凡纳滨对虾引进群体与养殖群体间的遗传差异

《凡纳滨对虾引进群体与养殖群体间的遗传差异》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

上海海洋大学硕士学位论文凡纳滨对虾引进群体与养殖群体间的遗传差异姓名：杨柯申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：马凌波20090501 上海海洋大学硕士学位论文凡纳滨对虾引进群体和养殖群体间的遗传差异摘要凡纳滨对虾的种质资源关系到凡纳滨对虾养殖的可持续发展，然而目前国内没有优良的品系，主要通过引进亲虾后选育的子代来育苗。许多形态学和育种学的数据表明，随着世代的增加，繁育的子代经常出现严重的种质退化。本文使用PCR．IULP和微卫星两种分子标记方法分析了2008年引进的SPF(Specificpathogenfree)J'L纳滨对虾群体GO、2006年引进的SPF亲虾繁育的第一代群体(G1)、第二代群体(G2)的遗传结构差异。主要结果如下：(1)PCR．RFLP分析中，使用AluI，TaqI，MboI，Spel，Sspi共5种限制性内切酶对凡纳滨对虾线粒体DNA控制区进行酶切分析。单酶切得到2"4个单倍型，AluI，SpeI，TaqI三种酶在个别样本中没有酶切位点。三个群体中的复合单倍型类型分别为3个，7个和9个，没有发现为三个群体所共有的复合单倍型，但在任何两个群体之间均获得一个共享复合单倍型，结果显示复合单倍型的分布在群体间差异显著。逐渐增大的核苷酸多样度及单倍型多样度说明养殖群体比进口群体具有更大的遗传多样性，聚类分析的结果说明G1和GO的亲缘关系更近。(2)从13对凡纳滨对虾微卫星引物中筛选出多态性好的8对，对2008年引进的SPF儿纳滨对虾亲虾与2006年引进SPF亲虾繁育的第一代、第二代群体进行遗传多样性分析。8个座位共获得64个等位基因，位点的等位基因数在5"--'13之间。位点的多态信息含量PIC在0．4052"-'0．8693之间，其中有6个座位为高度多态位点，适合于多态性分析。8个座位丢失的和新产生的等位基因共30个，占总数的47％。三个群体的平均观测杂合度分别为0．1938，0．1961，0．2325，这和已报道的数据相比，三个群体的遗传多样性较低。对比每个座位的等位基因频率显示群体间差异显著，这和比较位点杂合度得到的结果不完全～致。对固定指数Fis分析显示三个世代群体中存在近交，通过对哈迪温伯格平衡检验显示所有座位均显著偏离平衡，存在杂合子缺失。通过配对Fst固定指数和Nei遗传距离分析显示三个群体之间有明显的遗传分化。雌雄个体的基因频率差异显著，说明雌雄个体可能受到不同的选择压力。根据实验结果推测近亲交配是凡纳滨对虾群体发生种质退化的原因，而较高的选择压力、遗传漂变和突变是引起遗传变异的来源。由此我们建议在良种繁育时综合使用选择育种和杂交育种的方法，例如建立独立的选育品系，然后进行杂交，以获得高的选育效率。T 上海海洋大学硕士学位论文关键词：凡纳滨对虾，育种，PCR．RFLP，微卫星，近亲交配，遗传变异 上海海洋大学硕士学位论文GeneticDifferencebetweenImportedPopulationandCulturedstocksofLitopenaeusvannameiABSTRACTThegermplasmresourcesofLitopenaeusvannameiiserueialtothesustainabledevelopmentofLitopenaeusvannameicultivation，however,therewerenosuperiorspeciesinChina．Atpresent，togrowseedings，fillalshrimpsbredfromimportedprimaryparentweremostlyused．Andlotsofdatafrommorphologyandbreedingshowedageneticalcharacterizationdeclineofthebredoffspringprawnscomparedwimearlygeneration．Inthisstudy,thePCR．RFLPandmicrosatellitemarkertechniqueswereemployedtoassessthedifferenceofgeneticstructureofLitopenaeusvannameiamongthreepopulations，includingthepopulationofSPF(Specifiepathogenfree)primaryparent(G0)importedfromAmericaintheyear2008secondfilialgenerations(G1andG2)，whichwereimportedin2006．Themainresultsareasfollows：andthepopulationsoffirstandbredfromSPFprimaryparent(1)Fiverestrictionenzymes似luI，TaqI，硒oI，SpeI，SspI)wereusedinthePCR．RFLPanalysisofthemtDNAcontrolregion．Thenumberofhaplotypeisbetweentwoandfour，whilenorestrictionsiteweredetectedinsomesampleswhendisposedwithAfuI．SpeIorTaqI．Therewere3．7and9compositehaplotypeswithinthethreepopulationsrespectively．Nocompositehaplotypesharedbythreepopulationswasdetected，buttherewasonecompositehaplotypesharedbyeithertwopopulationsoutofthethree，whichdemonstratedthattherewassignificantdifferenceamongthethreepopulations．Increasing兀valueandhaplotypediversityindicatedhighergeneticdiversitiesofculturedstocksthanimportedpopulation．AndtherewasacloserrelationbetweenGOandG1comparingwitllthatbetweenGOandG2．whichwasindicatedbydendrogramanalysis．(2)EightpairsofpolymorphicmicrosatelliteprimerswereselectedfromthirteenpairsofprimerstoassessgeneticdiversityofthethreepopulationsofLitopenaeusvannamei．Atotalof64alleleswerefoundwith5tO13allelesperlOCUSacrossthethreepopulationsoveralleightloci．PIC(PolymorphicInformationContent)oftheeightlOCirangedfrom0．4052～O．8693withsixIOCibeinghighpolymorphic．whichwereusefulforevaluatinggeneticvariability．Therewerethirtylostandnovelallelesaccounting47％ofalltheallelesovertheeightloci．TheaverageValueofobversedheterozygosityofG0．Gl。G2was0．1938，0．1961，0．2325respectively,whichsuggestedthatthegeneticdiversitywaslowercomparedwithreporteddataatpresent．ThecomparisonsofallelesfrequenciesovertheeightlOCiamongthreepopulationsshowedthatthereweresignificantdifferencewhichdidn’tentirelyaccordedwiththeresultsofpairwisecomparisonsofaverageheterozygosity．Furthermore，inbreedingwereobservedwiminthethreepopulationsbythemethodofFisvalues．HighsignificantdeviationsfromHWEfHardv—Weinbergequilibrium)foralltestsateachlOCUSwithineachpopulationweredetectedowingtohomozygousdeficiency．PairwiseFstvaluesandNei’Sgeneticdistanceshowedobviousgeneticdifferentiationamongpopulations．Allelesfrequenciesofmalesandfemalesdifferedsignificantly,whichmayindicatedthatthereWasaIII 上海海洋大学硕士学位论文differentselectionpressure．Therefore，fromtheseresults，itwaspresumedthatinbreedingcountributedmuchtotheexhibitionofgeneticalcharacterizationdeclineofthebredoffspringprawnsandthegeneticvarianceWasprobablyderivedfromhighselectionpressure．aswellasmutationandrandomdrift．Thenwerecommendedthatcombinedgeneticbreedingmethodsshouldbeadopt，suchasestablishingseparatebreedinglinesforcrossbreedingtoacquireahighefficiency．Keywords：Litopenaeusvannamei，breeding，PCR—RFLP,microsatellite，inbreedinggeneticvariationIV 上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：粕扬叩年，月阳日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采片j影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于学位论文作者签名醐：1年保密口，在年解密后适用本版权书。不保密口：如叼W日册撕虢确长指导教师签名：一7认√I⋯＼吼竹莎月加日 上海海洋大学硕士学位论文1．1水产生物遗传育种第一章引言掘农业部统计，2006年我国水产品总产量达到5290万吨，其中养殖业占水产品总量的68％，是世界上唯一养殖产量超过捕捞产量的渔业大国。然而与国外相比，我国的现代养殖业起步较晚，存在诸如养殖区域缺乏合理规划，滥用药物，养殖品系混乱等问题，严重影响了产业的健康发展。拥有优良的种质资源是养殖业可持续发展的前提，因此水产生物遗传育种显得格外重要。近年来，我国在水产生物遗传育种方面取得了许多成果，如开发出了“黄海1号”中国对虾，“新吉富”罗非鱼等新品种，产生了很大的经济和社会效益。同时应当明确，良种繁育需要一个长期的过程，如果采用的育种方法不适当，就无法得到性状优良的品种，或者使得育种的工作量和周期大大增加，因此有必要对育种项目采用严格的监测手段如分子标记技术以快速准确地做出评估，及时采取相应的补救措施。1．1．1遗传育种技术和应用“十一五”国家科技支撑计划项目“农林动植物育种工程”的实施为动植物育种技术的新突破、育种效率和定向育种水平的不断提高提供了契机。目前我国水产生物育种的应用水平和陆生家养经济动植物相比显得落后，目前水产生物育种的方法主要包括选择育种，杂交育种，诱变育种，多倍体育种，细胞核移植技术，细胞融合，基因工程等。选择育种和杂交育种是水产生物育种的传统方法，与其他方法相比，具有技术难度低、实验条件要求不高等优点，但人力物力耗费大，选育周期长。从长远的角度来看，随着我国生物学技术水平的提高和动植物经济作物遗传图谱的构建，细胞融合，转基因等高新技术必将成为遗传育种的主力。1．1．1．1选择育种选择育种又称系统育种，是根据所需要的表型，通过比较筛选，使控制优良性状的基因在生物体内富集达到纯和的育种方法。选择育种一般包括家系选择、亲本选择、混合选择和综合选择等方法。由于选择育种易于掌握，广泛应用于鱼、虾、蟹、贝等水产动物育种。目前， 上海海洋大学硕士学位论文国外选育出了鳟鱼、鲑鱼、罗非鱼类等新品种，对于凡纳滨对虾，美国农业部海洋研究所的选育比较系统，建立了两个独立的选择品系，一个为100％生长率选择，一个为30％生长率、70％抗病选择的品系，拥有无特定病原(Specificpathogenfree，SPF)ffH抗特定病原(Specificpathogenresistant，SPR)两个品系。在我国，经过科技工作者的努力，水产生物育种方面已经取得了一些成果，如“黄海一号”中国对虾，“夏奥1号”奥利亚罗非鱼，“新吉富"罗非鱼等，其中“黄海一号”中国对虾的选育，是我国第一个人工选育成功的海水养殖动物新品种。1．1．1．2杂交育种杂交育种一般是指不同品系、品种间的杂交和远缘杂交。近年来在遗传育种中崭露头角的雌核发育，细胞杂交和转基因技术都属于杂交育种的范畴，这些新技术使实际操作从个体水平提高到了细胞、染色体和基因水平，大大提高了育种的效率，缩短了育种周期。杂交育种的一个典型例子就是杂交水稻【11，水产生物方面，目前经过我国国家良种审定委员会审定的有荷元鲤、丰鲤等，而在对虾育种中，主要是家系问的杂交，由于凡纳滨对虾过分依赖于从国外引种，基因库资源有限，而传统的育种方法需要大量的样本，因此育种效率较低，最好的解决办法是利用转基因技术开发转基因对虾，但这有待于与经济性状相关的目的基因的获得和外源基因整合效率的提高，目前发现的有利用前景的基因有对虾中的类脊椎动物生长因子【21，蜕皮抑制激素基因【3】等，其中研究和发现最多是免疫基因【4，51，在国内，DengPan[6】等在寻找白斑综合症病毒(wssv)抗性相关免疫因子时在对虾肝胰腺中新得到了8个分化表达基因，同时第一次发现了在对虾免疫应答的信号转导中有小GTPases的参与。目前，转基因技术在对虾选育中的应用还没有实现重大突破，但是相信随着对虾细胞生物学和分子遗传学研究的继续深入，高产优质的转基因对虾必将推向市场。1．1．1．3诱变育种诱变育种通常使用如紫外线、X射线等辐射线和烷化剂、碱基类似物等化学试剂，可以使基因突变率提高100---，1000倍。因为大多数诱变是隐性有害突变，对高等动植物体来说，经过长期进化形成的复杂的基因调控机制会因为诱变而变得异常，从而导致较高畸形率和很低成活率。诱发突变的另外一个缺点是具有较大的不确定性和盲目性，只有原始材料的样本量足够大才有可能筛选到有益的突变类型。因此，目前的研究还处于实验阶段，诱变育种的对象多为微生物，值得一提的是我国开展的空间诱变育种，从1987年至今，已经育成的优良新品种、新品系有60多个【71。在水产生物领域，国外在六十年代就已开始进行研究，对象主要为2 上海海洋大学硕士学位论文鲤、鲢、鳙、鲑等种。目前对海胆，斑马鱼，草虾的研究结果表明短波紫外线的诱变效果是复杂的【81，诱变效果在物种间存在差异。古绍彬等对离子束技术在诱变育种中的使用做出了尝试，发现离子束诱变的存活曲线和X射线等不同[91。近些年我国在诱变育种方面研究的比较少，仅有关于海洋微藻和坛子菜【lo】的报道。鉴于诱变育种的研究现状，今后应该加强在提高诱变效率，诱变育种和其他育种方法相结合，以及诱变理论等方面的研究。1．1．1．4雌核发育’目d仃雌核发育技术的研究重点是雌核发育的人工诱导，国际上在鲤科、鲑科、鲽科、鳅科和鲷科等重要经济鱼类中开展了人工雌核发育的研究，并取得了成功。国内雌核发育技术的应用主要集中鱼类和贝类，如早期的银鲫【ll】和近年的草鱼Il引，鲆鲽类【13,14】，栉孔扇贝【15】，而异育银鲫的养殖推广已经产生了可观的经济效益。另外单倍体，多倍体育种较多的应用在鱼类，贝类的研究上，例如牡蛎，湘云鲫等，目前还没有关于对虾在这方面的报道。1．2凡纳滨对虾养殖的历史和现状1．2．1J、L纳滨对虾简介凡纳滨对虾(LitopenaeusvannameO，属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、软甲亚纲(Malacostraca)，十足目(Decapoda)，对虾科(Penaeidae)，原产于南美洲，广泛分布于太平洋沿岸，因此又称太平洋白虾(Pacificwhiteshrimp)。凡纳滨对虾是西半球最重要的对虾养殖品种，养殖多集中在海湾和河流入海口丰富的地区，例如厄瓜多尔和巴拿马。因为凡纳滨对虾所具有的一系列优良经济性状，如耐高温，抗病力强，出肉率高，营养丰富，生长速度快，盐度适应范围广(0—40％0)[16l，使得凡纳滨对虾成为对虾养殖的重要对象。1．2．2我国凡纳滨对虾养殖业的历史和现状上世纪80年代，我国的对虾养殖业处于鼎盛时期，然而从1993年起，对虾病毒病暴发，养殖业遭受了巨大的损失。直到1997年，斑节对虾(Penaeusmonodon)的养歹卣推广成功，对虾养殖业才逐渐恢复；1999年后，凡纳滨对虾取代斑节对虾成为对虾养殖的主导品种，掀起了第二轮产业增长高潮，经过几年的高速发展，凡纳滨对虾养殖逐渐进入产业调整期。凡纳滨对虾最早于1988年7月由中国科学院海洋研究所从美国夏威夷引进我国，至今已经实现了对虾的淡化养殖，在人工控制下由原来的年产卵一至二次提高到多次产卵。目前国内凡纳滨对虾苗种场的亲虾来源十分复杂，主要来自美国3 上海海洋大学硕士学位论文夏威夷，中国台湾和海南地区。来自夏威夷海洋研究所的亲虾是选育的SPF凡纳滨对虾生产的第一代亲虾，来自台湾地区的亲虾是经过大量养殖和选育的后代，可zfjq匕c．,属于第2"-'-'5代，来白海南、广东、福建的亲虾多数为第二代。1．2．3凡纳滨对虾养殖过程中存在的主要问题目前影响凡纳滨对虾养殖发展的主要问题是水质污染，病毒疾病和种质退化。而种质退化直接影响了养殖业的健康发展，购入的成虾在繁殖数代后子代出现个体变小，产量下降，病死率高的状况。1．2．3．1水质恶化随着养殖规模的迅速扩大，养殖生态环境也在不断恶化，而水质的好坏直接影响到刈‘虾的生长和成活率，死亡率较高的水体往往表现为PH值、溶解氧等指标显著下降，而氨氮含量，亚硝酸盐，有机污染物等超标，同时对虾的高密度养殖，超负荷放养又加剧了这种危害。1．2．3．2对虾病害虽然SPF对虾经过了严格的检验检疫，具有较高的抗病能力，但这并不意味着SPF对虾中不会感染己知的对虾病原体旧。多年来，由于在引种过程中的不规范操作，交叉感染现象比较严重，凡纳滨对虾的多种病毒病原留于保留的亲本，养殖环境和水域内的生物中，现有的证据表明在这种条件下养殖，很容易发生对虾病害【l引。目前还没有找到有效的抗病毒药物，因此控制凡纳滨对虾病毒疾病以预防为主。1．2．3．3种质退化虾苗质量的好坏直接影响对虾养殖的成败，而虾苗的质量与亲虾来源有直接的关系。目前亲虾种质退化的问题还没有根本解决，我国是用进口的亲虾繁殖的子代做为种苗，然后各个育苗场再用种苗作为亲虾生产虾苗销售，但是许多小型育种场为了降低成本而使用养殖的商品虾作亲虾，这就导致对虾的家系混乱，根本无法追溯亲虾的系谱，不可避免地发生近亲交配，随着世代的增加，出现后代优良经济性状逐渐退化。因此对虾养殖往往陷入引进，衰退，再引进补充，再衰退的恶性循环。采用遗传育种技术对引进的亲虾进行选育，培育出种质优良的虾苗是解决当前问题的根本办法。为此，2003年12月起，国家农业部批准海南省热带海水水产良种繁育中心建设凡纳滨对虾引种育种中心。至今，育种中心选育出的凡纳滨对虾SPF亲虾子一代、子二代苗种，各项性状指标均达到了较高的水平，该选育技术已被拟定为国家行业标准。在我国北方，2009年4月，天津市水产局承担的“凡纳滨对虾产业升级集成技术示范与推广”项目也取得了圆满的成功，该项目的重要4 上海海洋大学硕士学位论文成果之一是首次在温寒带地区规模化引进凡纳滨对虾亲虾，并繁育成功，这标志着该项目的科技含量己达国际先进水平。1．2．4凡纳滨对虾育种和经济性状差异J、乙纳滨对虾的经济性状分为质量性状和数量性状两种，质量性状如对虾个体的颜色等，质量性状一般由一个或几个基因对控制。质量性状较稳定，不易受环境条件的影响。数量性状是多基因联合效应的表现，大多数重要的经济性状是数量性状，如对虾的生长率，体长，体重等。童馨等Il9】对7个群体4个世代的1150个样本的体长和体重进行了统计，结果显示体长和体重的变异系数随着世代的更替呈增加的趋势，并测得其中体重的变异系数每繁殖一代增加10％，其子一代的变异系数与进口的亲虾群体相同，这些数据说明了生长性状逐代分化。成活率和生长速度是选育过程中的最经常使用的两个性状指标，国内外在这方面丌展的研究较多，Argue[20】在对定向选育的两组对虾进行比较后指出家系平均增长率和家系抗桃拉综合症病毒(Taurasyndromevirus，TSV)的存活率呈负相关，姚雪梅的研究也得到了相似的结论【211，姚雪梅的研究结果显示F2代的成活率和适应力均高于F1代，但生长速度不如F1代。同时姚雪梅等122J通过对引进的SPF亲虾和海南当地多代选育群体的自交、杂交系的对比，发现杂交一代的遗传力偏向母本，并得到了杂交系优势群体和近交系分化群体。由于雌雄两性在染色体上的差异，一些性连锁基因决定的性状表现为伴性遗传，李卓佳等【23】得到的数据说明凡纳滨对虾的肥满度和性别的关系与长毛对虾、罗氏沼虾中的情况不同，而大泽一爽原曾报道某些淡水虾类存在伴性遗传的特点。因此现有的数据还无法说明凡纳滨对虾中是否存在伴性遗传。我们不能忽视环境因素对儿纳滨对虾群体在主要经济性状上的贡献，但是我们知道环境所引起的变异程度是有限的，仅由环境引起的差异而遗传物质未发生变异，这样的差异是不可遗传的，而群体遗传结构发生的变化可能直接影响凡纳滨对虾的经济性状。1．3分子标记技术在凡纳滨对虾中的研究现状在出现DNA分子标记技术以前，常用的三种遗传标记，即形态标记，细胞学标记，生化标记都是在表型或染色体形态的层次上研究材料的遗传特性，然而形态性状和生化性质易受环境和发育状况的影响，细胞学标记虽然克服了易受环5 上海海洋大学硕士学位论文境影响的缺点，但在获取一些对染色体变异耐受性较差的材料时显得力不从心，正因为如此，这三种标记的应用受到了一定的制约。而分子标记能够从小至核苷酸的水平上对遗传信息做出分析，和以往的标记相比能够获得更大量的遗传信息，能够更加直接地揭示遗传变异的本质。1．3．1分子标记技术简介经过几十年的发展，分子标记技术已经相当成熟，自从限制性片段长度多态性(RFLP)技术为代表的第一代遗传标记开发以来，广泛使用的还有随机扩增DNA多态性(RAPD)，可变数量的串联重复(VNTR)，扩增片段长度多态性(AFLP)，简单串联重复序歹U(SSR)，单核苷酸多态性(SNP)。通常我们希望分子标记有以下几个特征时才适合使用：即多态性高，重复性好，均匀分布于整个基因组，选择中性，检测方便、快捷等。但是，几乎没有一种标记能够同时满足这些要求。比如RAPD操造作简单灵敏，安全快速，成本低，但是RAPD为显性标记，不能有效地鉴定杂合子，结果分析中的序列同源假设可能会高估不同样本间的亲缘关系【24。，此外RAPD稳定性差。AFLP技术具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，广泛应用于构建遗传连锁图谱，AFLP是RAPD和RFLP相结合的产物，它克服了RFLP技术复杂、有放射性污染和RAPD稳定性差的缺点。RFLP标记结果稳定可靠，重复性好，可以有效区分纯合子和杂合子，进行系统进化和亲缘关系的分析，对于物种间亲缘关系的研究特别有用，但RFLP技术对DNA纯度要求较高，而分子量大的基因组DNA在前期操作过程中很容易断裂为小片段，由于不同的识别位点的进化速率不同【251，所选择的限制性内切酶的种类和数量会影响RFLP得到的结果。PCR．RFLP是PCR和RFLP相结合的产物，通常选取基因组中进化速率快的序列进行扩增，扩增片段经酶切产生多态性，摆脱了RFLP中探针制各和杂交中放射性污染的问题。微卫星标。记(Microsatellitemarker)，又称为简单重复序YO(SSR)，是继RFLP之后的第二代分子标记，其多念性来自于重复单位的重复次数的高度变异性。微卫星DNA的重复在基因组的进化中起着非常重要的作用【26。，带有大量的遗传信息【27】。微卫星DNA适用于任何真核生物的系统进化研究，广泛应用于物种进化和系统发型281，生物种群内遗传变异【291，遗传杂交育种，亲子鉴定，遗传图谱绘制等领域。微卫星标记的分析通常是通过构建基因文库开发微卫星引物或从GenBank等核苷酸数据库下载基因组序列查找微卫星位点然后设计引物进行PCR扩增，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳检测。单核苷酸多态性(SNP)是最新一代的分子标记，它是指基因组DNA中由单个核苷酸的转换或颠换产生的多态性。SNP在基因组中广泛分布，大多数位于基因6 上海海洋大学硕士学位论文组的非编码区，在人类中，SNP的频率约占l％甚至更高【3Ⅲ。SNP的检测需要进行高通量分析，一般使用基因芯片，因此成本较高。目前SNP的研究主要集中在生物医学，人类基因组学，法医学等领域，随着检测SNP技术的发展，相信SNP标记将在医学分子生物学、群体遗传学、动植物育种和生物进化研究等方面发挥巨大的作用。1．3．2分子标记技术在凡纳滨对虾及近缘物种中的研究和应用J,W．,Fji宾x,t虾的养殖自上世纪90年代发展至今已经成为我国对虾养殖中的主力，2007年凡纳滨对虾养殖产量占对虾养殖总产量的80％。然而由于养殖规模的迅速扩大，引进亲虾的规模有限，国内的苗种场的亲虾来源复杂，一些育苗场为追求经济利益，对亲虾的来源不加选择或从养殖的凡纳滨对虾中挑取部分作为亲虾培育，用自己培育的亲虾进行育苗生产，而且常常高密度育苗，造成凡纳滨对虾多年繁育后近亲交配现象严重，抗病能力下降，体形差异明显。为了使凡纳滨对虾的种质复壮，我国前后多次从夏威夷引种。引进优良的种虾是选育出性状优良稳定的虾苗的前提，因此应当建立引种和育种的标准，在合理引进亲虾的基础上实施选育计划，同时加强对凡纳滨对虾引进亲虾及子代的种质资源监测。除了在形态学，免疫学方面做出分析判断外，运用分子生物学方法对凡纳滨对虾群体遗传结构开展研究能够为凡纳滨对虾的资源保护，良种选育提供有价值的参考。1．3．2．1群体遗传结构通过分析群体遗传结构我们可以推测种群的生长、繁殖和适合度等状况。野生群体的遗传结构变化能给我们提供生态环境变化、人类活动对环境的影响等方面的讯息；对于养殖对虾，根据遗传结构的变化我们可以提出相应的改进措施。许多研究显示儿纳滨对虾的养殖群体的遗传结构和野生群体有所不同，而不同地理种群之间往往由于地理隔离，水文差异等因素而导致种群分化。颉晓勇等【3l】利用AFLP标记发现凡纳滨对虾6个养殖群体的遗传多样性水平低于引进群体，6群体间的固定指数Fst在0．07693—0．29164之间，显示6个养殖群体fUJ达到中等程度的遗传分化，其中广益群体的Shannon多样性指数和平均基因多样性在6个群体中最低，推测广益群体出现了近交衰退。这为不同地方种群间开展杂交育种提供了参考。另外，李锋等【32】用16个RAPD引物对两批引自夏威夷的SPF儿纳滨对虾亲虾的分析得到两者之间的遗传距离为0．3455±0．0795，指出SPF亲虾也是经过选育的子虾，并推测在选育的过程中，后代发生了遗传漂变，部分优良性状可能丢失，建议不再使用遗传多样性下降的亲虾。由此提示应当对引进的亲虫FDI：I强管理和检测。7 上海海洋大学硕士学位论文Benziel33】在使用同功酶，RAPD标记和微卫星三种标记分析26种对虾时获得的遗传信息显示许多种类的对虾之间即使相距很远(几千公里)也没有遗传变异，但是在相对小的距离(几百公里)有较多的基因或基因型的漂变，同时指出大多数遗传结构反应了生物地理分布规模的历史变迁，而不是符合扩散模型，养殖群体的遗传变异通常比野生群体小。Maggioni[34】对巴西水域白滨对虾的6个微卫星座位分析时得到的期望杂合度He为O．8630，说明8个地点有很高的多样性，根据地理种群间的固定指数Fst值的比较指出在寒冷角(CaboFrio)附近存在显著的生物地理分布的中断，并分析了产生这种中断的原因。1．3．2．2分子系统学早期的研究大都集中在分子系统学方面，一般是通过线粒体DNA上进化速度较快的基因进行分析。如上世纪90年代，Palumbi[35】通过分析12SrRNA基因和细胞色素氧化酶I基因鉴别了凡纳滨对虾和细角滨对虾(Penaeusslylirostris)。Baldwin等【36j用PCR．RFLP方法分析了13种对虾的COI基因部分序列，讨论了它们的系统进化关系。在国内，郑连明等吲对凡纳滨对虾线粒体DNA细胞色素氧化酶I基因进行了分析。然而随着研究的深入，线粒体DNA中也发现了一些和以往的认识不一致的情形【3引，因此，应当考察更多的基因，如核基因，微卫星序列等，在更多数据的基础上建立起更准确的系统树。1．3．2．3遗传图谱构建和分子标记辅助育种大多数重要的经济性状是数量性状，而环境影响控制数量性状基因的表达，传统育种方法周期长，主要是由数量性状造成的。分子标记辅助育种通过对分子标记的选择I’日J接实现数量性状位点(QTL)的选择，而高饱和度的遗传连锁图是辅助选育得以开展的前提。迄今为止，在水产养殖品种如大西洋鲑鱼，沟渠鳅，虹鳟鱼中已构建了比较完善的遗传连锁图。对于凡纳滨对虾，Perezl391和LiusuoZhang[401都构建了凡纳滨对虾的雌雄两性遗传连锁图，Perez采用AFLP和拟测交理论的方法，而LiusuoZhang采用AFLP和微卫星标记相结合的方法，Perez得到的雄雌图谱的分别有51和47个连锁群，雌性的遗传图谱比雄性雄长24％，图距分别为2771cM和2116cM，LiusuoZhang得到的319个多态位点在雌虾的图谱中分成45个连锁群，覆盖了4134．4cM，267个多态位点在雄虾图谱中分为45个连锁群，覆盖了3220．9cM，他们的工作都为构建高分辨率的遗传图谱，查找数量性状位点和辅助育种奠定了很好的基础。同为我国对虾养殖的重要对象的中国对虾和中国明对虾的遗传连锁图谱也已8 上海海洋大学硕士学位论文经初步建立，岳志芹纠4I】利用AFLP分子标记结合“拟测交”理论构建的中国对虾的雌雄两性连锁图的标记间平均距离分别为10．7cM和12．8cM，分别覆盖了基因组的35．6％和47．5％。王伟继等【42】利用同样的方法构建了中国明对虾雌雄两性的遗传连锁图，并利用F2自交模型构建了共同的AFLP分子标记连锁图谱，分辨率为分别为2．4cM、2．4cM和2．1cM，图谱覆盖率分别达到50．21％、51．93％和48．08％，能够基本满足进行QTL位点定位的需要。李晓静等【43】构建了中国明对虾雌雄两性的RAPD分子标记的遗传连锁图谱的覆盖率比岳志芹和王伟继的都要高，分别为55，57％和55．97％。目前的工作方向应是进一步提高分子标记的使用数量和种类，将这几种分子标记建立的连锁图进行整合，然后进行QTL的定位。张留所等【44】在研究两个选育凡纳滨对虾全同胞家系时考察了10个凡纳滨对虾微卫星座位，鉴定了遗传改良家系的亲子关系，并为其用于连锁图谱构建，种群遗传分析奠定了基础。陈晓汉等【45】找到一个和凡纳滨对虾的体重显著相关的微卫星位点(TUMXLv6．124)，并做出了用微卫星标记对凡纳滨对虾进行分子标记辅助选育的初步研究。姒pJJ,蚀1：¨14t等【461创造性地进行了凡纳滨对虾的家系选育和个体选育，并首次将对虾的畸形率作为选育的一个指标，建立了对虾的家系选育体系，为对虾的良种选育提供了很好的技术平台。一个基本的染色体连锁框架图要求在染色体上的标记平均间隔不大于20cM；要进行主基因的定位，其平均间隔要求在10"--20cM或更小；用于QTL定位的连锁图，其标记的平均间隔要在10cM以下。而利用拟测交理论结合不需要预先知道DNA序列的分子标记方法，如间隔序列多态性(ISSR)，扩增片段长度多态性(AFLP)，随机扩增多态性(RAPD)可以加快连锁图的构建。而要将所构建的雌雄两性连锁图整合起来，还需要使用共显性标记如单核苷酸(SNP)，微卫星(SSR)或表达序列标签(EST)。目前发现的标记没有一种在基因组中的分布是完全随机的，因此要得到高饱和度的连锁图，有必要使用特性互补的分子标记。1．4本论文的研究目的和意义凡纳滨对虾是对虾养殖的优良品种，然而由于我国对虾种质资源匮乏，随着养殖世代的增加，凡纳滨对虾的经济性状越来越差，我国早期从美国夏威夷引进的亲虾个体大，规格整齐，而国内在引进亲虾后利用选育的子一代作为亲虾，养9 上海海洋大学硕士学位论文育几个世代后子代和亲本相比有很大差异，如个体变小，抗病力下降，目前对不同世代群体的育种学遗传参数的评估显示对虾种质发生退化，另一方面国内利用分子标记手段对儿纳滨对虾种质进行分析的研究还比较少，国外的报道也大都来自于亲虾的引进地一美国，而我们不能保证我国引进的亲虾和美国当地亲虾在种质上的一致，因此为了准确分析我国凡纳滨对虾的种质现状，有必要对引进亲虾及繁殖的子代进行遗传变异分析。分子标记手段能够从基因水平上对遗传变异作出本质解释，PCR．RFLP是早期最常采用的标记方法，而微卫星分子标记在遗传图谱构建，亲子鉴定，遗传结构分析，辅助育种等领域也显示出了巨大的能量。有鉴于此，本文拟通过PCR．RFLP和微卫星标记两种方法对凡纳滨对虾引进亲本和国内繁殖的子代群体的遗传结构做进一步的研究，一方面能够为凡纳滨对虾的种资源提供背景资料，另一方面可以指导凡纳滨对虾的系统选育，同时为构建高饱和度的J、L纳滨对虾遗传连锁图谱提供有价值的参考。10 上海海洋大学硕士学位论文第二章凡纳滨对虾引进群体和养殖群体的PCR．RFLP分析2．1材料和方法2．1．1材料由上海市水产技术推广站提供的2008年引进的凡纳滨对虾SPF亲虾GO群体10尾，2006年引进SPF亲虾繁殖的第一代G1群体16尾及繁殖的第二代G2群体20尾，共计46尾。2．1．2方法2．1．2．1基因组DNA的提取参照《精编分子生物学实验指南》[471和逢洪波【481采用CTAB法。具体步骤如下：(1)取凡纳滨对虾尾部肌肉约100mg，用滤纸吸取多余水分，用灭菌剪刀剪碎放入Eppendorf管，加6009L消化缓冲液(100mmol／LTris-Hcl，20mmol／LEDTA1．4mol／LNaCI，2％CTAB)，加6¨L蛋白酶K(20mg／mL)至终浓度2009L／mL，加B一巯基乙醇至终浓度2％，65℃水浴条件下消化2个小时至溶液澄清，消化其间每隔20分钟取出轻柔混匀3分钟。(2)取出Eppendorf管冷却至室温，加等体积Tris饱和酚／氯仿(1：1，V：V)轻轻混匀5分钟，12000r／min离心15分钟后转移上清液至新Eppendorf管。(3)若第(2)步骤离心完后溶液中间层有白色沉淀，则重复第(2)步骤一次，转移上清液至新Eppendorf管，若无白色沉淀，则进行第(4)步操作。(4)}JII等体积的苯酚／氯仿／异戊醇(25：24：l，V：V：V)轻轻上下颠倒混匀5分钟，12000r／min离心15分钟后转移上清液至新Eppendorf管(5)加等体积氯仿，轻轻混匀5分钟，12000r／min离心15分钟后转移上清液至新Eppendorf管，此步骤可重复进行一次以尽可能出去溶液中的酚。(6)加2．5倍体积的冰乙醇，轻轻混匀5分钟，一20"C放置30分钟。(7)4。C、12000ffmin条件下离心15分钟，弃上清液，得到DNA沉淀。(8)加800t．tL70％冰乙醇漂洗DNA沉淀，8000r／min离心40秒后弃上清液。(9)重复(8)步骤一次，室温下晾干DNA沉淀。(10)JJH1009L灭菌去离子水，4"C条件下溶解1个小时。(11)DNA溶液用EppendorfBiophotometer测定纯度和浓度，根据浓度取一定体积DNA溶液加灭菌去离子水定量至80n∥“L，一20"C保存待用。同时取59LDNA终11 上海海洋大学硕士学位论文溶液用1％琼脂糖凝胶电泳检测。2．1．2．2线粒体DNA控制区序列的扩增及纯化扩增引物参照Jimenez[491[5’．AAGAACCAGCTAGGATAAAAClvrT-3’]和【5’．GCTTAcATGTTcTACCCTATCAAG一3’】，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR试剂均购自Takara生物公司，反应采用259L体系，反应成分为：1XBuffer(M92+free)，2retool／LMgCl2，正反向引物10pM／止，DNA模板80ng，Taq聚合酶1U，0．2mmol／LdNTP。扩增程序如下：94℃预变性4min；94*(2变性50s，49"(2退火50s，72℃延伸50s，进行33个循环，最后在72℃下充分延伸8min，产物4℃保存。反应在EppendorfMastercycler⑩epPCR扩增仪上进行。取59L扩增产物经1％琼脂糖进行电泳检测，使用Takara公司的胶回收试剂盒进行回收、纯化，每个群体选一个PCR产物送北京六合华大基因生物有限公司测序。2．1．2．3PCR纯化产物酶切两个序列提交Genbank(登录号GQ251342，GQ251343)，用VectorNTIadvance9软件分析酶切位点，选择在三个序列中均有酶切位点的5种限制性内切酶(购自Takara公司)对纯化后的扩增产物进行单酶切，包括识别4个碱基序列的(AluL购I，MboI)$D识别6个碱基序列的(SpeLSspi)。反应条件如下：29LPCR纯化产物，29LBuffer缓冲液(Takara公司提供)，限制性内切酶2U，灭菌去离子水补足至终体积209L，在37℃(对于AluI，SpeI，Sspi，Mb01)或65℃(对于TaqI)水浴条件下充分反应2小时。酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下拍照记录。2．1．2．4数据处理电泳图谱使用QuantityOne软件分析条带的片段大小。根据每种限制性内切酶所得到的限制类型以英文字母顺序命名单倍型，每个样本由五种酶切单倍型组合成复合单倍型。计算以下参数：单倍型间的片段共享度F；第k类酶产生的单倍型间的遗传距离Pk；复合单倍型间的遗传距离P参考(2．2)式，此处P=d；单个群体内核苷酸多样性指数71；A：A、B两群体间的平均核苷酸多样性指数71：AB；任意两群体问的净遗传距离Pnet；单个群体的复合单倍型多样度ht501，并根据群体间Pnet用MEGA4．0采用NJ法构建进化树。其中nxv为X，Y单倍型间共有片段数，nx、ny分别为X单倍型，Y单倍型的片段总数，b为限制性酶识别的序列的碱基数，即b--r，本实验中包括r=4(AluI，MboI，TaqI)和r=6(SpeI，Sspi)两种类型的内切酶；Ai、Aj分别是第i和第J种复合单倍型在A群体中的比例，Pij是i和J两复合单倍型问的遗传距离，公式(2．7)中L为群体A中的复合单倍型的种类数，各参数计算公式如下：(1)F=2n：，／b，+疗，)‘511(2．1)12 上悔海洋大学硬士学位论文(2)州一{【(F：+8Fy"-F¨q51㈩。靶Ⅵ㈤‘3功2蕙万”1(4)口^=∑A，Aj‰。11(5)F．。=EA．B．P．．⋯(6)‰=口M一也+％)／2””(7)^=咖一1l1一∑A，2I⋯22结果22lPCR产物和PCR-RFLP酶切46个样本的PCR扩增产物片段长度相同，约为1lkb，扩增产物的电泳结果见图2-1中的(a)～(d】。五种内切酶在三个群体中均显示为多态，其中三个群体经MbM酶切得到的结果见图2-l中(e)～(曲。Alul，匈”I，z1凹I在个别样本中没有酶切位点，如(h)为G0经AluI酶切后的结果，豫样本1号和6号外，其余样本都没有酶切位点：(i)是Gl经SpeI酶切的结果，3号和8号没有酶切位点。址"¨拍撕" 上海海洋大学硕士学位论文(h)10987654321MBA2klk嚣跚250bp100bpCAD图2-1线粒体DNA控制区PCR扩增产物电泳图和部分酶切的电泳囤Figure2-1Agarosegeleleetmphoretic蚰alysisofPCRproductsofmtDNAcontmlregionandelectrophoreticpaaemsofsomereslrietionendonueleases注：(曲、(b)分剧为GO，G1的扩增结果，(c)和(d)为G2的扩增结果：(e)、∞、(曲分别为GO，GI，G2扩增产物经Mbo!酶切后的结果，A，B为MboI酶切产生的单倍型(h伪G0经Alul14 上海海洋大学硕士学位论文酶切的结果，A、B为两种单倍型．(i)为G1经SpeI酶切后的结果，A、C、D为三种单倍型．Notes：(a)and(b)referstothePCRproductsofGOandG1，respectively；(c)and(d)referstoPCRproductsofG2；(e)、(f)and(g)referstorestrictionfragmentpatternsofGO，OlandG2whendisposedwithMbol，respectively，AandBalethetwohaplotypes．(h)referstotherestrictionfragmentpatternsofG0whendisposedwithspel，respectively，A、CandDalethethreehaplotypes．单倍型和酶切后产物DNA片段见表2．1。5种限制性酶酶切得到的单倍型类型在2～4个之间，AluI和印PI的多态性较高。表2．1酶切片段和单倍型Table2—1．ObtainedfragmentsandHaplotypes2．2．2群体问遗传结构的差异复合单倍型的分布见表2．2，三个群体的复合单倍型类型分别为3个，7个和9个，共16个类型，没有为三个群体所共有的复合单倍型，而GO和G1，GO和G2，G1和G2之间分别有1个共享复合单倍型。5个复合单倍型为G1特有，7个为G2特有。G0中的优势复合单倍型为CompositeHap2(60％)，G1中优势复合单倍型为CompositeHap2(25％)和CompositeHapl4(31％)，G2中为CompositeHap8(35％)矛llCompositeHapl2(20％)。三个群体内复合单倍型的分布的比较显示三个群体间差异显著(见表2．3)。15 上海海洋大学硕士学位论文由表2·4可知，三个群体的核苷酸多样性指数71；在0．0333～O．1349之间，且G2>GI>G0。计算复合单倍型多样度h显示G1和G2差别不大，但均大于G0。群体问的核苷酸多样性指数兀AB在0．2559"'0．3599之间，大于每个群体的71；值范围(0．0333"一0．1349)，Pnet的值显示GO和G2之间的净遗传距离最大。表2-2三个群体的复合单倍型的分布Table2—2Haplotypesofthethreepopulations复合单倍型复合单倍型频次CompositehaplotypeCompositehaplotypefrequencyGOGlG2TotalCompositeHap1AACBA2CompositeHap2ABCBA6410CompositeHap3BBAAA2CompositeHap4CompositeHap5CompositeHap6ComposileHap7CompositeHap8CompositeHap9CompositeHap10CompositeHap1CompositeHap12CompositeHap13CompositeHap14CompositeHap15CompositeHap16BBBAA2BBCAABBCBACACBACBAACCBABACBBAACBBBACBCBACBCBCCBDAACBDBADBAAB125l1_一16TbtaIlO204632l72l425l1l171l42 上海海洋大学硕士学位论文表2．3．复合单倍型分布的差异性比较Table2-3．Pairwisecomparisonofcompositehaplotype注：木显著性差异，奉牛极其显著性差异．Notes：‘significantdifference(PG2>G0，说明群体的遗传多态性GI>G2>G0，为了排除3个群体的取样量不同可能带来的误差，我们采用了贮检验对三个群体的单倍型分布进行差异比较，结果显示复合单倍型的分布差异明显。同时任何两个群体间仅有一个共享复合单倍型，说明对虾的遗传结构差异较大，这可能和G1，G2群体经过人工选择有关，推测是G1，G2群体在选育过程中存在不同家系的混合。由于我国使用的亲虾大部分依赖引进，成本较高，一些育种场可能会使用自有的家系和引进亲虾交配来进行选育，这会导致凡纳滨对虾种质混杂，出现对虾优良性状的丢失。颉晓勇等【3l】在研究6个凡纳滨对虾群体的遗传多样性时指出乾塘群体相对于三个地方群体的较高的遗传多样性水平是种质混杂的直接反映。造成GO和G1、G2群体的差异的另一种可能原因是GO群体和G1、G2群体的亲本具有较大的差异，李锋等【32】用16个RAPD引物对两批引自夏威夷的SPF凡纳滨对虾亲虾】8 上海海洋大学硕士学位论文的分析得到两者之间的遗传距离为0．3455±0．0795，指出不同批次的SPF亲虾也具有较大的差异。而本实验中缺少养殖群体Gl的引进亲本，所以这是本实验的一个缺点。另外，本实验中G1和G2群体的单倍型多样度的大小差别不大，但是这两个群体问的遗传距离达到了0．2097，大于GO和G1间的遗传距离，而许多研究表明随着养殖世代的增加，子代间的遗传变异呈减小的趋势，如李健等【6驯在研究中国对虾的子一代，子四代，子五代的遗传差异时观察到中国对虾野生群体和人工选育群体之间的遗传距离平均值远大于子四代和子五代间的遗传距离。由此推测本实验中由Gl到G2的养殖过程中引入了不同的家系，导致了种质混杂。种质的混杂类似于杂交，存在杂交优势的同时也有杂交劣势的可能，如姚雪梅等165J通过对引进的SPF亲虾和海南当地多代选育群体的自交、杂交系的对比，发现杂交一代的遗传力偏向母本，并得到了杂交系优势群体和近交系分化群体。同时，在不同杂交组合间和不同性状间的杂种优势存在差异，有的性状甚至表现出杂交劣势【66|。一般在对虾养殖中，如果养殖群体受到强的选择压而没有保持一定的遗传变异的话将会对对虾的长期选育构成严重的危害【671，当遗传变异降低时，可以引入不同的家系来保持较高的遗传变异水平，本实验中的两个子代群体保持了较高的遗传多样性，存在从中筛选到性状优良的对虾的可能，但是遗传变异的增大也可能导致个体|’HJ差异增大，增加育种的难度，或导致选育的失败，Chareontawee在研究罗氏沼虾时曾报道养殖的群体和野生群体相比有比与预期要高的遗传变异，指出引入非本地群体可能会对当地群体的遗传融合有相反的作用16引，这是造成低产的原因。因此在对虾的选育过程中应当严格控制亲虾的来源，避免种质的混杂，育种中应严格淘汰体弱多病的个体，尽量将携带有害突变和不良基因的个体排除。儿纳滨对虾足我国对虾养殖的重要品种，然而目前国内没有优良的品系，这已经成为对虾养殖业发展的瓶颈。本实验采用PCR．RFLP方法对进口群体和国内两个养殖群体进行了遗传差异的比较，但是提供的材料中缺少国内养殖群体的引进亲本，这是本实验的缺点，这也说明目前国内一些育种场的操作规范性较差，造成对虾亲本无据可查的情况比较多，这提示我们在选育的过程中应当做好对虾的家系档案管理，建立种质标准，使得选育的每一步都有一个确定的依据。19 上海海洋大学硕士学位论文第三章微卫星标记检测方法的选择微卫星DNA的检测方法主要有DNA指纹图谱法、聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳、毛细管电泳法、PCR．RFLP法、荧光标记全自动基因组扫描等【691。但考虑到对仪器设备的要求，一般实验室最常用的还是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种的分离范围如下表【70】所示：表3．1两种凝胶的有效分离范围Table3—1Tileeffectiveresolutionrangeofthetwokindsofgels聚丙烯酰胺凝胶有效分离范围厂bp琼脂糖凝胶浓有效分离范围／bp浓度／％度／％3．51000-'--2000标准琼脂糖低熔点琼脂糖5．080"-'5000．5700～25k8．060～4001．0250～12k400～8k12．040～2001．580"4k200--一4k15．025～1502．0l00--一3k3．0500---lk微卫星标记的重复序列大都在2,-一6bp，其多态性源自重复序列重复次数的变化，由于微卫星不同等位基因间有可能只差几个bp的碱基，如果凝胶的分辨率不好，可能会造成条带的误读，聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳相比具有较好的分别率，但也有采用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳【』71】的，这主要是考虑到琼脂糖凝胶制作，电泳，检测比较简便，能够节省大量的时间，而且成本也低。本实验中为了获得较好的分辨率，拟采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。在PCR过程中，由于一般的TaqDNA聚合酶的保真性较差，可能造成复制链的滑动而产生非特异性扩增，同时在最后一个循环退火时，非特异性条带、特异性条带及杂合子的等位基因间可能形成杂合链，当在PAGE胶上电泳时，会产生影子带，影响条带的判读，为了解决这个问题，一方面可以试图增加PCR反应的特异性，如在反应体系中加10％的甘油或10％二甲基亚砜，另一方面常常使用变性凝胶电泳以减少杂合条带的影响。为了得到较好的分离效果，本实验进行了变性胶和非变性胶的效果对比。3．1材料和方法20 上海海洋大学硕士学位论文3．1．1材料2008年12月由上海市水产技术推广站提供的凡纳滨对虾引进亲虾GO群体雌虾30尾，雄虾29尾，Gl群体雌虾38尾，雄虾39尾，G2群体雌虾36尾，雄虾27尾，三个群体总共199尾，保存于．80℃。3．1．2方法。3．1．2．1基因组DNA制备基因组DNA制备方法同第二章3．1．2．2PCR扩增参照FREITAS[721选用微卫星引物Lv07，由上海生工生物工程公司合成，PCR反应试剂购自Takara生物工程有限公司，其余试剂均购自上海生工生物工程公司。微卫星扩增采用TD．PCR，反应条件为：94。C预变性4min，前6个循环每2个循环退火温度降低20C至52。C，再进行28个循环。每个PCR循环包括94"C变性40s，52℃退火35s，72℃延伸40s，最后一个循环结束后72℃延伸8min，产物4"C保存。反应在EppendorfMastercyclergradientPCR扩增仪上进行，扩增体系为25uL，包括1×PCRbuffer，10pmol／gL的正反向引物，2mmol／LMgCl2，0．2mmol／LdNTP,1UTaq酶，80ng模板DNA。3．1．2．3聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(1)凝胶制备变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶均采用8％的浓度。非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制参照《精编分子生物学实验指南》，变性聚丙烯酰胺凝胶的配制参照《分子克隆实验指南》，具体配方如下：表3-28％凝胶组成Table3-2Ingredientsof8％gel8％1|变性聚丙烯酰胺凝胶配置8％变性聚丙烯酰胺凝胶配置试剂用量试剂用量5×TBE／mL20．O5×TBE／mL12．O29％丙烯酰胺／1％双丙烯酰胺／mL26．638％丙烯酰胺／2％双丙烯酰胺／mL12．0去离子水／mL52．6去离子水／mL约3510％过硫酸饺／mL0．710％过硫酸铵／mL0．6TEMED／mLO．1TEMED／mL0．06总体积／mL100尿素／超纯，g25．2总体积／mL60制胶步骤如下：21 上海海洋大学硕士学位论文①胶板清洗——将玻璃板、制胶梳子用洗洁精洗干净，用蒸馏水冲洗两遍，再用70％乙醇冲洗一遍，避免沾染灰尘，置室温晾干后组装胶板。②灌胶——按照表3．2中的比例配置好凝胶溶液后，倾斜胶板与水平约成10。角，立刻将凝胶混合液倒入制胶板间隙内，避免产生气泡，然后插上梳子，胶板放置水平，静置约30分钟，待凝胶完全凝固后，用注射器吸l×TBE冲洗胶孔，将未凝固的凝胶和多余的尿素冲出。(2)电泳将胶板置于电泳仪上，电泳缓冲液采用PH8．0的1×TBE，调节电压约6V／cm，预电泳30min，然后上样。①变性胶上样取PCR产物约6此，加3变性上样缓冲液(含95％去离子甲酰胺，购自上海生工生物有限公司)，混匀后置PCR仪96。C变性6min，迅速置于0*C冰水混合物中骤冷8rain，然后全部上样。②非变性凝胶上样取PCR产物约0．41,tL，加0．5pL的6×上样缓冲液(购自Takara生物有限公司)，混匀，直接上样。上样后调节电压至200V，电泳至二甲苯氰指示染料接近凝胶板底时停止电泳。(3)银染取下胶板，用刀片撬开胶板，参考关海涛等【73】按以下操作步骤进行：①固定液(10％乙醇+O．5％乙酸)固定10分钟，双蒸水漂洗两遍，每次30s。②0．2％硝酸银溶液染色10分钟，双蒸水漂洗两遍，每次30s。③加1．5％NaOH溶液500mL和200“L甲醛，40rpm速度下摇床上缓慢摇动至显色，双蒸水漂沈两遍，每次30s。④加0．75％Na2C03溶液300mL中止反应(4)拍照将凝胶置于Whitelighttransilluminator上，用CanonPowerShotA650IS数码相机拍照保存。3．2结果如图3．1所示，Lv07引物在GO中得到了较好的扩增，目的条带大小在200bp左右。变性胶的电泳图a,c，e，g和非变性胶的b,d，f,h相比较，产生了许多杂带，大小在300bp左右，远远大于目的条带，并且在目的条带附近的影子带浓度和目的22 上海海洋大学硕士学位论文条带浓度相差不大，和非变性胶的影子带相比浓度要大。而在非变性胶中，也有影子带的出现，但是影子条带较目的条带颜色浅，浓度低，易于分辨。一300bI,200bp100bo300bp200bp100bp300bp100bD300bP 上海海洋大学硕士学位论文h圈3-1变性聚丙蚌酰胺凝胶和聚丙烯晚胺凝胶电泳Figure3-IMetamorphicPAGEele∞trophoresisantiPAGEelectrophorcsis注：a,c，e、g分别是OO雌．OO雄，和Gl雌I#～30#，G2(雄)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳b,d，fh分别是G0雌．G0雄，’GI雌l#～30#'G2(雄)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳Notes：Picturesofa，c，eandgaremetamorphicPAGEelectrophoresisoffemales、malesofG0，sampleltosample30offemalesofGI，andmalesofG2respectively．Picturesofb,d，fandhamPAGEetectrophorealsoffemales、malesofGO，sampfeltosample300ffemalesofGl，andmalesofG2respectively3．3讨论关于变性凝胶电泳和非变性凝胶电泳的分离效果，本实验得到的结果和曲鲁江等【74I的结果不一致，这可能是因为本实验中变性胶上样量过大造成的。由于在PCR仪变性过程中上样液容易蒸发而发生体积变化，所以上样液浓度可能较未变性上样液大，但是小的上样量体积在操作方面易造成大的体积波动，而且当上样量少时条带较模糊，和杂带不易区分，因此上样量的多少应当引起注意。由图3-1可以看出，变性胶电泳条带整齐．平直，染色均匀，较非变性胶更加美观。由于变性凝胶中,6nA．Y尿素，在上样时胶孔中的尿素会对上样液的下沉造成阻碍，因此上样样本量过大时，如上几十个样时，需对后面要加样的胶孔重复冲洗出多余的尿素．这太大增加了工作量。同时，变性胶需要对dsDNA实施预变性；变性胶中加入了尿素．会减小DNA的迁移速度，一般情况下变性胶中二甲苯菁到达胶底部时需3个半小时，而非变性胶只需2个半小时：这些都增加了实验周期和工作量．『忻从电泳的结果来看，非变性胶的效果不比变性胶差，因此本实验选取非变性胶电泳作为微卫星标记的检钡怦段。为了减少非特性条带对读带造成的影响，首先应该筛选特异性较好的引物，24 上海海洋大学硕士学位论文在PCR时可以采用热启动的方法，结合降落PCR，优化好M92+浓度和退火温度等条件，在读带时，只要注意目的条带一般比杂带浓度要高，染色的颜色深，就可以很好地区别目的条带和杂带。25 上海海洋大学硕士学位论文第四章凡纳滨对虾的微卫星标记分析近年来对虾养殖的生态环境不断恶化，病害也日益突出【75】。鉴于目前还缺乏有效的治疗手段来控制虾病的发生，采用遗传育种技术培育性状优良的虾苗【76,77】是提高提高对虾生产的一个有效途径。但是，从国外引进的SPF种虾在选育过程中，虾苗随着世代的增加，往往会发生数量和质量上的下降，如个体差异增大，抗病能力下降，生长缓慢178J。ZhaoxiaLi等用AFLP研究中国对虾的人工选育的三个世代群体和野生群体的遗传结构时报道随着连续的人工选育，养殖群体的遗传多样性下降，遗传变异减小【7引。然而Chareontawee在研究罗氏沼虾时曾报道养殖的群体和野生群体相比有比与预期要高的遗传变异，推测遗传因素不是引起低产的原因，并推测引入外种可能会对地方种群的遗传融合有相反的作用16引。长期以来，近交衰退和遗传退化被养殖者和科学工作者认为是对虾生产下降的一个主要原因，然而在进行良种选育时，除了保持一定的有效群体大小避免近交衰退外，还应该注意控制交配体系的性别比例。本研究使用已经开发的8对多态性好的微卫星引物分析了部分当年凡纳滨对虾SPF国外引进群体和2006年引进亲虾繁育的第一代和第二代子虾群体的遗传变异情况，对选育过程中发生变异的原因作出了分析，希望对凡纳滨对虾的遗传育种工作提供有价值的参考。4．1材料与方法4．1．1实验材料2008年12月由上海市水产技术推广站提供的凡纳滨对虾引进群体GO雌虾30尾，雄虾29尾，2006年引进的亲虾选育的第一代群体(G1)雌虾38尾，雄虾39尾，第二代群体(G2)雌虾36尾，雄虾27尾，三个群体总共199尾，样本保存于-80"C。4．1-2实验方法4．1．2．1基因组DNA的提取基凶组DNA的提取同第二章。4．1．2．2微卫星扩增及检测引物参照FREITAS等f72】开发的8对微卫星引物和CRUZ[80】开发的5对微卫星引物，从中筛选出具有多态性的8对引物(表4．1)，由上海生工生物工程公司合成；26 上海海洋大学硕士学位论文PCR反应试剂购自Takara生物工程有限公司，其余试剂均购白上海生工生物工程公司。微卫星扩增采用TD．PCR，反应条件为：94"C预变性4min，前6个循环每2个循环退火温度降低2"C至最适退火温度，然后在最适退火温度条件下进行28个循环。每个PCR循环包括94*C变性40s，退火35s，72。C延伸40s，最后一个循环结束后72℃延伸8min，产物4"C保存。反应在EppendorfMastercyclergradientPCR扩增仪上进行，扩增体系为25此，包括1×PCRbuffer,10pmol／laL的正反向引物，2mmol／LMgCl2，0．2mmol／LmNTP,1UTaq酶，80ng模板DNA。PCR产物检使用经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，数码相机拍照保存。4．1．2．3数据统计分析电泳图谱使用BioRad公司的QuantityOne软件分析条带的片段大小，等位基因按照条带的片段大小用英文字母从A到Z命名，统计每个个体的基因型。用GENEPOP4．0软件计算以下参数：等位基因频率(Allelefrequency)，基因型频率(Genotypefrequency)，等位基因数nA(Numberofalleles)，有效等位基因数Ilc(Effectivenumberofalleles)，观测杂合度Ho(Observedheterozygosity)，期望杂合度He(Expectedheterozygosity)，F统计量【81](Wright’sF．statistics)和配对比较的Fst值。每个群体位点(共8个位点×3个群体)的哈迪．温伯格平衡(Hardy．Weinbergequilibrium，HWE)假设检验依据精确P值(ExactP．value)，计算采用马尔柯夫链法贝lJ(Markovchainrandomizationmethod)。配对观测杂合度比较通过二维列联表法采用Pearson)C2检验【82J，等位基因频率差异比较采用RXC联表法，以上两个数据处理使用SPSSl3．0统计学软件进行。Nei遗传距离和遗传相似性指数使用POPGENEl．32软件计算。多态信息含量(PIC)的计算根据Botstein的方法，部分参数的计算公式如下：／n、，，月一1n、(1)PIC=1一I∑尸f2|-l∑∑2p弼1831(4．1)＼l-l／＼、‘=1J=i+l／Pi、Pj分别为第f和第／个等位基因的频率，胛为等位基因数目。、jL．(2)H。-l一∑Xj2[541(4．2)Xi是某一基因座位第i个等位基因的频率，q是该座位的等位基因的数目(3)固定指数Fis，Fst，Fit1一F／t：(1一Fst)O—Fb)【541(4．3)Fit为所研究的个体成为同质的概率，Fst为从分群体中随机抽取的两个相同基因的同质概率，Fis为个体在分群体内仅起因于近亲交配而成为同质的接合的概率。27 上海海洋大学硕士学位论文表4．1微卫星引物序列及优化的退火温度Table4—1Sequencesofmicrosatelliteprimersandoptimalannealingtemperature 上海海洋大学硕士学位论文4．2结果4．2．1微卫星座位变异在8个微卫星座位GO，G1，G2三个群体中总共获得64个等位基因，每个座位的等位基因数在5～13个之间，平均每个座位获得8个等位基因(表4．2)。8个座位的多态信息含量在0．4052'--,0．8693之间，平均位点多态信息含量为0．6167，有2个座位(Lv06，Pv0013)／Jx于0．5，属于中度多态座位；其余6个座位多态信息含量大于0．5，为高度多态性位点，适合于多态性分析。表4-2各位点PCR扩增结果．Table4—2ResultsofPCRateachlOCUS位点locusLv01Lv06Lv07Lvl0Pv0013Pv0040Pvl758Pvl815Average共有43个等位基因在全部对虾中的频率小于10％，占等位基因总数的67％，说明以低频率等位基因为主是微卫星座位的共性。三个群体的等位基因频率分布见图4．1，等位基因频率在各群体间的差异性比较(表4．3)显示出群体间有显著的差异(除G1和G2在位点Pv0013外)。64个等位基因中，34个为三个群体共有，其中基因频率递增的有8个，递减的有9个(如Lv01的等位基因136，Lv06的等位基因213)，呈现增减反复的有17个(如Lv01的等位基因128，132)。如表4．5，三个群体的等位基因数nA(5．3～7．3)明显大于有效等位基因数rh(2．67"---3．36)。一般nA的大小与样本量呈正相关，本实验中G2和GO群体的llA比Gl小，这可能是因为GO和G2的样本量大小相当，而和Gl相比要小很多。由表4．4和表4．5知，8个座位总共有12个等位基因发生丢失，18个新等位基因产生，分别占等位基因总数的18％和28％。除了1815座位的等位基因132(基因频率为0．1389)足普通等位基因，其他丢失的或新出现的等位基因(基因频率在0．0025"--O．0829之间)在凡纳滨对虾群体中均为稀有等位基因(等位基因频率小于0．1)184,s5】。例如在座位Lv01，G2中两个等位基因(144，146)消失，而Gl和G2中出现新的等位基因126，这三个等位基因在全部凡纳滨对虾个体中的频率分别为0．0075，29 上海海洋大学硕士学位论文#$h⋯；：【0∞0100舯0∞1∞O∞0600400∞L州匾面圄川扯n～^L“山L一虬．姐dLn栅。k．～薹儿薹虬|i山蒌M260272285299303305307螂3123iT32l325328儿l125127瑚132l∞139l‘l图4-1等植基因额率Figute4-I．Allelesfrequencles30 上海海洋大学硕士学位论文0．0126和O．0729。然而，在座位Lv07，GO中的主要等位基因201(在GO中基因频率为0．2203)在Gl和G2中消失。在座位Pvl815；等位基因132在GO和G1中的基因频率分别为O．3305和O．1053，但在G2中消失。表4．3群体间基因频率的差异显著性比较Table4-3．Pairwisecomparisonofallelesfrequenciesthroughpopulations注：”表示极显著差异Notes：木木meanshighsignificantdifference表4—4．三个群体问等位基因的变化Table4-4．VariationoftheAllelesofthethreepopulations注：a农示等位基冈出现，d表示等位基因消失Notes：a’meansalleleappeared；d，meansalleledisappeared31 上海海洋大学硕士学位论文注：+}擎通罄因(等位基因频率人于0。1)Notes：’commonallele(allelefrequency>O．1、4．2．2群体|’日J遗传分化和哈迪一温伯格平衡一个群体的遗传变异范围通常由平均杂合度来度量，一般微卫星标记和其他标记相比，具有较高的杂合度。杂合度的变化(表4-6和图4．2)显示，8个位点的观测杂合度在0．0508"--0．6667之间，其中LvlO座位的杂合度最高，其余7个座位的杂合度不高，致使群体平均观测杂合度在0．1938～0．2325之间，G2群体的平均观测杂合度最高(Ho=O．2325)，GO和Gl的平均观测杂合度没有明显的差异。群体的平均期望杂合度在0．5450"-'0．6309之间，观测杂合度明显小于期望杂合度，说明三个群体均表现为杂合子不足。G2和G1相比在5个座位的观测杂合度减小，在3个座位的观测杂合度增加，平均杂合度G2较GO和G1有略微增加，但是变化不大。群体间的杂合度差异性比较(见表4．7)在位点Lv01，(32和Gl相比杂合度显著降低；在位点Lv06和Pv0013，G2较GO和G1杂合度显著升高，其它杂合度配对比较未显示出很大差异。32 上海海洋大学硕士学位论文表4-6．3个群体凡纳滨对虾的遗传变异Table4-6．GeneticvariabilitythroughthreepopulationsofLitopenaeusvannamei群体Population座位LocusLv01Lv06Lv07Lvl0Pv001Pv004Pvl75Pvl81Averag3085el18l18118118116110116118116．56571226566．12．731．333．367．751．991．952．844．123．260．15250．18640．05080．67800．08620．07270．10340．22030．19380．63900．24970．70870．87850．50060．49020．65380．76390．61060．76280．25510．92880．22970．82900．85280．84290．71330．6768<0．Ol}<0．01”<0．01+<0．Ol‘<0．01‘<0．01+