农杆菌介导海岛棉(gossypiumbarbadense linn.)遗传转化技术研究

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1、分类号：密级：学号：2010107046单位代码：10759石河子大学硕士学位论文农杆菌介导海岛棉（GossypiumbarbadenseLinn．）遗传转化技术研究学位申请人魏延宏指导教师张薇教授朱华国副教授研究方向生物技术在作物育种中的应用所在学院农学院中国·新疆·石河子二○一三年六月Agrobacterium-mediatedSea-islandcotton(GossypiumbarbadenseLinn.)GenetictransformationtechnologyresearchADissert

2、ationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByWeiYan-hong(CropGeneticsandBreeding)DissertationSupervisor:ProfessorZhangWeiViceProfessorZhuHua-guoJune,201356石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是

3、在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：魏延宏时间：2013年6月8日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要

4、汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：魏延宏时间：2013年6月8日导师签名：张薇时间：2013年6月8日摘要海岛棉是一种纤维品质极优的栽培棉，其产量占世界棉花总产量的3-8%，在棉花的生产及纺织工业中占有重要的地位。棉花的转基因报道大多数来源于陆地棉，而海岛棉的遗传转化研究在国内外报道较少，对海岛棉再生体系的建立及遗传转化条件的探索，有望建立一个高效的海岛棉转化体系。农杆菌介导法是应用最广泛，机理最清楚的基因转化方法，然而，目前农杆菌介导的海岛棉基因转化存在许多障碍，主要表现在海岛棉利用

5、体细胞胚胎发生途径获得再生植株难度很大，基因型的依赖性强、周期长、转化效率低等问题。因此探索一种不通过愈伤组织的脱分化，直接获得再生植株的组织培养技术，是目前海岛棉转化技术亟待解决的环节。通过农杆菌介导茎尖转化和利用农杆菌侵染花柱头法转化外源基因，其操作简单、省时省力、无基因型依赖性，是一种简单、快速、高效的遗传转化方法。目前，关于海岛棉在这方面的研究国内外报道较少。本研究以新疆自育的海岛棉为材料，研究丛生芽的诱导及农杆菌介导茎尖转化的影响因素；探讨农杆菌侵染花柱头法转化外源基因的有效途径，建立高效的海岛棉

6、再生和遗传转化体系，为利用基因工程技术改良海岛棉品种提供技术支持。将取得实验结果归纳如下：1：以新疆自育的4个海岛棉为材料，采用农杆菌侵染花柱头法，于开花后2h、6h、12h和24h进行外源基因的遗传转化，结果表明：4个品种和4个时间共处理3000朵花，收获378个铃，平均成铃率12.60%；934株转化植株通过田间卡那霉素初步筛选，共获得89株抗性植株，平均抗性率为9.87%；PCR检测得到17株转基因阳性植株，其阳性率为1.72%。2：以3个海岛棉品种的茎尖为外植体，通过不同激素的配比研究结果表明：6-

7、BA浓度为1.0mg/L的MSB(30g/L葡萄糖+2.5g/LPhytagel)丛生芽诱导培养基最有利于海岛棉丛生芽的诱导，诱导丛生芽率37-41%，诱导丛生芽数量为2-3个，质量好，有利于形成完整的再生植株。3：以海岛棉茎尖为受体材料，建立了农杆菌介导的海岛棉转化体系：以生长4天的无菌苗茎尖为外植体，农杆菌菌液浓度OD600为0.5时浸染10分钟，共培养48-72小时，移至卡那霉素浓度为150mg/L的选择培养基（MSB+1.0mg/L6-BA+150mg/LKm+400mg/LCef）进行筛选，25天

8、后转移到生根培养基（1/2MSB+20g/L葡萄糖+3.0g/LPhytagel+3.0mg/LIBA+0.3mg/LNAA+1.0g/L活性炭）培养，获得抗性苗；抗性苗长到3-5cm时驯化，嫁接或者直接盆栽，获得抗性植株。4：共获得抗性植株29株，通过PCR检测，其中21株为阳性株，从阳性株中随机取6株进行RT-PCR检测，其中5株为阳性株，初步证明抗除草剂基因EPSPS已导入海岛棉基因组中。关键词：海岛棉；再