刺参性腺基因表达谱构建与性腺发育相关基因筛选及验证

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1、谨以此文献给我尊敬的导师以及关心支持我的父母和朋友------------潘传燕刺参性腺基因表达谱构建与性腺发育相关基因筛选及验证学位论文答辩日期：年月日指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日--------

2、-------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（

3、保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月刺参性腺基因表达谱构建与性腺发育相关基因筛选及验证摘要刺参(Apostichopusjaponicus)，是目前我国单一海水养殖种类经济产值最高的无脊椎动物，具有较高的食用价值和养生保健作用，现在已经发展成为我国海水养殖的支柱产业之一。但刺参性别的非损伤鉴别仍是养殖过程中亟需解决的一大难题。性腺发育机制研究是进行繁育调控的基础，也为认识动物的性别决定机制提供理论依据。刺参特殊的进化地位和其性腺发育的规律性使其成为研究性腺发育的理想模型。本研究以刺参为研究对象，采用高通量转录组测序技术构建

4、刺参性腺基因表达谱，通过比较转录组学分析，从全基因角度筛选性腺发育调控主效基因或相关转录调节因子，并利用实时定量PCR技术解析相关基因的时间表达模式，利用常规PCR研究了相关基因的空间表达模式。主要结果如下：以处于性腺发育生长期的刺参性腺为材料，在454测序平台上利用平行标记测序技术在一次测序反应中同时完成刺参性腺的转录组测序，获得刺参雌、雄性腺基因表达谱。通过测序，共获得909332条序列，测序平均长度为418bp和443bp；对所测得序列进行拼装，共获得13544条contig和91508条singlereads，contig的平均长度为1280bp；基因预测共从13,201

5、个contigs和81,895个singlets中找到蛋白编码序列；对所获得的序列进行基因注释，共有23,506个预测蛋白可以注释出明确的生物学功能；并对所获得的序列进行了GO分析后共有9,329个预测蛋白，匹配62,338项GOterms；利用KEGG数据库进行代谢通路构建，共有3,178个蛋白获得了KOnumber。通过对比两个转录文库的基因表达丰度分析，在两个样本中找出表达有显著差异的基因共3318个，其中上调基因有1135个，下调基因有2734个。利用高通量测序结果筛选出1117个SSR位点和15266个SNP位点。其中SNP位点数大于40的基因序列共16条，位点数大于3

6、0的基因序列共29条。构建了刺参雌雄性腺基因表达谱，主要参与了结合功能、催化活性、蛋白结合、核酸结合、水解酶活性、转移酶活性等25项分子功能。各分子功能所含基因数目在刺参雌、雄性腺中有差异，其中差异最大的类群为结合蛋白（proteinbinding）。I结合基因的注释信息和基因表达丰度分析结果，在性腺表达谱中筛选到表达差异极显著且与性腺发育有关的差异表达基因25个，其中15个来自于雄性基因表达谱，分别标记为A1～A15，10个来自于雌性基因表达谱，分别标记为B1～B10，对这25个基因进行实时定量PCR引物设计并初步检测各引物的扩增效果，获得扩增效果良好的基因16个，其中来源于雄

7、性基因表达谱的基因11个，来源于雌性基因表达谱的基因5个。分别检测16个基因在生长期不同性别刺参性腺的表达，结果表明：除B4外，15个基因在不同性别刺参性腺发育生长期中的表达水平均有差异，其中从雄性性腺基因表达谱中筛选的11个基因在雄性性腺中的表达水平均高于雌性性腺，基因A1、A6、A10、A14在雄性性腺中的表达水平是雌性性腺的123～6000000倍；基因A3、A4、A5、A7、A8、A9、A13在雄性性腺中的表达水平是雌性性腺的4.38～650000倍；从雌性性腺基因表达谱