新型鸭呼肠孤病毒的鉴定及其全基因组序列解析

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1、AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateIdentificationandSequenceDeterminationofNovelDuckReovirusCandidate:ZhuYingqiSupervisor:Prof.LiuGuangqingCooperantSupervirsor:Prof.WangGuijunAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultureSpeciality:PreventiveVeterinaryScienceResearchfield

2、:InfectiousdiseasesofdomesticanimalsCollege:AnimalScienceandTechnologyCollegeJune,2013中文摘要2011年上半年，中国太湖流域的许多养鸭场陆续发生一种新的鸭病毒性传染病，临床主要表现为发病雏鸭精神萎靡，软脚，排白色稀粪，发病率约40%，病率在35%-40%以上，给养鸭业造成了较为严重的经济损失。为了分离该病的病原，我们从太湖发病鸭场采集发病鸭实质脏器，通过接种SPF鸡胚进行病毒分离。结果从鸡胚尿囊液中分离到一株病毒，经测定该病毒尿囊液的ELD5.550为10/0.2mL。将该病毒尿囊液感染

3、1日龄樱桃谷肉鸭可复制出与临床相同的症状，且可从发病鸭的脾脏和肝脏中分离到病毒，该结果表明我们分离到的病毒为造成这次疾病发生的病原。通过PCR、RT-PCR检测方法对该病毒进行检测，结果排除了所有常见的或者是具有地方流行特点的鸭病毒性传染病，包括鸭病毒性肠炎病毒、鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭细小病毒和番鸭呼肠孤病毒。为了确定该病毒的分类学地位，首先，我们通过病毒核酸类型的鉴定、有机溶剂敏感性试验和血凝性试验证明该病毒为RNA病毒、无囊膜、不具有鸡血红细胞凝集活性。然后，将病毒尿囊液经蔗糖密度梯度离心纯化进行电镜观察，发现该病毒粒子直径约70nm、呈球形、正二十面体

4、对称和双层衣壳结构，病毒具有典型的正呼肠孤病毒科成员的特性。最后，我们参考番鸭呼肠孤病毒（Muscovyduckreovirus,MDRV）89026株S2基因的部分序列设计合成了一对引物，对该病毒的核酸序列进行了测定，同时对该序列进行遗传进化分析，结果表明该病毒与2009年从福建分离到的新型鸭呼肠孤病毒(Duckreovirus，DRV)NP03株亲缘关系很近处在同一进化分支，而与番鸭呼肠孤病毒亲缘关系较远。至此，我们分离并鉴定出造成鸭群中这次疫病流行的病原为新型鸭源呼肠孤病毒。根据国际命名规则，将该病毒命名为新型鸭呼肠孤病毒太湖2011株（DRVTH11）。为了了解该

5、病毒的增殖特性，我们将病毒感染BHK-21细胞系，对其一步生长曲线进行了测定。研究表明DRVTH11株病毒可在BHK-21细胞系上增殖,出现细胞巨融合病变，通过WB、IFA方法均能在细胞内检测到该病毒的存在。一步生长曲线显示，该毒株感染BHK-21细胞后0-12h为潜伏期，12h后开始增殖，12-36h进入快速增殖期，48h病毒滴度即达到最高，TCID6.57/0.1mL，随后病毒的增殖随细胞50为10的崩解而降低。为了了解该病毒分子遗传信息，我们通过RT-PCR方法对病毒基因组进行扩增，成功获得覆盖DRVTH11株病毒全基因组的若干目的片段克隆。序列拼接后显示病毒基因组

6、全长为23,418bp，病毒基因组有十个基因片段组成，大小如下：L1,3958bp；L2,3829bp；L3,3907bp；M1,2283bp；M2,2158bp；M3,1996bp；S1,1568bp；S2,1326bp；S3,1202bp；S4,1191bp。与呼肠孤病毒科其他成员一样，该病毒每个基因片段在5'末I端和3'末端均存在保守序列，为5'-GCUUUUU和3'-UCAUC。其中除了S1节段含有三个ORF以外，每个节段只含有一个完整的ORF,所以推测病毒基因组至少编码12个蛋白。为了明确DRVTH11株病毒与其他禽源呼肠孤病毒之间的同源性关系，我们分别挑选了M

7、DRV代表株89026株和鸡源呼肠孤病毒（Avianorthoreovirus,ARV）代表株S1133株进行基因组同源性分析。结果显示，DRVTH11株病毒M1、M3、S2、S4基因片段与MDRV的核苷酸同源性较高为81.8%-87.8%，M2、S3基因片段同源性较低为68.5%和69.8%，S1基因片段同源性最低仅为34.4%；该病毒基因组与ARV的核苷酸同源性均较低为69.0%-79.2%，其中S1片段与ARV核苷酸同源性仅为46.3%。进一步分析发现，整个基因组中S1片段变异最显著：DRVTH11株病毒S1片段长为15