA／MspIMarker进行分子量估测，统计带型并照相1．3．8抗病池和感病池的构建根据Michelmoreeta1(1991)[851介绍的集群分析分离法，简称BSA(Bulk 甘肃农业大学2008届硕士学位论文SegregateAnallysis)法，从F2群体中选取10株极抗病株，将其单株DNA等量混合，构建成抗病基因池；再取10株极感病株，将其单株DNA等量混合，建立F2群体的感病基因池。用在两个亲本间表现多态性的引物扫描抗池和感池，寻找在抗池和感池间多态，且在抗池和感池中均表现一致、没有分离的引物，根据该引物所在的染色体位置，从而将目标基因定位在具体的染色体上。1．3．9电泳数据的处理和遗传距离的估算用筛选到的特异引物对F2群体进行微卫星扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，将F2代群体单株基因组扩增的带型分为三种：抗病亲本带型、感病亲本带型及两者的杂合带型。表现型数据结合PCR扩增带型用于连锁分析，用MapMaker3．0软件以最大似然法计算标记与抗病基因的遗传距离。2结果分析2．1里勃留拉的抗性遗传分析调查所得后代群体植株的反应型如表6所示。F2群体共126株，田间鉴定23株抗，侵染型为毗，87株感，侵染型为3~4，。由于实验地当年气候严重干旱，使得部分幼苗出现干死、旱死现象，其中16株幼苗干死严重，因此无法进行田间鉴定抗感性。对可鉴定的F2群体卡方测验结果(#=o．34，P值o．70-4)．50)表明：材料群体基本符合3R：13S的分离比例，由此可推出持久抗锈品种里勃留拉的抗性是由1对显性基因和l对隐性基因互补控制的。表6里勃留拉与铭贤169杂交n世代的抗条锈性表现Table6ResistancephenotypeofF2generationderivedfromMingxianl69xLibellula2．2小麦基因组DNA的提取用Dcllaportact．a1．(1983)1拘方法提取小麦材料基因组DNA，成功提取小麦F2代单株DNA共122株。用紫外吸收法测定DNA样品纯度后，计算基因组DNA浓度，根据计算值将基因组DNA分别稀释成20ng／pl，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测稀释 甘肃农业大学2008届硕士学位论文结果，检测结果表明供试材料的基因组DNA主带清晰而集中，说明DNA提取完整、无降解现象，适合于SSR分析。小麦基因组部分DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。图1．供试小麦材料的基因组DNAFi91．GenomicDNAextractedfromwheatmaterialstested123456781-8：部分F2代群体；1-8：PartsofF2plants2．3SSR标记分析2．3．1SSR扩增反应体系和程序通过一系列的试验，确定了适合本研究基因组DNA最佳SSR反应体系和反应程序。总反应采用25ul反应体系。1)PCR反应体系：单位(¨1)TemplatePrimer1(10uM)Primer2(10uM)10×TaqBuffer(M92+Plus)dNTPsMixture(2．5mM)Taq(2．5U／u1)ddH202)PCR反应程序为：Stepl95。C，预变性4min：Step294。C，变性50s；P,魂魄Ps隧鼍魏魏浚戮魏魏豫稳＆隗P#魏豳缀M：MakerlPR：抗病亲本；Ps：感病亲本M：Maker；PR：Parentofresistance；Ps：Parentofsusceptible表7．选用引物位置及扩增出目标条带的有无缀PrimersAtwhichTargetPrimersAtwhichTargetPrimersAtwhichTargetChromosomebeltChromosomebeltChromosobelt————————————————————=——————————————————————————————————一一一一litl％,Xgwml36IA无Xgwm3012D无Xgwm5835D有Xgwml64IA无Xgwm2612D无Xgwm5655D无Xgwm99IA无Xgwm3202D有Xgwml925D有Xgwm273IB有Xgwm4842D有Xgwm2925D有Xgwml531B无Xgwm3492D无Xgwm4946A有Xgwmll1B有Xgwm3693A无Xgwm5706A有Xgwm2681B有Xgwm3913A无Xgwm4276A有Xgwm413IB有Xgwml553A无Xgwm3346A有27攀 ————————————————————■———————————————————————————————————————一一Xgwm498IB有Xgwm3893B无Xgwm5186B无。Xgwm403IB无Xgwm2993B无Xgwm706B无Xgwml40IB有Xgwm2853B无Xgwm6136B有Xgwml8IB有Xgwml813B无Xgwm886B无Xgwm259IB无Xgwm5663B有Xgwm6266B无Xgwm550IB有Xgwml613D无Xgwm3256D无Xgwm642ID有Xgwm6643D无Xgwm4696D无Xgwm458ID有Xgwm4563D无Xgwm607A无Xgwml06ID无Xgwm3974A无Xgwm2767A有Xgwm5122A有Xgwm6014A无Xgwm2337A无Xgwm3722A无Xgwm6374A无Xgwm2827A有Xgwm3562A无Xgwml604A无Xgwm437B有Xgwml02A无Xgwm5384B无Xgwm3447B有Xgwm3122A有Xgwm2514B有Xgwrrd337B有Xgwm2572B有Xgwm4954B无Xgwm2977B无Xgwml482B有Xgwml134B无Xgwm400713有Xgwm3882B无Xgwm64B有Xgwm5777B无Xgwm5262B无Xgwm3684B有Xgwm537713无Xgwm5012B无Xgwm6244D有Xgwm467B有Xgwm3192B有Xgwm6094D无Xgwm3027B无Xgwm4292B有Xgwml565A有Xgwm569713有Xgwm3742B有Xgwm2935A无Xgwm2957D无Xgwml202B有Xgwm4435B有Xgwmlll7D无Xgwm6302B无Xgwml595B无Xgwm4377D无Xgwm5392D有Xgwm4085B无Xgwml572D有Xgwm4995B有———————————————————————————————————————————————一一2．3．1．2SSR引物在两池间的扩增选取极抗和极感单株的DNA分别等量混合，构成抗病池和感病池，采用SSR技术，对在亲本间有多态性的46对引物进行进一步筛选，l@Xgwml8能在两池之间扩增出稳定、清晰的带纹，且与抗感亲本扩增条带结果一致，初步表明引物Xgwml8与目标基因连锁。根据引物Xgwml8所在的染色体位置，初步将目标基因定位在染色体1B上。2．3．2多态性SSR引物Xgwml8的群体检测随机选取小麦1B染色体组的II对微卫星引物，其中有5对引物(序列见表8)在两亲本间有多态性。用这5对引物对F2群体单株进行扫描。两亲本的特异带分别记做A型带(抗病亲本的带型一致)，B型带(与感病亲本一致的带型)。抗病池扩增出与抗病亲本相一致的特异带，记做A型带。感病池扩增出的条带和感病亲本的特异带大小相同，记做B型带。在F2群体中同时扩增出两亲本不同的两条特异带， 记做H型带(图3)。表．8抗条绣病基因微卫星标记及其染色体定位Table．8MicrosatellitelociandtheIocationonchromosome微卫星染色体位置引物序列退火温度(℃)Xgwml81BXgwm498Xgwml40TGGCGCCATGArTGCATTATClvr℃GGTTGCTGAAGAACC11AmAGG1BAGGGGATATGTTGTCACTCCA11．ATGTGATTGCG1ACGTACCC1BGGTGGTATGGACTⅪGGACACT11TGCATGGAGGCAC√蛆’ACT1BATGGAGArAllTGGCCllACAACCTTGACrrCAAGGCGTGACA5558lBCCCACAAGAACCllTGAAGAXgwm55061CATTGTGTGTGCAAGGCAC图3引物Xgwml8在扩增F2单株的PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果Fi93·ElectrophoresisofPCRproductamplifiedwithSSRmakerXgwml8inpolyacrylamidegel．M-Maker；PR：抗病亲本；Ps：感病亲本；BR：抗病池；Bs：感病池；l~23：部分砣代单株；M：Maker；Pa：Parentofresistance；Ps：Parentofsusceptible；BR：Theresistancepool；Bs：Thesusceptiblepool；l～23：TheF2plants．提取F2单株DNA，共得到124株DNA。进行扩增后，PCR产结果如表9所示。用抗、感池筛选获得的与目标基因连锁的引物Xgwml8和1B染色体上在亲本间多 甘肃农业大学2008届硕士学位论文态性SSRXgwm268、Xgwm498、Xgwml40和Xgwm550扫描F2群体，所有引物在F2群体中的分离比例都符合期望比例1：2：1，卡平方测验的P值>0．05。表9．Fz群体单株PCR结果带型统计Table9．ThenumberofbeltafterPCRamplieationinF2progenies2．3．3引物Xgwml8与抗病基因的连锁图图4．小麦1B染色体上里勃留拉抗条锈病基因的微卫星图谱Fi94．Microsatellitemapofchromosome1BcarryingLibellulaStripeRustResistantGene3讨论3．1关于亲本的选配在进行遗传分析时，亲本的选配对分析结果影响很大，要分析抗源材料或某些品种的抗性遗传特点，一般选用的感病亲本要不含任何抗病基因，才可保证对供试材料分析结果的准确性和可靠性。根据不同的实验目的，亲本选配的原则也有所不J382孔住帆瓴 甘肃农业大学2008届硕士学位论文同。本研究所选用的亲本为里勃留拉、铭贤169，其中里勃留拉为持久抗锈品种，是20世纪70年代初从意大利引进我国的，在甘肃陇南小麦条锈病常发易变区种植历史已达30多年，播种面积始终在3000hm2以上，面积种植最大的年份达到34000姘，且在锈菌越冬区及越夏区均有大面积栽培，虽然该品种历经了30年10多个条锈菌生理小种的考验，但是抗病性依然十分稳定，至今仍是生产上主体品种。根据本实验F2群体的田间鉴定结果表明，F2群体符合3抗：13感的分离比例，即符合由l对显性基因和l对隐性基因互补控制的规律。3．2关于里勃留拉的持久抗病性R．Johnson提出品种大面积种植并在长期内保持抗病性是确认持久抗性的两个标准[86,87]这是因为品种在大面积种植后增强了条锈菌定向选择的压力，只有在这种情况下依据相应的致病小种能否得以形成和品种抗性会不会丧失，才能对品种的持久抗性作出根本的判断。里勃留拉在陇南种植约30年，且锈菌越夏区和越冬区均有大面积栽培，经历了十多个锈菌小种的考验，却始终保持稳定的抗锈性，可确认为持久抗性品种。根据抗病性划分为垂直抗性和水平抗性的观点，由主效基因控制的品种在育成之初表现突出的抗性，但新小种产生后易于严重丧失抗性，因此抗性保持时间短；而有多个微效抗病基因控制的品种，能感染多个小种，但发病轻，产量稳定，抗性也可相对持久【88】。根据里勃留拉多年来田间种植情况表明，里勃留拉符合水平抗性品种所具有的表现特点。3．3关于条锈病抗感性的划分记载侵染型是应根据具体情况做到尽可能详细，分级宜细不宜粗，使侵染型变化尽可能反映出基因型的差异，必要时，在相同侵染型中还应用严重度加以进一步细分，以便在分析时进行处理分类。在抗条锈基因遗传分析时，最好采用O，0；，O：+，l，1+，2，2+，3一，3，3+，4共11级分级标准，而在常规的抗性鉴定中采用0，O；，l，2，3，4共6级标准即可。本试验采用0，0：，1，2，3，4共6级标准对铭贤169X里勃留拉的F2群体进行田间鉴定标准。即0，0；，1，2为抗病型，3，4为感病型，由于鉴定标准的判断存在着很大的人为性，因此其鉴定难度较大，鉴定结果存在一定误差。3．4PCR反应体系各组分的影响SSR标记包括两个步骤：PCR反应和电泳检测。针对不同作物建立相适应的PCR 甘肃农业大学2008届硕士学位论文反应体系，是取得试验成功的关键【8川。影响SSR-PCR稳定性的因素有内部和外部因素。内部因素即PCR反应体系中的各组分的影响，其中包括模板DNA的纯度和浓度、引物的质量和特异性、Taq聚合酶的用量、MgCl2、dNTP的浓度。外部因素主要包括PCR仪的型号、PCR反应程序的设定、电泳条件等。为了得到高效的扩增产物，在进行SSR扩增前，DNA扩增的条件首先需要优化，最终实现扩增可重复的SSR图谱嗍。在本试验中，我们在前人研究的基础上，分别对SSR反应体系(模板浓度、10xbuffer、Tag聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度)进行了摸索研究，得到一套适合本实验要求的SSR反应条件：10xbuffer2．59l、Tag聚合酶(2．5U／laD0．59l、dNTP(2．5mM)2pl、引物(10uM)各O．59l。其中发现，模板DNA的量在50．200ng之间都能扩增出适于分析的有效条带，说明基因组模板浓度对扩增结果并没有明显影响，这表明SSR技术对DNA质量要求不高。3．5关于BSA法BSA(集团分离分析法，又称分离体分组混合分析法或混合分组分析法，BulkSegregateAnallysis)分析法首次由Michelmore等【85】提出并成功地在莴苣中筛选出与目的基因相连锁的标记。该方法首先从一对具有目标基因的表型差异的亲本所产生的任何一种分离群体中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的植株，构成2个亚群或集团。将每群的DNA等量混合，形成两个相对性状的“基因池”(genep001)，然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两群间表现多态性的分子标记遗传上与目标性状基因座位相连锁。在获得了与目标基因相连锁的分子标记以后，可以利用某一作图群体进行分析以便进一步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位置，这样才能完成真正意义上的对基因的标记定位。由于建池时使用了特定的分离群体，并且在分组时仅对目标性状进行选择，这样可以保证其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上就应主要在目标基因区段存在差异，因此两基因池又被称为近等基因池，这就排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠【91】。在实验中运用BSA法需要注意以下一些问题：1)在亲本的选择上要有科学的性状选择标准，并对亲本进行性状鉴定，利用两亲本杂交后分离的F2代构建基因池。本实验中选择的两亲本(里拨留拉，名贤169)分别为抗病和感病品种，在目标性状上存在较大差异，可用于BSA法进行分子标记定位。实验材料由铭贤169X里勃留拉杂交的Fl代中的一株单株繁衍而来的32 甘肃农业大学2008届硕士学位论文F2群体。2)两池内各株的DNA要等量混合，两亲本的遗传背景比较一致时，建池植株数可少至5株，如遗传背景差距较大，可增加株数。在本实验中，利用紫外吸收法计算基因组DNA浓度，根据计算值将基因组DNA分别稀释成等浓度，从而保证两池内的各株DNA能够等量混合。建池前用初步筛选的46对引物分别和F2群体单株进行扩增，目的为剔除杂和体，从而保证抗感池的表现与亲本相同。由于小麦基因组太大，建池的株数不宜太大，否则多态性太高。3．6引物与抗病基因之间的关系本研究将实验数据汇总，利用Mapmaker3．0构建遗传连锁图谱，结果Xgwm引物的排序和长短臂位置与R6deretal(1998)发表的顺序相悖，鉴于此，利用GGT软件(VanBerloo1999)构建了1B染色体上两亲本间多态的SSR标记图谱，并根据BSA分析结果将抗锈基因(Yr-Liu)标记在Xgwml8附近，而没有进一步标记该基因在1B上的具体位置。出现这一问题的原因可能在于F2单株的大量死亡，由于2007年天水遭遇旱灾，试验点(天水农科所中梁试验站)缺乏灌溉实施，造成F2单株大量死亡，这样就破坏了F2群体的天然分离比例。因此，关于持久抗条锈品种里拨留拉所携带的抗锈基因的准确位置有待进一步研究。 甘肃农业大学2008届硕士学位论文致谢本研究是在导师尚勋武教授和王化俊教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验设计到材料的创建、收集、实施、结果分析，直到论文的最后完成无不凝结着两位老师的心血。千言万语无法表达我的感激之情!三年来，两位导师不但在课题研究上倾注了大量心血，而且在我的个人成长过程中给予了极大关心、支持和鼓励。三年中从导师处学到的不仅仅包括前沿的学术思想和实验技能，而且还有做人的道理。恩师严谨务实的工作态度、谦虚谨慎的学术风格和高瞻远瞩的大家风范如同指路的明灯，将永远照亮弟子的前进方向。在此特向尚勋武教授和王化俊教授致以诚挚的谢意!在论文的完成过程中，得到了甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室全体老师和同学的大力帮助，正是各位老师和同学的关心和支持，我的实验才得以完成。感谢在天水农科所中梁试验站做大田鉴定期间，中梁试验站站长宋建荣研究员、岳维云老师和吕莉莉、王希恩、张耀辉、王娜、宋怡等小麦组成员的帮助。感谢王汉宁老师、党占海老师的评阅并提出了宝贵的意见和建议。试验过程中还得到戎伟硕士、边秀秀硕士、周喜旺硕士，马占军硕士，师弟车卓和师妹任亮的帮助。余斌同学在试验设计和试验过程中提出了宝贵意见和支持，在此一并感谢!感谢我的舍友们三年来在生活和学习上给我的帮助和关心。本文的完成还离不开甘肃农业大学农学院老师的辛勤培育。感谢他们在这三年的时间里对我们的关怀。最后，我要在这里感谢对我的学习和研究工作给予巨大支持的父母，几十年来他们起早贪黑，辛勤劳作，无怨无诲，为子女的教育付出了自己的一切。在此，谨向所有在我攻读硕士学位期间给予无私帮助的人们表示我最诚挚的谢意!刘娟2008年5月 甘肃农业大学2008届硕士学位论文参考文献【1】McintoshRA，WeUingsCR．Wheatstriperust：Globalperspectives【A】．BreedingWheatwithStripeRustResistanceconferenceproceedings．2002．CIMMYT．【2】MeintoshRA，BatianaHS，WellingsCR．Breedingforstriperustresistancetoleafrustandstriperustnwheat忉．PlantPath01．2002，41：523-一527．【3】李振岐，曾士迈．中国小麦锈病【M】．北京：中国农业出版社．2002．【4】万安民，吴立人，金社林，姚革，王保通．中国小麦条锈菌条中32号的命名及其特性[J】．植物病理学报．2003，30：347～352．【5】万安民，吴立人，金社林等．2000-2001年我国小麦条病发生和生理小种监测结果fJ】．植物保护．2002，28(3)：5～9．【6】马渐新，周荣华，董玉琛等小麦抗条锈病基因定位及分子标记研究进展【J】．生物技术通报．1999，l：1～6．【7】BiffenRH．Mendel’slawofinheritanceandwheatbreeding[J]．J．Agric．Sci．1905，1：4"-一48．【8】何家泌．，J、麦抗病遗传学【M】．北京：中国农业出版社．1994．【9】BrowderLEParasite，host，environmentspecificityincerealrusts[J]．AnnRevPhytopath．1985，23：201～-222．【lO】周兖晨，张相歧，王献平等．滨麦抗条锈基因的染色体定位和分子标记【J】．遗传学报．2001，28(9)：864---869．【11】LoegedngWQ，eta1．CanadianJournalofBotany[M】，1971．【12】Mago，SpielmeyerW，LawrenceGJ，LagudahES，EllisJGAPryor．IdentificationandmappingofmolecularmarkerslinkedtorustresistancegeneslocatedOllchromosome1RSofryeusingwheat-ryetranslocationlines[J]．TheorApplGenet．2002，104：1317"--1324．【13】郭爱国．小麦抗病性基因推导方法的发展及利用【J】．河北农业大学学报．1993，16(2)：98～103．【14】朱桂清．小麦抗秆锈病基因推导的计算机应用程序及应用【J】．沈阳农业大学学报．1998，1290)：205"--209．【15】方宣钧，吴为人，唐纪良．作物DNA标记辅助育种【M】．北京：科学出版社．2001．【16】郑敏，罗玉萍．真核生物基因组多态性分析的DNA指纹技术【J】．生物技术．1999，9(3)：35"38．【17】陈万民，冯洁．DNA分子标记在植物真菌病害研究中的应用【J】。植物保护学报。1999，26(3)：277"--282．[18】AutriqueJE，eta1．RFLPmappingofgenesassociatedwithdifferentagronomictraitsand35 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