一株鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

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2、身少－＇－糸當＇＇。、－知；ｆ２２５００９指导教师姓名，：徐建生教授，扬州大学，江苏扬州９＊＂＾＇’？二申请学位级别＝硕壬学科专业名称＝预防兽医学论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：２０１５年６月学位授予单位：扬州＾学学位授予日期：２０１５年６月答辩委员会主席：郭爱珍教授‘＇：．．．感遠：＾＾遊；徐心乂＇＇＇、ｆ．部．Ｖ攤巧辕乂郑：尚錄＾一刘水芳：株蜡呼麻孤病毒的分离鉴定及全基因姐序列分析１＾中文摘要一近年来，江苏地区许多鶴养殖场陆续发现种感染维磯为主的Ｗ出血性坏死性肝炎为特征的病毒性传

3、染病。我们Ｗ发病體场采集患病鹤的实质性器官为病料，通过接种ＳＰＦ－，，通过ＰＣＲ鸡胚进行病毒的分离并结合临床症状和病理变化、ＲＴＰＣ民等分子生物学技术对病毒进行鉴定，确定为携呼肠孤病毒。暂时将本分离株命名为ＧＲＶＪＳ２０１２。为了确定该病毒的分类学地位，我们通过有机溶剂敏感试验，温度敏感试验，血凝试验等证明该病毒为ＲＮＡ病毒、不具有鸡血红细胞凝集特性，病毒对酸及氯仿不敏感，一定的抵抗力对膜蛋白酶敏感，对热有。然后将病毒液进行氯仿抽提、超高速差速离如及谎糖密度梯度处理来纯化病毒，经磯酸鹤负染色进行电镜观察，结果发现该病毒颗粒无囊膜、近似球形、直

4、径约为８０ｎｍ，具有双层衣壳结构，每层均为２０面体对称，具有典型的呼肠孤病毒属特性。－９Ｆ－ｔ我们将病毒液通过绒毛尿囊膜接种１１日龄的ＳＰ鸡胚，连续观察２６天，收集死鸡脏尿囊液及尿囊膜，依次接种至第３代。用第３代的尿囊液、化体及绒毛尿囊膜测定５＇６３３ＥＬＤｓｏ。结果测得尿囊液的化Ｄｓｏ为ｌ（Ｔ／〇．２ｍＬ，脏体及绒毛保囊膜对鸡胚的ＥＬＤｓｏ为５８３ｌ（ｒ／０．２ｍＬ，表明化体与绒毛尿囊膜的含毒量高于尿囊液。并将传代后的病毒尿囊液用于鸡胚成纤维细胞适应性试验，在原代鸡胚成纤维细胞上盲传５代，测定其ＴＣＩＤｓｏ，结果５＇７５表明该毒株病毒对ＣＥ

5、Ｆ的ＴＣＩＤｓｏ为ｌＣｒ／０．１ｍＬ。此外，动物致病性试验表明，本分离株可Ｗ致死１日龄维賴，死亡率为１００％，而对于青年猶及中年鹤不致病。然后，我们依据ＮＣＢＩ已经发表的猶呼肠孤病毒的基因序列，设计了３段引物。采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到３段目的片段表明与己经发表的，并对其序列进行测定分析，结果鸭呼肠孤病毒和携呼肠孤病毒亲缘性较近，通过单个基因的系统进化树分析显示，本分、％－９０％离株与参考株０３Ｇ株Ｊ１８株同源性高达８０，与标准株Ｓ１１３３同源性较低。由此可知，本分离株应该归属于禽正呼肠孤病毒属不同于鸡呼脑孤病毒分支的水禽呼肠孤病毒分支。

6、最后一，为了进步了解本分离株与ＡＲＶ、ＤＲＶ及ＧＲＶ之间的进化关系，我们对其３－ＰＣＲ进行全基因组序列分析。根据己发表的基因序列设计了１对引物，采用ＲＴ方法扩增得到目的片段，送至测序，对测序结果进行整理，并，分析其开放阅读框的大小及数目与呼肠孤病毒属的其他成员对比，绘制成基因进化树。结果表明ＧＲＶＪＳ２０１２株病毒全长？２扬州大学硕±学位论文２３，４１８ｂｐ，可分为大小不同的１０个片段，組成病毒的１０个片段大小如下：Ｓ１，Ｕ６８ｂｐ；Ｓ２，１３２６ｂｐ；Ｓ３，１２０２ｂｐ；Ｓ４，１１９１ｂｐ；Ｍｌ，２２８３ｂｐ；Ｍ２，

7、２１５８ｂｐ；Ｍ３，１９９６ｂｐ；ＬＩ，３％８ｂｐ；Ｌ２，３８２９ｂｐ；Ｌ３，３９０７ｂｐ。与ＡＲＶ其他毒株不同的是，ＧＲＶＪＳ２０１２的ｏＣ蛋白？’由Ｓ一Ｉ基因编码，而ＡＲＶ的ｃＣ由Ｓ４编码。本分离株与ＡＲＶ其他毒株样其５端和３’’５－ＧＣＵＵＵＵ－端都存在保守序列，分别是，３ＵＣＡＵＣ。同源性分析表明ＧＲＶ化２０１２毒８９－３Ｇ．７％９９。株相比．１％与鸭源呼肠孤病毒ＤＲＶＪ１８株与ＧＲＶ０，其核巧酸同源性高达－．４％９６．９％，其中ＷＬ１、Ｌ２、Ｍｌ及Ｓ２的基因基因序列的同源性达２０变异性